Separação de células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish

Resumo

Aqui, apresentamos um método simples para separar células foliculares e oócitos em folículos ovarianos de zebrafish, o que facilitará investigações do desenvolvimento ovariano em zebrafish.

Resumo

O zebrafish tornou-se um modelo ideal para estudar o desenvolvimento ovariano de vertebrados. O folículo é a unidade básica do ovário, que consiste em oócitos e células foliculares circundantes. É vital separar células foliculares e oócitos para vários fins de pesquisa, como para a cultura primária das células foliculares, análise da expressão genética, maturação de oócitos e fertilização in vitro, etc. O método convencional usa fórceps para separar ambos os compartimentos, o que é trabalhoso, demorado e tem alto dano ao oócito. Aqui, estabelecemos um método simples para separar ambos os compartimentos usando um capilar de vidro puxado. Sob um estereótipo, oócitos e células foliculares podem ser facilmente separados por tubulação em um capilar de vidro fino puxado (o diâmetro depende do diâmetro do folículo). Comparado com o método convencional, este novo método tem alta eficiência na separação de oócitos e células foliculares e tem baixo dano aos oócitos. Mais importante, este método pode ser aplicado a folículos em estágio inicial, inclusive na fase pré-vitellogênese. Assim, este método simples pode ser usado para separar células foliculares e oócitos de zebrafish.

Introdução

O zebrafish é um dos principais organismos modelo para o estudo do desenvolvimento de vertebrados e fisiologia. O zebrafish pode servir como um bom modelo para estudar os mecanismos moleculares do desenvolvimento ovariano^1,2,3. Muitas características do desenvolvimento ovariano são muito conservadas durante a evolução de peixes para mamíferos^1,2. Semelhante aos outros vertebrados, os adultos de zebrafish têm ovários assíncronsos, contendo folículos ovarianos de todos os estágios de desenvolvimento⁴. O folículo é o elemento reprodutivo fundamental do ovário. O folículo consiste no oócito que é cercado por uma ou várias camadas de células somáticas chamadas células foliculares. O desenvolvimento de folículos depende da comunicação bidirecional entre oócitos e células foliculares⁵. É vital separar células foliculares e oócitos dos folículos ovarianos para diferentes propósitos de pesquisa, como cultura primária de células foliculares, análise de expressão genética, maturação de oócitos e fertilização in vitro.

Os métodos tradicionais de separação incluem separação mecânica por fórceps e digestão enzimática^6,7,8,9,10. No entanto, a separação mecânica por fórceps é demorada e trabalhosa. Também causará o alto dano ao oócito durante a separação. Embora o método de digestão da enzima seja simples de operar e exija um curto espaço de tempo, o tempo de tratamento e a concentração enzimática devem ser validados, e a taxa de integridade e sobrevivência dos oócitos isolados não são ideais. Por isso, estabelecemos um método simples para separar ambos os compartimentos em diferentes estágios de desenvolvimento usando tubos capilares de vidro puxados.

Protocolo

Todos os procedimentos realizados em experimentos com peixes estão de acordo com as normas do Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Normal do Noroeste.

1. Preparativos

1. Animais
   1. Use zebrafish fêmea adulta com um comprimento corporal de 4-6 cm.
      NOTA: Usamos zebrafish de um mercado local.
   2. Mantenha o zebrafish em um sistema de água circulado com uma luz de 14 horas e ciclo escuro de 10h a cerca de 28 °C.
   3. Alimente os peixes duas vezes por dia com camarão de salmoura recém-eclodido.
2. Capilar de vidro puxado
   1. Use um capilar de vidro de 15 cm e coloque sua cabeça em um queimador de álcool para aquecê-lo. Segure uma extremidade de vidro capilar à mão e segure a outra extremidade com fórceps.
   2. Após o aquecimento de 5 a 10 segundos, o vidro no fogo do queimador de álcool fica vermelho e macio. Estique a cabeça do capilar de vidro com fórceps para fazer a abertura capilar com diâmetro necessário.
      NOTA: O diâmetro depende dos diâmetros do folículo: previtellogênico (PV; cerca de 0,30 mm de diâmetro), vitellogenic precoce (EV; cerca de 0,40 mm de diâmetro), midvitellogenic (MV; cerca de 0,50 mm de diâmetro), vitellogenic tardio (LV; cerca de 0,60 mm de diâmetro) e adulto completo, mas imaturo (FG; cerca de 0,65 mm de diâmetro).
   3. Estique a abertura do capilar de vidro até o diâmetro apropriado, que é ligeiramente menor do tamanho de folículos separados. O capilar de vidro com uma abertura muito maior do que o tamanho dos folículos ovarianos não pode realizar a separação, mas os muito menores quebrariam os folículos durante a separação. Pratique o alongamento do capilar de vidro várias vezes.
      NOTA: O tempo de aquecimento depende do tamanho do capilar de vidro. Não estique diretamente o capilar de vidro no fogo do queimador de álcool. Vai quebrar o capilar de vidro.
   4. Corte o capilar de vidro com um cortador de ampola e quebre o capilar de vidro com fórceps para obter uma incisão lisa.
      NOTA: Uma abertura afiada ou quebrada do capilar de vidro danificaria os folículos.
   5. Usando um tubo de plástico de 30 cm, insira uma ponta de pipeta de 1 mL com um elemento filtro em uma extremidade, insira o capilar de vidro puxado na extremidade da pipeta e conecte uma ponta de pipeta de 200 μL em outra extremidade.

2. Separação de oócitos de zebrafish e células foliculares em diferentes estágios

1. Dissecção do ovário de zebrafish
   1. Encha um balde de gelo até 4/5 cheio com gelo de chorume e adicione água suficiente para deixar o gelo de chorume flutuar. Espere de 2 a 5 minutos, verifique a temperatura da água e certifique-se de que a temperatura está entre 2-4 °C.
   2. Anestesia as fêmeas adultas colocando peixes na água gelada por pelo menos 2-5 minutos, até que os peixes parem o movimento da brânquia. Decapite o peixe cortando a medula espinhal usando uma tesoura afiada para garantir a morte.
   3. Coloque o peixe na placa de dissecação com fórceps.
   4. Use a tesoura dissecando para cortar da seguinte forma. Disseca da cloaca até as brânquias ao longo da linha média do abdômen. Corte da parte de trás da cloaca. Corte da ponta anterior para o lado dorsal. Remova suavemente a pele e os músculos de um lado do corpo. Exponha os órgãos internos e tire todo o ovário com fórceps.
   5. Imediatamente, coloque os ovários suavemente em um prato de cultura de 100 mm contendo 60% do meio L-15 (L-15) de Leibovitz de 60%.
2. Isolamento dos folículos ovarianos
   NOTA: O sistema de encenação que adotamos baseia-se na definição original de Selman et al.⁴.
   1. Isolar manualmente folículos de diferentes estágios usando um par de fórceps finos como descrito anteriormente⁸.
   2. Agrupar os folículos ovarianos nas seguintes etapas: estágios PV, EV, MV, LV e FG.
3. Separação de células foliculares e oócito dos folículos ovarianos
   1. Coloque os folículos ovarianos em diferentes estágios em uma placa de Petri limpa contendo 60% de meio L-15.
   2. Usando o capilar de vidro puxado do passo 1.2, chupe os folículos no capilar de vidro de 2-3 cm e exploda-os.
      NOTA: Quando o diâmetro de abertura dos capilares de vidro é apropriado, o folículo pode ser separado do oócito por inalação uma vez.
      1. Se a camada de célula folicular estiver presa firmemente ao oócito, repita 2-3 vezes para realizar uma separação completa. Evite múltiplas tentativas de forçar um folículo através de um capilar menor, o que danificaria o folículo.
         NOTA: No processo de inalação e sopro, a camada folicular cai e se separa do oócito, e, finalmente, células foliculares e oócitos desnudados são separados(Figura 1).
   3. Junte os oócitos desnudos, mas intactos, e colete os oócitos desnudados sobreviventes para mais ensaios.
   4. Para investigar se as células foliculares foram separadas dos folículos intactos, manchar os folículos intactos e osócitos separados com 4',6-diamidino-2-fenilôndole (DAPI).
      1. Fixar as amostras em paraformaldeído tampão de 4% à temperatura ambiente (TR) por 1 h. Lave várias vezes pela PBS.
      2. Mancha por DAPI em RT por 30 min. Lavado várias vezes com PBS. Ver e fotografar com um microscópio de fluorescência (por exemplo, Leica DFC7000 T).
   5. Para confirmar a separação completa, fixar os folículos intactos e oócitos separados em paraformaldeído tamponado de 4% durante a noite a 4 °C, e incorporar meio de congelamento de intissue (por exemplo, Leica) a -25 °C.
      1. Corte os tecidos fixos em um microtómeo e monte em lâminas de vidro.
      2. Lave as seções em PBS e visualize os núcleos celulares com DAPI. Ver e fotografar em um microscópio de fluorescência.

3. Maturação in vitro (IVM) e fertilização in vitro (FIV)

NOTA: O procedimento de IVM de FIV foi seguido como descrito anteriormente com pequena modificação ^11,12,13.

1. Prepare o meio de maturação fresco (+meio DHP) antes da dissecção do ovário da fêmea de zebrafish adulto. Para preparar o meio de maturação fresco, adicione 9 mL do meio L-15 de Leibovitz, pH 9.0, a tubos cônicos de 15 mL. Adicione 10 μL de 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-one (DHP) (5 mg/mL), 490 μL de dH₂O, e 500 μL de 10% de albumina de soro bovino (BSA).
2. Prepare a solução de Hank e a solução E3 com antecedência. Prepare a solução de Hanks, conforme descrito por Baars et al.¹⁴. Prepare E3 médio: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl₂, 0,33 mM MgSO₄e 1-5% Azul de Metileno.
3. Realizar dissecção do ovário de zebrafish e isolamento de folículos ovarianos como nas etapas passo 2.
4. Colete folículos de estágio adulto completo e use como oócitos imaturos. Para cada zebrafish fêmea adulta, pelo menos 150-200 folículos de estágio adulto podem ser isolados. Selecione os folículos intactos e saudáveis para IVM.
5. Incubar os folículos de estágio completo em média +DHP em placas de 12 poços, verificando periodicamente para garantir que os oócitos permaneçam intactos. Remova os oócitos de lise com uma pipeta Pasteur.
   NOTA: Durante a maturação do oócito, os oócitos se tornarão progressivamente translúcidos. A maioria dos oócitos tornam-se translúcidos após o tratamento de DHP por 2 h. Isso pode ser observado sob um microscópio dissecando com óptica de luz transmitida.
6. Remova as células foliculares mais externas de cada oócito amadurecido, conforme descrito na etapa 2.3.
7. Transfira os oócitos desnudos para uma placa de Petri com algumas gotas de cultura média e prossiga para fertilização.
8. Prepare a solução de esperma fresco usando testículos dissecados de pelo menos três machos em 500 μL da solução de Hanks. Coloque a solução de esperma no gelo, onde pode manter sua potência de fertilização por até 2-3 h.
9. Adicione 100 μL de solução de esperma para oócitos desnudados e maduros em uma placa de Petri. Adicione suavemente a solução de esperma entre os óvulos, e gire o esperma e os óvulos juntos usando uma ponta de pipeta.
10. Adicione imediatamente 1 mL de solução média E3 para ativar os óvulos e novamente redemoinho suavemente de óvulos e esperma usando uma ponta de pipeta.
11. Após cerca de 1 minuto após a fertilização (mpf), alagam a placa com solução média E3. A expansão completa do acorde pode ser observada dentro de 10-15 mpf.
12. Entre 35-45 mpf, selecione os embriões que estão submetidos ao decote simétrico no estágio de 2 células e, portanto, fertilizados. Remova embriões que não estão submetidos ao decote celular.
13. Permita que os embriões se desenvolvam na placa de Petri a 28 °C, com um limite de 80 embriões por placa de 10 cm. Veja e fotografe o desenvolvimento do embrião.

Resultados

Este método pode ser usado para separar células foliculares e oócitos em diferentes estágios do desenvolvimento do folículo ovariano em zebrafish. A Figura 1 mostra a separação de oócitos de zebrafish e células foliculares dos folículos ovarianos usando um tubo de vidro capilar(Figura 1). Para investigar se as células foliculares foram separadas dos folículos intactos, os folículos intactos e osócitos separados de diferentes estágios dos folículo...

Discussão

Descrevemos aqui um novo método para a simples e rápida separação de células foliculares e oócitos dos folículos ovarianos de zebrafish. Este método tem várias vantagens em relação ao método convencional. Entre elas, a maior facilidade de separação com alta eficiência e eficácia, pois apenas uma única manipulação externa é necessária. Este ponto aumenta a aplicabilidade para pesquisadores que não são bons em anatomia microscópica. De acordo com nossa experiência, pode-se separar com sucesso célu...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
17α,20β-DHP	Cayman	16146-5 (5 mg)
24-well plate	Corning	3524
Ampoule cutter	AS ONE	5-124-22 1 bag (100 pieces)
Anhydrous Na2HPO4	Kaixin Chemical	500 g
Brine shrimp	Hongjie	250 g
CaCl2	Beichen Fangzheng	500 g
Culture dish	Biosharp	BS-90-D (10PCS/PK)
DAPI	Solarbio	S2110 (25mL)
Dissecting Microscope	ZEISS	Stemi 305
Dissection forcep	VETUS	HRC30
Dissection scissor	Kefu	160 mm
Fluorescence Stereomicroscope	Leica	M205C
Glass capillary	IWAKI	IK-PAS-5P (200 pcs/PACK)
Hoechst 33342	Solarbio	C0031 (1 mg)
KCl	Beichen Fangzheng	500 g
KH2PO4	Kaixin Chemical	500 g
Leibovitz’s L-15 medium	Gibco	41300-039 (10×1L)
MgSO4•7H2O	Beichen Fangzheng	500 g
Micropipette tips	Axygen	MCT-150-C
NaCl	Beichen Fangzheng	500 g
NaHCO3	Beichen Fangzheng	500 g
Penicilia-streptomycia	Gibco	#15140122 (100 mL)
Stereomicroscope	ZEISS	Discover.v20