A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
כאן, אנו מתארים את ההכנה של מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן באורגנואידים אנושיים לחקר תפקוד מחסום המעיים, חדירות והובלה. מכיוון שאורגנואידים מייצגים את התגובה המקורית של רקמת האפיתל לגירויים חיצוניים, מודלים אלה משלבים את היתרונות של יכולת ההרחבה של קווי התאים ואת הרלוונטיות והמורכבות של הרקמה הראשונית.
בעבר, מערכות מודל אפיתל מעיים היו מוגבלות לקווי תאים שעברו טרנספורמציה ולרקמות ראשוניות. למערכות מודל אלה יש מגבלות אינהרנטיות שכן הראשונות אינן מייצגות נאמנה פיזיולוגיה של רקמות מקוריות, וזמינותן של האחרונות מוגבלת. לפיכך, היישום שלהם מעכב מחקר בסיסי ופיתוח תרופות. אורגנואידים בוגרים המבוססים על תאי גזע (המכונים מעתה אורגנואידים) הם מיניאטורות של רקמת אפיתל תקינה או חולה שממנה הם נגזרים. ניתן לבסס אותם ביעילות רבה מאזורים שונים במערכת העיכול (GI), להיות בעלי יכולת הרחבה ארוכת טווח ולדמות תגובות ספציפיות לרקמות ולמטופלים לטיפולים במבחנה. כאן, הודגם כי הקמת מונו-שכבות אפיתל שמקורן באורגנואידים במעיים יחד עם שיטות למדידת שלמות מחסום אפיתל, חדירות והובלה, הפרשת חלבונים אנטי-מיקרוביאלית, כמו גם היסטולוגיה. יתר על כן, מונו-שכבות שמקורן באורגנואידים במעיים יכולות להיות מועשרות בתאי גזע מתרבים ומגבירי מעבר, כמו גם עם תאי אפיתל ממוינים מרכזיים. לכן, הם מייצגים מערכת מודל שניתן להתאים אותה כדי לחקור את ההשפעות של תרכובות על תאי המטרה ואת אופן הפעולה שלהם. למרות שתרביות אורגנואידים הן מבחינה טכנית תובעניות יותר מקווי תאים, לאחר שהן נוצרות, הן יכולות להפחית כשלים בשלבים מאוחרים יותר של פיתוח תרופות מכיוון שהן באמת מייצגות מורכבות אפיתל in vivo והטרוגניות בין-אשפוזית.
אפיתל המעיים פועל כמחסום פיזי בין התוכן הזוהר של המעיים לבין הרקמה הבסיסית. מחסום זה מורכב משכבת אפיתל אחת של אנטרוציטים ספיגה בעיקר המחוברים על ידי צמתים הדוקים, היוצרים קשרים בין-תאיים חזקים בין תאים סמוכים. תאים אלה יוצרים רירית אפיתל מקוטבת המפרידה בין הצדדים האפיקליים (לומן) והבזולטרליים של המעי, ובמקביל מווסתת את ההובלה הפרא-תאית של חומרים מזינים ומטבוליטים מעוכלים. בנוסף לאנטרוציטים, תאי אפיתל חשובים אחרים כגון גביע, פאנת' ותאים אנטרואנדוקריניים תורמים גם הם להומאוסטזיס של המעיים על ידי ייצור ריר, פפטידים אנטי-מיקרוביאליים והורמונים, בהתאמה. אפיתל המעיים מתחדש כל הזמן על ידי חלוקת תאי גזע מצומדים לקולטן 5-חיובי (LGR5+) עשירים בלאוצין המכילים לאוצין המכילים חלבון G (LGR5+) בתחתית קריפטות המעיים המייצרים תאים מגבירי מעבר (TA) הנודדים כלפי מעלה ומתמיינים לסוגי תאים אחרים1. הפרעה להומאוסטזיס של אפיתל המעיים על ידי גורמים גנטיים וסביבתיים, כגון חשיפה לאלרגנים במזון, תרכובות רפואיות ופתוגנים מיקרוביאליים, מובילה להפרעה בתפקוד מחסום המעיים. מצבים אלה גורמים למספר מחלות מעיים, כולל מחלות מעי דלקתיות (IBD), צליאק ורעילות מערכת העיכול הנגרמת על ידי תרופות2.
מחקרים על אפיתל המעיים מבוצעים באמצעות מספר מערכות פלטפורמה במבחנה כגון תוספות ממברנה, מערכות איברים על שבב, תאי Ussing וטבעות מעיים. פלטפורמות אלה מתאימות לביסוס חד-שכבתיות אפיתל מקוטבות עם גישה הן לצדדים האפיים והן לצדדים הבזולטרליים של הממברנה, תוך שימוש בקווי תאים שעברו טרנספורמציה או ברקמה ראשונית כמודלים. אף על פי שקווי תאים שעברו טרנספורמציה, כגון קווי תאי קרצינומה של המעי הגס (אדנו) Caco-2, T84 ו- HT-29, מסוגלים להתמיין לאנטרוציטים מקוטבים במעיים או לתאים המייצרים ריר במידה מסוימת, הם אינם מייצגים את האפיתל in vivo מכיוון שחסרים מספר סוגי תאים, וקולטנים ומובילים שונים מבוטאים באופן חריג3 . בנוסף, מכיוון שקווי תאים נגזרים מתורם יחיד, הם אינם מייצגים הטרוגניות בין-אשפוזית וסובלים מירידה במורכבות וברלוונטיות הפיזיולוגית. אף על פי שרקמות ראשוניות המשמשות בתאי Ussing וכטבעות מעיים מייצגות יותר את מצב ה- in vivo, הזמינות המוגבלת שלהן, הכדאיות לטווח הקצר וחוסר יכולת ההרחבה שלהן הופכים אותן לבלתי מתאימות כמדיום למחקרי תפוקה גבוהה (HT).
אורגנואידים הם תרביות אפיתל במבחנה הנוצרות מאיברים שונים כגון המעי, הכליה, הכבד, הלבלב והריאות. הם הוכחו כבעלי יכולת הרחבה ארוכת טווח ויציבה כמו גם יציבות גנטית ופנוטיפית ולכן הם מיניאטורות ביולוגיות מייצגות של האפיתל של האיבר המקורי עם תגובות נאמנות לגירויים חיצוניים 4,5,6,7,8,9. אורגנואידים מבוססים ביעילות מרקמות תקינים, חולים, מודלקים או סרטניים שנכרתו או שעברו ביופסיה, המייצגים תגובות הטרוגניות ספציפיות לחולה 10,11,12,13,14,15,16. מאמר זה מדגים כיצד לבסס מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן בתרביות אורגנואידים. מונו-שכבות הוקמו בהצלחה מתרביות אורגנואידים במעיים קטנים כמו גם מתרביות אורגנואידים במעי הגס ובפי הטבעת. מודל זה יוצר הזדמנות לחקור את ההובלה והחדירות של תאי האפיתל לתרופות, כמו גם את ההשפעות הטוקסיקולוגיות שלהם על האפיתל. יתר על כן, המודל מאפשר לתרבית משותפת עם תאי חיסון וחיידקים לחקור את האינטראקציות שלהם עם אפיתלהמעיים 17,18,19. יתר על כן, מודל זה יכול לשמש כדי לחקור תגובות לטיפולים באופן ספציפי למטופל וליזום מאמצי סינון כדי לחפש את הגל הבא של טיפולים ממוקדי מחסום אפיתל. גישה כזו יכולה להיות מורחבת למרפאה ולסלול את הדרך לטיפולים מותאמים אישית.
