Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Method Article
Здесь мы описываем подготовку органоидных монослоев кишечного эпителия человека для изучения кишечной барьерной функции, проницаемости и транспорта. Поскольку органоиды представляют собой оригинальный ответ эпителиальной ткани на внешние раздражители, эти модели сочетают в себе преимущества расширяемости клеточных линий и актуальность и сложность первичной ткани.
В прошлом модельные системы эпителия кишечника были ограничены трансформированными клеточными линиями и первичной тканью. Эти модельные системы имеют присущие им ограничения, поскольку первые не точно представляют первоначальную физиологию тканей, а доступность последних ограничена. Следовательно, их применение препятствует фундаментальным исследованиям и исследованиям в области разработки лекарств. Органоиды на основе взрослых стволовых клеток (отныне называемые органоидами) представляют собой миниатюры нормальной или больной эпителиальной ткани, из которой они получены. Они могут быть установлены очень эффективно из различных областей желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), имеют долгосрочную расширяемость и имитируют специфические для тканей и пациента реакции на лечение in vitro. Здесь было продемонстрировано создание эпителиальных монослоев кишечного органоидного происхождения наряду с методами измерения целостности эпителиального барьера, проницаемости и транспорта, секреции антимикробного белка, а также гистологии. Кроме того, монослои кишечного органоидного происхождения могут быть обогащены пролиферирующими стволовыми и транзит-амплифицирующими клетками, а также ключевыми дифференцированными эпителиальными клетками. Поэтому они представляют собой модельную систему, которая может быть адаптирована для изучения воздействия соединений на клетки-мишени и способ их действия. Хотя органоидные культуры технически более требовательны, чем клеточные линии, после их создания они могут уменьшить сбои на более поздних стадиях разработки лекарств, поскольку они действительно представляют сложность эпителия in vivo и межпациентную гетерогенность.
Эпителий кишечника действует как физический барьер между просветным содержимым кишечника и подлежащей тканью. Этот барьер содержит единый эпителиальный слой преимущественно абсорбирующих энтероцитов, которые соединены плотными соединениями, которые устанавливают прочные межклеточные связи между соседними клетками. Эти клетки образуют поляризованную эпителиальную оболочку, которая разделяет апикальную (просветную) и базолатеральную стороны кишечника, одновременно регулируя параклеточный транспорт переваренных питательных веществ и метаболитов. В дополнение к энтероцитам, другие важные эпителиальные клетки, такие как бокал, панет и энтероэндокринные клетки, также способствуют кишечному гомеостазу, производя слизь, антимикробные пептиды и гормоны соответственно. Кишечный эпителий постоянно пополняется путем деления богатых лейцином повторно содержащих G-белок 5-положительных рецепторных (LGR5+) стволовых клеток в нижней части кишечных крипт, продуцирующих транзитно-амплифицирующие (ТА) клетки, которые мигрируют вверх и дифференцируются в другие типы клеток1. Нарушение гомеостаза кишечного эпителия генетическими и экологическими факторами, такими как воздействие пищевых аллергенов, лекарственных соединений и микробных патогенов, приводит к нарушению барьерной функции кишечника. Эти состояния вызывают несколько кишечных заболеваний, включая воспалительное заболевание кишечника (ВЗК), целиакию и лекарственную токсичность ЖКТ2.
Исследования кишечного эпителия проводятся с использованием нескольких платформенных систем in vitro, таких как мембранные вставки, системы органов на чипе, камеры Ussing и кишечные кольца. Эти платформы подходят для создания поляризованных эпителиальных монослоев с доступом как к апикальной, так и к базолатеральной сторонам мембраны, используя в качестве моделей трансформированные клеточные линии или первичную ткань. Хотя трансформированные клеточные линии, такие как клеточные линии колоректальной (адено)карциномы Caco-2, T84 и HT-29, способны в некоторой степени дифференцироваться в поляризованные энтероциты кишечника или клетки, продуцирующие слизь, они не являются репрезентативными для эпителия in vivo, поскольку отсутствуют несколько типов клеток, а различные рецепторы и транспортеры аберрантно экспрессируются3 . Кроме того, поскольку клеточные линии получены от одного донора, они не представляют межпациентной гетерогенности и страдают от снижения сложности и физиологической значимости. Хотя первичные ткани, используемые в камерах Ussing и в качестве кишечных колец, более репрезентативны для ситуации in vivo, их ограниченная доступность, краткосрочная жизнеспособность и отсутствие расширяемости делают их непригодными в качестве среды для исследований с высокой пропускной способностью (HT).
Органоиды представляют собой эпителиальные культуры in vitro, созданные из разных органов, таких как кишечник, почки, печень, поджелудочная железа и легкие. Доказано, что они обладают долгосрочной, стабильной расширяемостью, а также генетической и фенотипической стабильностью и поэтому являются репрезентативными биологическими миниатюрами эпителия исходного органа с верными реакциями на внешние раздражители 4,5,6,7,8,9. Органоиды эффективно устанавливаются из резецированной или биопсированной нормальной, больной, воспаленной или раковой ткани, представляя собой гетерогенные специфические для пациента ответы 10,11,12,13,14,15,16. В данной работе показано, как установить монослои эпителия кишечника, полученные из органоидных культур. Монослои были успешно установлены из тонкокишечных, а также кишечных и ректальных органоидных культур. Данная модель создает возможность для изучения транспорта и проницаемости эпителиальных клеток к лекарственным средствам, а также их токсикологического воздействия на эпителий. Более того, модель позволяет совместно культивировать с иммунными клетками и бактериями изучать их взаимодействие с эпителием кишечника 17,18,19. Кроме того, эта модель может быть использована для изучения реакций на терапию в зависимости от пациента и инициирования скрининговых усилий для поиска следующей волны эпителиальных барьерно-ориентированных терапевтических средств. Такой подход может быть распространен на клинику и проложить путь к персонализированному лечению.
Хотя эпителиальные монослои в этом протоколе получены из нормальных органоидов кишечника человека, протокол может быть применен и оптимизирован для других органоидных моделей. Эпителиальные органоидные монослои культивируют в кишечной органоидной экспансионистской среде, содержащей Wnt для поддержки пролиферации стволовых клеток и представляющей клеточный состав кишечного крипта. Кишечные органоиды могут быть обогащены, чтобы иметь различные кишечные эпителиальные судьбы, такие как энтероциты, панет, кубок и энтероэндокринные клетки, путем модуляции путей Wnt, Notch и эпидермального фактора роста (EGF). Здесь, после установления монослоев в расширительной среде, они движутся в сторону более дифференцированных эпителиальных клеток кишечника, как описано ранее 20,21,22,23,24,25. Для целей скрининга, в зависимости от способа действия интересующего соединения, его клеток-мишеней и экспериментальных условий, монослои могут быть направлены к клеточному составу выбора для измерения эффектов соединения с соответствующими функциональными показаниями.
1. Подготовка реагентов к культуре
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги внутри шкафа биобезопасности и следуйте стандартным рекомендациям по работе с клеточными культурами. Ультрафиолетовый свет используется в течение 10 минут перед запуском шкафа биобезопасности. До и после использования поверхность шкафа биобезопасности очищается папиросной бумагой, пропитанной 70% этанолом. Чтобы облегчить образование трехмерных капель внеклеточного матрикса (ECM), держите предварительно расплавленный запас 96-, 24- и 6-луночных пластин наготове в инкубаторе при 37 °C.
2. Органоидные культуры
3. Эпителиальный монослойный препарат
4. Показания эпителиального монослоя
5. Масштабирование до 96-луночных пластин, содержащих мембранные вставки
ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте эпителиальные монослои для скрининга лекарств с более высокой пропускной способностью или множественных средовых условий с использованием пластин HTS 96-луночных отверстий, содержащих мембранные вставки.
На рисунке 1А показано репрезентативное яркое изображение органоидов кишечника после их размораживания от криовиала. Важно размораживать органоиды при высокой плотности, чтобы обеспечить оптимальное восстановление. Органоиды покрыты 24- или 6-луночными пластинами в ку...
Этот протокол описывает общие манипуляции и поддержание кишечных органоидов, а также приготовление и возможное применение эпителиальных монослоев, полученных из этих органоидов. На сегодняшний день монослои успешно получены из двенадцатиперстной кишки, подвздошной кишки и различны?...
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Эта работа поддерживается topsector Life Sciences & Health - Topconsortium voor Kennis en Innovatie Health ~ Holland (LSH-TKI) государственно-частное партнерство (PPP) голландского сектора LSH с номером проекта LSHM16021 Органоиды в качестве нового инструмента для токсикологического моделирования для Hubrecht Organoid Technology (HUB) и внутреннего финансирования HUB для отдела моделирования и токсикологии заболеваний. Мы благодарим лаборатории Сабины Миддендорп (отделение детской гастроэнтерологии, детская больница Вильгельмина, UMC, Утрехт) и Хуго Р. де Йонге и Марселя Й.К. Бийвельдса (отделение гастроэнтерологии и гепатологии, Erasmus MC, Роттердам) за оказание первоначальной технической поддержки в установке монослоев на мембранных вставках.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
100% ethanol | Fisher Emergo | 10644795 | |
1250, 300, and 20 µL low-retention filter-tips | Greiner bio-one | 732-1432 / 732-1434 / 732-2383 | |
15 mL conical tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
24-well cell culture plates | Greiner bio-one | 662160 | |
24-well HTS Fluoroblok Transwell plate (light-tight) | Corning | 351156 | |
24-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 3378 | |
24-well plate with Transwell inserts | Corning | 3470 | |
40 µm cell strainer | PluriSelect | 43-50040-01 | |
50 mL conical tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
6-well cell culture plates | Greiner bio-one | 657160 | |
96-well black plate transparent bottom | Greiner bio-one | 655090 | |
96-well fast thermal cycling plates | Life Technologies Europe BV | 4346907 | |
96-well HTS Fluoroblok Transwell plate | Corning | 351162 | |
96-well HTS Transwell plates (Table 1) | Corning | 7369 | |
96-well transparent culture plate | Greiner bio-one | 655180 | |
A83-01 | Bio-Techne Ltd | 2939 | |
Accutase Cell Dissociation Reagent | Life Technologies Europe BV | A11105-01 | Cell dissociation reagent 2 |
Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies Europe BV | 12634028 | |
B27 supplement | Life Technologies Europe BV | 17504001 | |
Cell culture microscope (light / optical microscope) | Leica | ||
CellTiter-Glo | Promega | G9683 | |
Centrifuge | Eppendorf | ||
CO2 incubator | PHCBI | ||
DAPT | Sigma-Aldrich | D5942 | |
DEPC treated H2O | Life Technologies Europe BV | 750024 | |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) with Ca2+ and Mg2+ | Life Technologies Europe BV | 14040091 | |
DPBS, powder, no calcium, no magnesium | Life Technologies Europe BV | 21600069 | |
EnzChek Lysozyme Assay Kit | Life Technologies Europe BV | E22013 | |
EVOM2 meter with STX electrode | WTI | ||
Gastrin | Bio-Techne Ltd | 3006 | |
Glass pipettes | Volac | ||
GlutaMAX | Life Technologies Europe BV | 35050038 | |
hEGF | Peprotech | AF-100-15 | |
HEPES | Life Technologies Europe BV | 15630056 | |
Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
Human Rspo3 | Bio-Techne Ltd | 3500-RS/CF | |
IWP-2 | Miltenyi Biotec | 130-105-335 | |
Ki67 primary antibody | Sanbio | BSH-7302-100 | |
Ki67 secondary antibody | Agilent | K400111-2 | |
Kova International Glasstic Slide with Counting grids | Fisher Emergo | 10298483 | |
Laminar flow hood | Thermo scientific | ||
Lucifer Yellow CH dilithium salt | Sigma-Aldrich | L0259 | |
Matrigel, Growth Factor Reduced (GFR) | Corning | 356231 | extracellular matrix (ECM) |
MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0.1 mL | Life Technologies Europe BV | 4358293 | |
MicroAmp Optical 8-Cap Strips | Life Technologies Europe BV | 4323032 | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 0030 120 086 | |
Micropipettes (1000, 200, and 20 µL) | Gilson | ||
Microtome | Leica | ||
MUC2 primary antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-15334 | |
MUC2 secondary antibody | VWR | VWRKS/DPVR-HRP | |
Multichannel pipette (200 µL) | Gilson | ||
N-acetylcysteine | Sigma-Aldrich | A9165 | |
NGS Wnt | U-Protein Express | N001-0.5mg | |
Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
Oligonucleotide ALPI1/Forward | Custom-made | GGAGTTATCCTGCTCCCCAC | |
Oligonucleotide ALPI1/Reverse | Custom-made | CTAGGAGGTGAAGGTCCAACG | |
Oligonucleotide LGR5/Forward | Custom-made | ACACGTACCCACAGAAGCTC | |
Oligonucleotide LGR5/Reverse | Custom-made | GGAATGCAGGCCACTGAAAC | |
Oligonucleotide MUC2/Forward | Custom-made | AGGATCTGAAGAAGTGTGTCACTG | |
Oligonucleotide MUC2/Reverse | Custom-made | TAATGGAACAGATGTTGAAGTGCT | |
Oligonucleotide TBP/Forward | Custom-made | ACGCCGAATATAATCCCAAGCG | |
Oligonucleotide TBP/Reverse | Custom-made | AAATCAGTGCCGTGGTTCGTG | |
Optical adhesive covers | Life Technologies Europe BV | 4311971 | |
PD0325901 | Stemcell Technologies | 72184 | |
Penicillin/streptomycin | Life Technologies Europe BV | 15140122 | |
Plate shaker | Panasonic | ||
PowerUp SYBR Green Master Mix | Fisher Emergo | A25776 | |
Primocin | InvivoGen | ANT-PM-2 | antimicrobial formulation for primary cells |
Qubit RNA HS Assay Kit | Life Technologies Europe BV | Q32852 | |
Reagent reservoir for multichannel pipet | Sigma-Aldrich | CLS4870 | |
REMS AutoSampler with 24-probe or 96C-probe | WTI | ||
Richard-Allan Scientific Alcian Blue/PAS Special Stain Kit | Thermo scientific | 87023 | |
RNase-Free DNase Set | Qiagen | 79254 | |
RNeasy Mini Kit | Qiagen | 74106 | |
SB202190 | Sigma-Aldrich | S7076 | |
Serological pipettes | Greiner bio-one | 606180 / 607180 / 760180 | |
Serological pipettor (Pipet-Aid) | Drummond | ||
Single edge razor blade | GEM Scientific | ||
Superscript 1st strand system for RT-PCR | Life Technologies Europe BV | 11904018 | |
Tecan Spark 10M plate reader | Tecan | ||
Trypan Blue Solution, 0.4% | Life Technologies Europe BV | 15250-061 | |
TrypLE Express Enzyme (1x) | Life Technologies Europe BV | 12605-010 | Cell dissociation reagent 1 |
Water bath | Grant | ||
Y27632 (ROCK inhibitor) | AbMole | M1817 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены