Separación de células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra

Resumen

Aquí, presentamos un método simple para separar células foliculares y ocitos en folículos ováricos de pez cebra, lo que facilitará las investigaciones del desarrollo ovárico en peces cebra.

Resumen

El pez cebra se ha convertido en un modelo ideal para estudiar el desarrollo ovárico de vertebrados. El folículo es la unidad básica del ovario, que consiste en ovocitos y células foliculares circundantes. Es vital separar tanto las células foliculares como los ocitos para diversos fines de investigación, tales como para el cultivo primario de células foliculares, análisis de la expresión génica, maduración de ocitos y fertilización in vitro, etc. El método convencional utiliza fórceps para separar ambos compartimentos, lo cual es laborioso, requiere mucho tiempo y tiene un alto daño al ócito. Aquí, hemos establecido un método simple para separar ambos compartimentos usando un capilar de vidrio tirado. Bajo un estereomicroscopio, los ócitos y las células foliculares se pueden separar fácilmente pipeteando en un capilar de vidrio fino tirado (el diámetro depende del diámetro del folículo). En comparación con el método convencional, este nuevo método tiene una alta eficiencia en la separación de ocitos y células foliculares y tiene un bajo daño a los ocitos. Más importante aún, este método se puede aplicar a los folículos en etapa temprana, incluso en la etapa previa a la vitellogénesis. Por lo tanto, este método simple se puede utilizar para separar las células foliculares y ocitos de pez cebra.

Introducción

El pez cebra es un organismo modelo importante para el estudio del desarrollo de vertebrados y la fisiología. El pez cebra puede servir como un buen modelo para estudiar los mecanismos moleculares del desarrollo ovárico^1,2,3. Muchas características del desarrollo ovárico se conservan mucho durante la evolución de los peces a los mamíferos^1,2. Al igual que los otros vertebrados, los adultos de pez cebra tienen ovarios asincrónicos, que contienen folículos ováricos de todas las etapas de desarrollo^4. El folículo es el elemento reproductivo fundamental del ovario. El folículo consiste en el ócito que está rodeado por una o varias capas de células somáticas llamadas células foliculares. El desarrollo de folículos depende de la comunicación bidireccional entre ócitos y células foliculares^5. Es vital separar las células foliculares y los ocitos de los folículos ováricos para diferentes propósitos de investigación como cultivo primario de células foliculares, análisis de expresión génica, maduración de ocitos y fertilización in vitro.

Los métodos de separación tradicionales incluyen separación mecánica por fórceps y digestión enzimática^6,7,8,9,10. Sin embargo, la separación mecánica por fórceps requiere mucho tiempo y es laboriosa. También causará el alto daño al ócito durante la separación. Aunque el método de digestión enzimática es fácil de operar y requiere un corto tiempo, el tiempo de tratamiento y la concentración enzimática deben ser validados, y la integridad y la tasa de supervivencia de los ocitos aislados no son ideales. Por lo tanto, hemos establecido un método simple para separar ambos compartimentos en diferentes etapas de desarrollo utilizando tubos capilares de vidrio tirado.

Protocolo

Todos los procedimientos realizados en experimentos de peces están de acuerdo con las regulaciones del Comité de Ética de Experimentación Animal de la Universidad Normal del Noroeste.

1. Preparativos

1. animales
   1. Utilice pez cebra hembra adulto con una longitud corporal de 4-6 cm.
      NOTA: Utilizamos peces cebra de un mercado local.
   2. Mantenga el pez cebra en un sistema de agua circulante con una luz de 14 h y un ciclo oscuro de 10 h a unos 28 °C.
   3. Alimentar a los peces dos veces al día con camarones de salmuera recién eclosionados.
2. Capilar de vidrio tirado
   1. Use un capilar de vidrio de 15 cm y coloque su cabeza en un quemador de alcohol para calentarlo. Sostenga un extremo de vidrio capilar a mano y sostenga el otro extremo con fórceps.
   2. Después de calentar 5-10 segundos, el vidrio en el fuego del quemador de alcohol se vuelve rojo y suave. Estirar la cabeza del capilar de vidrio con fórceps para hacer la abertura capilar con el diámetro requerido.
      NOTA: El diámetro depende de los diámetros del folículo: previtellogénicos (PV; aproximadamente 0,30 mm de diámetro), vitellogénico temprano (EV; de unos 0,40 mm de diámetro), midvitellogénico (MV; de unos 0,50 mm de diámetro), vitellogénico tardío (LV; de unos 0,60 mm de diámetro) y adulto completo pero inmaduro (FG; de unos 0,65 mm de diámetro).
   3. Estirar la abertura del capilar de vidrio hasta el diámetro adecuado, que es ligeramente menor del tamaño de folículos separados. El capilar de vidrio con una abertura mucho más grande que el tamaño de los folículos ováricos no puede realizar la separación, pero los mucho más pequeños romperían los folículos durante la separación. Practique el estiramiento del capilar de vidrio varias veces.
      NOTA: El tiempo de calentamiento depende del tamaño del capilar de vidrio. No estire directamente el capilar de vidrio en el fuego del quemador de alcohol. Romperá el capilar de vidrio.
   4. Corta el capilar de vidrio con un cortador de ampolla y rompe el capilar de vidrio con fórceps para obtener una incisión suave.
      NOTA: Una abertura afilada o rota del capilar de vidrio dañaría los folículos.
   5. Con un tubo de plástico de 30 cm, inserte una punta de pipeta de 1 ml con un elemento de filtro en un extremo, inserte el capilar de vidrio tirado al final de la pipeta y conecte una punta de pipeta de 200 μL en otro extremo.

2. Separación de ocitos de pez cebra y células foliculares en diferentes etapas

1. Disección del ovario de pez cebra
   1. Llene un cubo de hielo a 4/5 lleno de hielo de lodo y agregue suficiente agua de pescado para dejar flotar hielo de lodo. Espere 2-5 minutos, compruebe la temperatura del agua y asegúrese de que la temperatura esté entre 2-4 °C.
   2. Anestesia a las hembras adultas colocando peces en el agua helada durante al menos 2-5 minutos, hasta que los peces detengan el movimiento de las branquias. Decapitar a los peces cortando la médula espinal usando una tijera afilada para asegurar la muerte.
   3. Coloque el pez en la placa de disección con fórceps.
   4. Utilice tijeras diseccionantes para cortar de la siguiente manera. Diseccionar de la cloaca a las branquias a lo largo de la línea media del abdomen. Corte de la parte posterior de la cloaca. Corte de la punta anterior al lado dorsal. Retire suavemente la piel y los músculos de un lado del cuerpo. Exponga los órganos internos y saque todo el ovario con fórceps.
   5. Inmediatamente, coloque los ovarios suavemente en un plato de cultivo de 100 mm que contenga el medio L-15 (L-15) del 60% Leibovitz.
2. Aislamiento de folículos ováricos
   NOTA: El sistema de ensayo que hemos adoptado se basa en la definición original de Selman et al.⁴.
   1. Aísle manualmente folículos de diferentes etapas utilizando un par de fórceps finos como se describió anteriormente⁸.
   2. Agrupa los folículos ováricos en las siguientes etapas: etapas PV, EV, MV, LV y FG.
3. Separación de células foliculares y ócitos de folículos ováricos
   1. Ponga los folículos ováricos en diferentes etapas en una placa petri limpia que contenga un 60% de L-15 medio.
   2. Usando el capilar de vidrio tirado desde el paso 1.2, chupa los folículos en el capilar de vidrio de 2-3 cm y soplarlos.
      NOTA: Cuando el diámetro de apertura de los capilares de vidrio es apropiado, el folículo se puede separar del ócito por inhalación una vez.
      1. Si la capa celular folicular está unida firmemente al ócito, repita de 2 a 3 veces para lograr una separación completa. Evite múltiples intentos de forzar un folículo a través de un capilar más pequeño, lo que dañaría el folículo.
         NOTA: En el proceso de inhalación y soplado, la capa folicular se cae y se separa del ócito, y finalmente, las células foliculares y los ócitos denuded están separados (Figura 1).
   3. Alarga los ócitos denostados pero intactos y recoge los ócitos denostados sobrevivientes para más ensayos.
   4. Investigar si las células foliculares fueron separadas de folículos intactos, manchar los folículos intactos y separar los ócitos con 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI).
      1. Corrija las muestras en un 4% de paraformaldehído almacenado en búfer a temperatura ambiente (RT) durante 1 h. Lave varias veces por PBS.
      2. Mancha por DAPI en RT durante 30 min. Lavado varias veces con PBS. Ver y fotografiar con un microscopio de fluorescencia (por ejemplo, Leica DFC7000 T).
   5. Para confirmar la separación completada, fije los folículos intactos y los ócitos separados en un 4% de paraformaldehído almacenado en búfer durante la noche a 4 °C, e incruste el medio de congelación intissue (por ejemplo, Leica) a -25 °C.
      1. Corte los tejidos fijos en un microtome y colócelo en toboganes de vidrio.
      2. Lave las secciones en PBS y visualice los núcleos celulares con DAPI. Ver y fotografiar en un microscopio de fluorescencia.

3. Maduración in vitro (IVM) y fertilización in vitro (FIV)

NOTA: El procedimiento de IVM de FIV se siguió como se describió anteriormente con la modificación menor ^11,12,13.

1. Prepare un medio de maduración fresco (+DHP medio) antes de la disección del ovario de hembra adulta de pez cebra. Para preparar el medio de maduración fresco, agregue 9 ml del medio L-15 de Leibovitz, pH 9.0, a tubos cónicos de 15 ml. Añadir 10 μL de 17α-20β-dihidroxi-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/ml), 490 μL de dH₂O y 500 μL de albúmina sérica bovina (BSA) al 10%.
2. Prepare la solución y la solución E3 de Hank con antelación. Prepare la solución de Hanks, tal como la describen Baars et al.¹⁴. Preparar E3 medio: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl_2,0,33 mM MgSO_4,y 1-5% Azul metileno.
3. Realizar la disección del ovario de pez cebra y el aislamiento de folículos ováricos como en los pasos paso 2.
4. Colecciona folículos escénicos adultos completos y úsalos como ocitos inmaduros. Por cada pez cebra hembra adulto, al menos 150-200 folículos en etapas adultos pueden ser aislados. Seleccione los folículos intactos y saludables para IVM.
5. Incuba los folículos escénicos adultos en medio +DHP en placas de 12 pozos, comprobando periódicamente para asegurar que los ocitos permanezcan intactos. Retire los ocitos de limosna con una pipeta Pasteur.
   NOTA: Durante la maduración del ocito, los ocitos se volverán progresivamente translúcidos. La mayoría de los ocitos se vuelven translúcidos después del tratamiento de DHP durante 2 h. Esto se puede observar bajo un microscopio diseccionador con óptica de luz transmitida.
6. Retire las células foliculares más externas de cada ocito maduro como se describe en el paso 2.3.
7. Transfiera los ocitos denostados a una placa de Petri con unas gotas de medio de cultivo y proceda a la fertilización.
8. Preparar la solución de espermatozoides frescos utilizando testículos diseccionados de al menos tres machos en 500 μL de solución de Hanks. Ponga la solución de espermatozoides sobre hielo, donde puede mantener su potencia de fertilización hasta 2-3 h.
9. Añadir 100 μL de solución de espermatozoides a ócitos denostados y maduros en una placa de Petri. Agregue suavemente la solución de espermatozoides entre los óvulos, y arremolina los espermatozoides y los óvulos juntos usando una punta de pipeta.
10. Agregue inmediatamente 1 ml de solución mediana E3 para activar los óvulos y vuelva a arremolinar suavemente los óvulos y los espermatozoides con una punta de pipeta.
11. Después de alrededor de 1 minuto después de la fertilización (mpf), inunde la placa con solución mediana E3. La expansión completa de la coral se puede observar dentro de 10-15 mpf.
12. Entre 35-45 mpf, seleccione los embriones que están experimentando escote simétrico en la etapa de 2 células, y que por lo tanto son fertilizados. Retire los embriones que no estén sometidos a escote celular.
13. Permitir que los embriones se desarrollen en la placa de Petri a 28 °C, con un límite de 80 embriones por placa de 10 cm. Ver y fotografiar el desarrollo del embrión.

Resultados

Este método se puede utilizar para separar células foliculares y ocitos en diferentes etapas del desarrollo de folículos ováricos en peces cebra. La Figura 1 muestra la separación de ocitos de pez cebra y células foliculares de folículos ováricos utilizando un tubo de vidrio capilar(Figura 1). Para investigar si las células foliculares estaban separadas de los folículos intactos, los folículos intactos y los ócitos separados de diferentes etapas de l...

Discusión

Aquí describimos un método novedoso para la separación simple y rápida de células foliculares y ocitos de folículos ováricos de pez cebra. Este método tiene varias ventajas sobre el método convencional. Primaria entre ellos está la mayor facilidad de separación con alta eficiencia y eficacia, ya que sólo se requiere una manipulación única y externa. Este punto aumenta la aplicabilidad a los investigadores que no son buenos en anatomía microscópica. Según nuestra experiencia, uno puede separar con éxito ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α,20β-DHP	Cayman	16146-5 (5 mg)
24-well plate	Corning	3524
Ampoule cutter	AS ONE	5-124-22 1 bag (100 pieces)
Anhydrous Na2HPO4	Kaixin Chemical	500 g
Brine shrimp	Hongjie	250 g
CaCl2	Beichen Fangzheng	500 g
Culture dish	Biosharp	BS-90-D (10PCS/PK)
DAPI	Solarbio	S2110 (25mL)
Dissecting Microscope	ZEISS	Stemi 305
Dissection forcep	VETUS	HRC30
Dissection scissor	Kefu	160 mm
Fluorescence Stereomicroscope	Leica	M205C
Glass capillary	IWAKI	IK-PAS-5P (200 pcs/PACK)
Hoechst 33342	Solarbio	C0031 (1 mg)
KCl	Beichen Fangzheng	500 g
KH2PO4	Kaixin Chemical	500 g
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	41300-039 (10×1L)
MgSO4•7H2O	Beichen Fangzheng	500 g
Micropipette tips	Axygen	MCT-150-C
NaCl	Beichen Fangzheng	500 g
NaHCO3	Beichen Fangzheng	500 g
Penicilia-streptomycia	Gibco	#15140122 (100 mL)
Stereomicroscope	ZEISS	Discover.v20