למרות שמונולי האפיתל בפרוטוקול זה מוכנים מאורגנואידים במעיים רגילים אנושיים, ניתן ליישם את הפרוטוקול ולהתאים אותו למודלים אורגנואידיים אחרים. מונו-שכבות אורגנואידיות אפיתל עוברות תרבית במדיום התפשטות אורגנואידי במעיים המכיל Wnt כדי לתמוך בשגשוג תאי גזע ולייצג את הרכב תאי המעיים. ניתן להעשיר את האורגנואידים במעיים כך שיהיו להם גורלות אפיתל מעיים שונים, כגון אנטרוציטים, פאנת', גביע ותאים אנטרואנדוקריניים, על ידי ויסות מסלולי Wnt, Notch וגורם גדילה אפידרמלי (EGF). כאן, לאחר הקמתם של חד-שכבתיים במדיום התפשטות, הם מונעים לעבר תאי אפיתל מעיים ממוינים יותר, כפי שתואר קודם לכן 20,21,22,23,24,25. למטרות הקרנה, בהתאם לאופן הפעולה של תרכובת העניין, תאי המטרה שלה ותנאי הניסוי, ניתן להניע את החד-שכבתיים לכיוון ההרכב התאי המועדף כדי למדוד את ההשפעות של התרכובת באמצעות קריאות פונקציונליות רלוונטיות.
1. הכנת ריאגנטים לתרבות
הערה: בצע את כל השלבים בתוך ארון בטיחות ביולוגית ופעל לפי ההנחיות הסטנדרטיות לעבודה עם תרביות תאים. אור אולטרה סגול משמש במשך 10 דקות לפני הפעלת ארון הבטיחות הביולוגית. לפני ואחרי השימוש, פני השטח של ארון הבטיחות הביולוגית מנוקים עם נייר טישו ספוג 70% אתנול. כדי להקל על היווצרות של טיפות תלת מימדיות של מטריצה חוץ-תאית (ECM), שמור על מלאי מוכן מראש של לוחות 96, 24 ו-6 בארות מוכנים באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.
2. תרביות אורגנואידיות
3. הכנת חד-שכבת אפיתל
4. קריאות בדיקה חד-שכבתיות אפיתליאליות
5. שדרוג ללוחות 96 באר המכילים תוספות ממברנה
הערה: הכינו חד-שכבתיים אפיתליאליים להקרנות תרופות בתפוקה גבוהה יותר או למספר מצבים בינוניים באמצעות צלחות HTS 96-well המכילות תוספות ממברנה.
איור 1A מראה תמונה מייצגת של אורגנואידים במעיים לאחר שהפשירו אותם מקריוביאל. חשוב להפשיר אורגנואידים בצפיפות גבוהה כדי להבטיח התאוששות אופטימלית. האורגנואידים מצופים בלוחות של 24 או 6 בארות בכיפות ECM של כ-10 מיקרול' (איור 1B). לרוב האורגנואידים הנורמליים במעיים...
פרוטוקול זה מתאר את המניפולציה הכללית והתחזוקה של אורגנואידים במעיים, כמו גם את ההכנה והיישומים האפשריים של מונו-שכבות אפיתל שמקורן באורגנואידים אלה. עד כה, מונו-שכבות הוכנו בהצלחה מהתריסריון, האילאום ואזורים שונים של אורגנואידים במעי הגס שמקורם ברקמת מעיים רגילה כמו גם בעבר ובאופן פעיל ...
המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.
עבודה זו נתמכת על ידי Topsector מדעי החיים והבריאות - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ הולנד (LSH-TKI) שותפויות ציבוריות-פרטיות (PPP) של מגזר LSH ההולנדי עם מספר פרויקט LSHM16021 Organoids ככלי חדשני למידול טוקסיקולוגיה לטכנולוגיית האורגנואידים של Hubrecht (HUB) ומימון פנימי של HUB למחלקת מידול מחלות וטוקסיקולוגיה. אנו מודים למעבדות של סבין מידנדורפ (המחלקה לגסטרואנטרולוגיה של ילדים, בית החולים לילדים וילהלמינה, UMC, אוטרכט) והוגו ר' דה יונגה ומרסל J.C. Bijvelds (המחלקה לגסטרואנטרולוגיה והפטולוגיה, ארסמוס MC, רוטרדם) על מתן תמיכה טכנית ראשונית להקמת מונו-שכבות על תוספות ממברנה.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | |
24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | |
40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell dissociation reagent 2 |
Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CO2 incubator | PHCBI | ||
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
Glass pipettes | Volac | ||
GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
Microtome | Leica | ||
MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
Plate shaker | Panasonic | ||
PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent 1 |
Water bath | Grant | ||
Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved