במבחנה הדמיה כמותית אסאי עבור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים על ידי iPSC-מקרופאגים

Summary

מחלות ניווניות קשורות לתפקודי מיקרוגליה דיסרגטיים. מאמר זה מתאר במבחנה של פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה על ידי iPSC-מקרופאגים. קריאות מיקרוסקופיה כמותית מתוארות הן עבור הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים והן עבור הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים.

Abstract

מיקרוגליה מתזמרת תגובות נוירואימוניות במספר מחלות ניווניות, כולל מחלת פרקינסון ומחלת אלצהיימר. מיקרוגליה לנקות נוירונים מתים וגוססים בתהליך של efferocytosis, צורה מיוחדת של פאגוציטוזיס. תפקוד הפגוציטוזיס יכול להיות משובש על ידי גורמי סיכון סביבתיים או גנטיים המשפיעים על מיקרוגליה. מאמר זה מציג פרוטוקול מיקרוסקופיה מהיר ופשוט במבחנה לחקר efferocytosis מיקרוגלילי במודל תאי גזע פלוריפוטנטים המושרה (iPSC) של מיקרוגליה, באמצעות קו תאים נוירובלסטומה אנושי (SH-SY5Y) המסומן בצבע רגיש ל- pH למטען הפגוציטי. התוצאה של ההליך היא תשואה גבוהה של תאי נוירובלסטומה מתים, המציגים פני השטח פוספטידילסרין, המוכרים כאות "לאכול אותי" על ידי פאגוציטים. בדיקת הלוח 96-well מתאימה להדמיה בזמן לשגות תא חי, או שניתן לתקן את הצלחת בהצלחה לפני עיבוד נוסף וכימות על ידי מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה. מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים מאפשרת להרחיב את ה- assay לבדיקה לבדיקה של מעכבי מולקולות קטנות או להערכת הפונקציה הפאגוציטית של קווי iPSC וריאנט גנטי. בעוד שביקורת זו פותחה כדי לחקור פאגוציטוזיס של תאי נוירובלסטומה מתים שלמים על ידי iPSC-מקרופאגים, ניתן להתאים את הבחינה בקלות למטענים אחרים הרלוונטיים למחלות ניווניות, כגון סינפטוזומים ומיאלין, וסוגי תאים פאגוציטים אחרים.

Introduction

מיקרוגליה הם מקרופאגים של רקמת המוח, ותפקודם כולל מעקב חיסוני, תיאום תגובות דלקתיות לפציעה/זיהום, שיפוץ סינפטי ופגוציטוזיס של תאים מתים, מיאלין, אגרגטים של חלבונים ופתוגנים. Phagocytosis הוא התהליך שבו מיקרוגליה לזהות מטען עם קולטני פני השטח ולארגן מחדש את הציטוסקלטון שלהם כדי לבלוע את האובייקט לתוך פאגום, אשר לאחר מכן מתמזג עם ליזוזומים להשפלה של המטען. תאי מוח אפופוטוטיים מיקרוגליה בריאים כדי להסיר אותם לפני שהם הופכים לנמק¹. ה phagocytosis של תאים אפופוטוטיים ידוע גם בשם efferocytosis, ודורש תצוגה של אות פוספטידילסרין "לאכול-אותי" על ידי התא הגוסס². קולטני מיקרוגליה רבים נקשרים ישירות לפוספטידילסרין, כולל TIM-4, BAI1, Stabilin-2 ו- TREM2. קולטני TAM מיקרוגליאליים (למשל, MERTK) ו integrins בעקיפין להיקשר פוספטידילסרין, באמצעות חלבוני אביזר GAS6 או MFG-E8, בהתאמה. אותות "לאכול אותי" אחרים עשויים להיות נחוצים להכרה בתאים גוססים, אלה כוללים שינויים בגליקוסילציה או מטען של חלבוני שטח; ביטוי של חלבונים תאיים ICAM3, calreticulin, annexin-I על פני התא; LDL מחומצן; או ציפוי של התא האפוטוטי על ידי מיקרוגליה המיוצרת C1q^1,2.

מחלות ניווניות, כולל מחלת פרקינסון, מחלת אלצהיימר, דמנציה פרונטוטמפוראלית וטרשת אמיוטרופית לרוחב נקשרו לפגיעה בתפקוד המיקרוגליה, כולל הצטברות של מוצרי פסולת מוחית כגון תאים מתים, שברי מיאלין, אגרגטים של חלבונים, ותגובות דלקתיות מוגזמות לגירויים אלה³. Phagocytosis עלול להיפגע במחלות ניווניות ולתרום לפתולוגיה, בשל שילוב של הזדקנות, דלקת, או וריאנטים סיכון גנטי ספציפי^4,5. מצד שני, יש גם עדויות של מודלים בעלי חיים של מחלות ניווניות כי מיקרוגליה עלולה באופן בלתי הולם phagocytose נוירונים קיימא או סינפסות^6,7,8. המנגנון צפוי להיות מופעל על ידי תצוגת פוספטידילסרין של נוריטים פגומים, אשר חש ישירות על ידי קולטני פאגוציטוזיס מיקרוגליאלי TREM2 או GPR56, או חש בעקיפין על ידי ציפוי C1q משלים מסיסים הממברנה מועשרת פוספטידילסרין, המובילה לפגוציטוזיס^9,10,11.

במבחנה בדיקות של פונקציית פאגוציטוזיס, למשל, כדי להעריך את ההשפעה הפנוטיפית של וריאנט סיכון גנטי במיקרוגליה, מבוצעים לעתים קרובות באמצעות מטענים לא פיזיולוגיים כגון חרוזי לטקס⁴. חיידקים וזימוסן מתויגים באופן פלואורסצנטי משמשים גם, שהם פיזיולוגיים אך אינם רלוונטיים למחלות ניווניות. מטענים פאגוציטיים לא פיזיולוגיים יכולים לשמש לזיהוי פגמים במכונות הבסיסיות של בלוע פאגוציטי, אך אינם מצליחים לדגמן במדויק את שלב ה"הכרה " הראשון בפגוציטוזיס של נוירונים אפופטוטיים. הגודל, הצורה, הנוקשות וסוג המטען מכתיבים גם את מסלולי האיתות התאיים המופעלים, מה שמוביל לתוצאות שונות של מצב הפעלת מיקרוגליה. לדוגמה, חיידקי E.coli הם קטנים ונוקשים, בניגוד לתאים אנושיים, ואת lipopolysaccharides על פני השטח שלהם מזוהים על ידי קולטן אגרה כמו 4 (TLR4) המפעיל פגוציטוזיס ומסלולי איתות פרו דלקתיים^2,12.

בהקשר של מחקרי מחלות ניווניות, מטען פאגוציטי רלוונטי יותר יהיה תצוגת פוספטידילסרין על קרום פלזמה יונקים, ויהיה אידיאלי אנושי נוירוני, לכלול אותות כי מיקרוגליה צפויים להיתקל. עבור פרוטוקול פאגוציטוזיס זה, קו תאי הנוירובלסטומה האנושי SH-SY5Y נבחר כמודל נוירון קל לתרבות. תצוגה קבועה של פוספטידילסרין משטח הושרה באופן מלאכותי על ידי paraformaldehyde, אשר הוכח בעבר לגרום תצוגה פוספטידילסרין של טסיות דם¹³. עבור מודל התא מיקרוגליה אנושי iPSC-מקרופאגים שימשו, אשר לחקות את הפרופיל ontogeny ותעתיק של מיקרוגליה אנושית, והם phagocyticly מוסמך^14,15,16,17. iPSC-מקרופאגים אינם מודל המיקרוגליה האותנטי ביותר הזמין, למשל, הם אינם מחקים מורפולוגיה של מיקרוגליה; עם זאת, ניתן להחליף אותו למודל IPSC מונוקולטורה אותנטי יותר של מיקרוגליה אם תרצה, כגון Haenseler ואח^'15. מודלים IPSC אנושיים עדיפים על מיקרוגליה מכרסמים ראשונית לחקר ניוון עצבי, בשל חששות לגבי החפיפה המוגבלת של מודולי מיקרוגליה נצפו ברקמות מחלה נוירודגנרטיבית אנושית לעומת עכבר¹⁸. ה-SH-SY5Ys המתים מוכתמים בצבע רגיש לחומצה שנובע חלש ב-pH ניטרלי ובעוצמה רבה יותר בתוך הפגוליסוזומים של iPSC-מקרופאגים לאחר פאגוציטוזיס. שימוש בצבע רגיש לחומצה משפר את הדיוק של זיהוי אירועים פאגוציטיים, עם רב-תכליתיות לקריאות שונות של מקרופאגים חיים וקבועים¹⁹. פרוטוקול זה מתאר הן הדמיה בזמן-זמן של פאגוציטוזיס של תאים חיים והן לבדיקת הדמיה קבועה בעלת תוכן גבוה עבור פאגוציטוזיס, עם אותם שלבי הכנת תאים לפני הקריאה (איור 1).

איור 1: דיאגרמה סכמטית של מתודולוגיה. קו המתאר של phagocytosis אסאי, שבו הכנת SH-SY5Ys והכתמה של iPSC-מקרופאגים מבוצעים במקביל, ולאחר מכן SH-SY5Ys הם pipetted על iPSC-מקרופאגים. הדמיה בזמן לשגות תא חי מתבצעת באופן מיידי, או שהתאים מדגירים ב-37 °C/5% CO₂ למשך הזמן הנדרש ומתוקנים לפני ביצוע מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה. PFA: paraformaldehyde, HBM: פנול ללא אדום ללא חציץ HEPES, pHr: pH רגיש צבע פלואורסצנטי STP אסתר פתרון, PRFMM: פנול אדום חינם מקרופאג מדיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Protocol

הפרוטוקול עוקב אחר ההנחיות לשימוש בקווי תאי IPS אנושיים הנגזרים מאוניברסיטת אוקספורד, מרכז מחלות פרקינסון באוקספורד (ועדת האתיקה: שירות הבריאות הלאומי, הרשות לחקר הבריאות, NRES ועדת דרום סנטרל, ברקשייר, בריטניה (REC 10/H0505/71)). IPSCs אנושיים יטופלו בתוך ארון בטיחות Class II כדי להגן על העובד מפני סוכנים הרפתקניים אפשריים. יש להקפיד על תקנות הבריאות והבטיחות המקומיות, הלאומיות והאיחוד האירופי. קומפוזיציות מדיה של תרבות התא מפורטות בטבלה 1, וכל החומרים מפורטים בטבלת החומרים המשלימה.

1. תרבית התא לפני הניסוי

1. IPSCs תרבות במדיה iPSC (טבלה 1) ב 6-טוב לוחות מצופים מראש עם מטריצת ממברנה מרתף מוסמך hESC, תת-מפגש ובמספר מעבר נמוך.
2. להבדיל IPSCs אנושיים מבשרי iPSC-macrophage: זרע ארבעה מיליון iPSC לתוך צלחת 24-well דבקות נמוכה microwell עם 2 מ"ל של מדיה גוף עוברי (טבלה 1) כדי לעודד היווצרות הגוף העובר ולבצע 75% שינויים בתקשורת מדי יום במשך 5-6 ימים. העבר גופים עובריים לתוך T175 צלוחיות, כ 150 גופים עובריים לכל בקבוקון, המכיל 20 מ"ל של מדיה במפעל(טבלה 1). להאכיל מדי שבוע על ידי תוספת של 10-20 מ"ל של מדיה במפעל.
   הערה: מבשרי iPSC-מקרופאגים מגיחים לתוך supernatant לאחר כ 2-3 שבועות והם מיוצרים ברציפות במשך מספר חודשים. עבור ניסוי זה, עדיף להשתמש בתאים מכ 6 שבועות לאחר הקמת מפעלי הבידול. iPSC-מקרופאגים שנקטפו מוקדם יותר יכולים לשמור על יכולת שגשוג מסוימת והם פחות דבקים, ומונעים אפילו זריעה בצפיפות תאים נמוכה. מגבלת גיל עליונה ליכולת פאגוציטוזיס לא נקבעה.
3. להבדיל iPSC-מקרופאגים מבשרי iPSC-מקרופאגים: מבשרי קציר על ידי הסרת הנפח הנדרש של supernatant; להעביר אותו דרך מסננת תא 40 מיקרומטר כדי להסיר גושים; צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות כדי כדורי תאים resuspend במדיה מקרופאג '(טבלה 1). זרע iPSC-מקרופאגים ב 20,000-30,000 תאים לבאר בתרבית רקמות 96 טוב (TC) מטופלים מיקרופלאט עם קירות באר שחורים ותחתית ברורה אופטית, ב 100 μL של מדיה מקרופאג 'לבאר. הימנע בארות הקצה ולמלא אלה עם PBS; זה חשוב כדי להפחית את ההשפעה של אידוי על ההסתה. להבדיל במשך 6-10 ימים על ידי דגירה ב 37 °C /5% CO₂.
   הערה: עבור תימוץ זה, קו IPSC BIONi010-C (ECACC ID: 66540023) שימש; עם זאת, ניתן להחליף קו IPSC אחר.
4. שמור על SH-SY5Ys כדי תת-מפגש בבקבוקי T75 עם 20 מ"ל של מדיה SH-SY5Y(טבלה 1),עובר כל 3-4 ימים.

שם	מדיית בסיס	תוסף, ריכוז סופי
מדיה של IPSC	mTeSR1	-
מדיה של גוף עוברי	mTeSR1	BMP4, 50 ננוגרם ל/מ"ל
		VEGF, 50 ננוגרם/מ"ל
		SCF, 20 ננוגרם ל/מ"ל
מדיית מפעל	XVIVO15	גלוטמקס, 2 מ"מ
		פניצילין, 100 יחידות/מ"ל
		סטרפטומיצין, 100 מיקרוגרם/מ"ל
		2-מרקפטותנול, 50 מיקרומטר
		IL-3, 25 ננוגרם/מ"ל
		M-CSF, 100 ננוגרם/מ"ל
תקשורת מקרופאג'	XVIVO15	גלוטמקס, 2 מ"מ
		פניצילין, 100 יחידות/מ"ל
		סטרפטומיצין, 100 מיקרוגרם/מ"ל
		M-CSF, 100 ננוגרם/מ"ל
מדיה SH-SY5Y	DMEM/F12	סרום בקר עוברי, 10%
		פניצילין, 100 יחידות/מ"ל
		סטרפטומיצין, 100 מיקרוגרם/מ"ל

טבלה 1: מתכונים לתקשורת.

המרכיבים של מדיה של תרבית התא המשמשים בפרוטוקול. פרטים נוספים על רכיבי המדיה ניתן למצוא בטבלת החומרים.

2. הכנת SH-SY5YS מת

1. בארון בטיחות ביולוגי מסוג II, לנתק SH-SY5Ys, על ידי תוספת של 4 מ"ל של מאגר דיסוציאציה תא המכיל אנזימים דמויי טריפסין רקומביננטי ו 1.1 mM EDTA (ראה טבלה של חומרים), אשר יש להסיר מיד, כך פחות מ 1 מ"ל נשאר כמו סרט דק ציפוי התאים. דגירה במשך 2-3 דקות ב 37 °C (5% CO_2).
2. הוסיפו 10 מ"ל של HBSS לבקבוק T75 לשטיפה, ופיפטו את ה-SH-SY5Ys לצינור צנטריפוגה חרוט בגודל 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 400 x g במשך 5 דקות. לשאוף supernatant ולהשעות מחדש את התאים ב 2 מ"ל של פנול ללא אדום ללא חציית HEPES אגום (ראה טבלה של חומרים). הקפד לשפץ את הכדור בזהירות, pipetting עם 100-1,000 μL pipette כדי לשבור גושים לפני קיבעון.
3. לתקן תאים על ידי הוספת 2 מ"ל של 4% paraformaldehyde (ריכוז סופי 2%) לצינור. דגירה במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר עם תסיסה עדינה מדי פעם של הצינור.
4. הוסף 10 מ"ל של HBSS לצינור. צנטריפוגה ב 1,200 x g במשך 7 דקות להשעות מחדש ב 2 מ"ל של פנול ללא אדום ללא HEPES מדיה חוצץ.
   הערה: לאחר שלב 2.4, ניתן לשלוט בהכנת SH-SY5Y קבועה על ידי הכתמה עם נספח V-FITC כדי להציג פוספטידילסרין נגיש ויודיד פרופיליום למדידת חמילות התא עם קריאת ציטומטריית זרימה. השווה את ההכנה הקבועה ל- SH-SY5Ys חי המתקבלת בשלב 2.2. ראו סעיף 7 ואיור משלים S1. אחסון של SH-SY5Ys קבוע לאחר שלב 2.4 אינו מומלץ מכיוון שזה לא הוערך.

3. תיוג של SH-SY5Ys מת עם צבע פלואורסצנטי אדום רגיש ל- pH

1. לאחר שלב 2.4, לספור את התאים, ולהסיר את המספר הכולל של תאים הנדרשים לתוך צינור 2 מ"ל חלבון מחייב. עבור כל 1 מיליון SH-SY5Ys, לפצות את הנפח הכולל בצינור 2 מ"ל כדי 300-500 μL עם פנול ללא אדום ללא HEPES מדיה. מחממים את הצינור לזמן קצר באמבט מים 37 °C ..
2. ליישב מחדש את אסתר STP צבע פלואורסצנטי אדום רגיש pH (ראה טבלה של חומרים) ולהוסיף 12.5 מיקרוגרם של צבע למיליון SH-SY5Y לצינור 2 mL חם של תאים. מערבבים בעדינות על ידי צנרת. לדגור על הצינור בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות, מוגן מפני אור.
   הערה: מינים אסתר STP של צבע רגיש pH מגיב עם אמינים ראשוניים ולכן מאגר תיוג אסור להכיל אמינים חינם. בשל מסיסות מוגבלת פוטנציאלית במאגרים מימיים, להוסיף את הצבע מומס DMSO רק כדי לחמם חיץ מימי, לערבב מיד, ולבחון סימנים של משקעים (חלקיקים כהים תחת מיקרוסקופ אור).
3. הוסף 1 מ"ל של HBSS וצנטריפוגה ב 1200 x גרם במשך 7 דקות ב 4 °C (7 °F). להשליך את supernatant ולשטוף עם 2 מ"ל HBSS. חזור על צנטריפוגה.
4. השלך את supernatant ולהשעות מחדש את התאים במדיה מקרופאג 'ללא אדום פנול (ראה טבלה של חומרים), לריכוז של 200,000-1.2 מיליון תאים / מ"ל כך 50 μL הוא 10,000-60,000 תאים (כלומר, 0.5x-3x יותר SH-SY5Ys מאשר iPSC-מקרופאגים).
   הערה: פנול אדום במדיה מגביר פלואורסצנטיות רקע ולכן מדיה פנול אדום חינם יש להשתמש אם הדמיה תא חי הוא להתבצע. אחסון של SH-SY5Ys מוכתם במשך יותר מכמה שעות אינו מומלץ כמו זה לא הוערך. שמור SH-SY5Ys מוכתמים על קרח ולהגן מפני אור.

4. הכתמת iPSC-מקרופאגים

1. בארון בטיחות ביולוגי, הכינו פתרון במדיה של מקרופאגים של צבע עמוק של פלואורסצנטי אדום עמוק, חלחל לתא, סוצ'ינימידיל אסתר-תגובתי (ראה טבלה של חומרים). הוסף הוך 33342 (ראה טבלת חומרים). מחממים את פתרון העבודה ל 37 °C (50 °F) באמבט מים.
2. שאפו את המדיום iPSC-מקרופאג' בעדינות על ידי הזרקת תא-על-נט עם פיפטה רב-ערוצית למאגר סטרילי. הוסף 70 μL / באר של פתרון הצבע מוכן בשלב 4.1 ל- iPSC-מקרופאגים, באמצעות pipette רב ערוצי. דגירה עבור 1 שעה ב 37 °C /5% CO₂.
3. הכן טיפולים ניסיוניים בתקשורת מקרופאג' נטולת אדום פנול. כלול 10 μM ציטוצ'אלסין D כטיפול שליטה שלילית. לאחר הדגירה שואפים המדיום iPSC-macrophage בעדינות רבה עם pipette רב ערוצי, ולהוסיף 100 μL / טוב של תמיסת תמיסת מלח חוצץ של האנק (HBSS) לשטוף. הסר מיד HBSS על ידי pipetting עדין, ולאחר מכן להוסיף 100 μL של מדיה ± תרכובות. דגירה במשך 10 דקות-1 שעות ב 37 °C (5%)
   הערה: Cytochalasin D הוא מעכב אקטין חזק וחוסם פאגוציטוזיס. עבור כל טיפולים ניסיוניים הדורשים דגירה ארוכה יותר, למשל, 24-72 שעות, לבצע את הטיפול הניסיוני לפני שלב 4.1 באמצעות 100 μL / well של טיפול במדיה מקרופאג מלאה. בצע את השלבים 4.1-4.3 לפי הפרוטוקול, כך כתמי התא מבוצע ולאחר מכן הטיפול הוא החלה מחדש בתקשורת מקרופאג 'ללא אדום פנול למשך שארית הבדיקה phagocytosis.

5. פאגוציטוזיס הדמיה

להלן שתי שיטות קריאה שונות של פאגוציטוזיס, בחר תת סעיף 5.1 או 5.2.

1. הדמיה בזמן של תאים חיים
   1. לפני phagocytosis, להפעיל את מיקרוסקופ הדמיה זמן לשגות של תאים חיים (ראה טבלה של חומרים), מחשב, תא סביבה, וגז CO_2. פתח תוכנה ללכידת תמונות. ודא שקוביות האור DAPI, RFP ו- CY5 מותקנות במיקרוסקופ. לחץ על זמן לשגות | | דגירה אפשר תא סביבה ובחר התחממות ל-37 °C עם גז CO_2, גם להבטיח כי הלחות היא דה-נבחר. אפשר 30 דקות למיקרוסקופ להתחמם עד 37 °C (50 °F).
   2. במהלך הדגירה המורכבת בשלב 4.3, לטעון את צלחת iPSC-מקרופאג לתוך המיקרוסקופ.
   3. לחץ על | תמונה לכידת | מומחה לכלישיט. בחר צלחת באר ובחר סוג צלחת 96-well.
   4. בכרטיסיה תמונה, הפעל את ערוץ הפאזה והתאם את המיקוד גס והטוב באמצעות המחוונים האנכיים, כך שהתאים נמצאים במוקד. התאם את רמות התאורה באמצעות המחוון האופקי. לחץ על ערוצי DAPI, RFP ו- CY5 והתאם את רמות התאורה עבור כל ערוץ.
   5. בכרטיסיה מערכת, לחץ על כייל יישור כלי ובצע את הוראות המסך.
   6. לחץ על זמן לשגות | השגרה | צור שגרה חדשה. במסך הראשון של אשף זמן לשגות, שם השגרה. לחץ על הבא. במסך השני, בחר את המטרה 20x, בחר לכידת מונוכרום ובחר את ערוצי DAPI, RFP, CY5 ו- Phase. אל תבחרו באפשרויות הבאות: חיפוש אוטומטי לדוגמה, מיקוד עדין אוטומטי, Z-Stack, תאורה אוטומטית. לחץ על הבא.
   7. על המסך הבא להגדיר משואה במרכז כל באר, אשר יאפשר את המיקרוסקופ לחזור לאותם מתאמים עם אותן הגדרות תאורה עבור כל נקודת זמן. הגדרות המיקוד והתאורה עבור כל משואה הן עצמאיות. כדי להגדיר משואה: גרור את העיגול הכחול למיקום על מפת הצלחת, השתמש במחוון האנכי גס והטוב של המוקד, וכאשר מרוצה לחץ על הוסף ביקון. ניתן לעדכן את הגדרות המשואה מאוחר יותר באמצעות לחצן עדכן שנבחר.
   8. כאשר מוכן להתחיל בדיקת phagocytosis, להסיר את צלחת בדיקת ולהניח אותו בארון בטיחות ביולוגי. השתמש pipette רב ערוצית כדי להוסיף 50 μL של SH-SY5Ys לבאר, הוספת לצד של כל באר בקצה הנוזל.
   9. לטעון את הצלחת לתוך המיקרוסקופ ולחכות כ 30 דקות עבור המעבר התרמי כדי שיווי משקל.
      הערה: במהלך 30 הדקות הראשונות שהצלחת נמצאת במיקרוסקופ, הטמפרטורה המשתנה של צלחת ההסתה תגרום למוקד לזוז. אם הלוח אינו מורשה להתיק, התמונות שנתפסו יזוזו מחוץ לפוקוס במהלך מעידת הזמן.
   10. לחץ על כל משואה ועדכן את הגדרת המוקד. לחץ על הבא. במסך הבא של אשף זמן לשגות, בחר את תבנית הקובץ TIFF, הפעל את האפשרות לשמור ערוצים בודדים, והפוך את האפשרות ליצור וידאו עבור כל יקוןולאפשר את האפשרויות מתחת כלול את המידע הבא כסימן מים. לחץ על הבא.
   11. הגדר את מספר הסצנות ל- 1. לחץ על הבא. הגדר את משך הזמן והמרווחים של זמן-לשגות, למשל, 3 שעות והדמיה כל 5 דקות. אל תבחר לכידת מסגרת אחת בלבד. לחץ על הבא.
   12. אפשר את תא הסביבה, עם טמפרטורה של 37 °C₍₃₇ °C (לחות היא אופציונלית לניסויים קצרים). לחץ על הבא פעמיים. בחר נתיב לשמירת הנתונים. לחץ על הבא. לחץ על התחל כדי להתחיל את מעידת הזמן.
2. הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים
   1. השתמש pipette רב ערוצית כדי להוסיף 50 μL של SH-SY5Ys שכותרתו לבאר, הוספת לצד של כל באר בקצה הנוזל. דגירה ב 37 °C / 5% CO₂ עבור 3-5 שעות.
   2. לאחר הדגירה של פאגוציטוזיס, שאפו בעדינות את צינורות-העל של התאים על-ידי צנרת עם פיפטה רב-ערוצית, והשליכו. לשטוף פעם אחת עם 100 μL PBS.
   3. תקן את הצלחת על ידי תוספת של 100 μL של 2% paraformaldehyde, דגירה במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר.
   4. שאפו בארות והוסיפו 100 μL של PBS. מכסים עם אטם צלחת ונייר כסף; יש לאחסן ב-4 מעלות צלזיוס עד שיידרש.
      הערה: צלחת ההסתה יכולה להיות מאוחסנת ככה לפחות שבוע ללא השפלת אות משמעותית; אחסון ארוך יותר לא נבדק.
   5. הפעל את מיקרוסקופ ההדמיה בעל התוכן הגבוה (ראה טבלת חומרים) ופתח את תוכנת לכידת התמונה. טען את צלחת בדיקת המיקרוסקופ על ידי לחיצה על סמל טען בחלק העליון של המסך.
   6. בחר בכרטיסיה התקנה. בתפריטים הנפתחים של התיבה הימנית העליונה: בחר את סוג הלוח המתאים, בחר באפשרות המיקוד האוטומטי שתי שיאים (ברירת מחדל),בחר את המטרה 40x מים, NA1.1, בחר מצב Confocal ובחר binning של 1.
   7. יש לשטוף את המטרה 40x water לפני השימוש, באמצעות תפריט הגדרות.
   8. בתיבה בחירת ערוץ, השתמש בסמל + כדי להוסיף את הערוצים DAPI, Alexa 647 ו- Alexa 568. הגדר אלה כדי למדוד במישור יחיד של 1 מיקרומטר. מטב את הגדרות הזמן וההספק ליעילות הכתמים של צלחת ה- assay.
      הערה: כהנחיה, הגדר DAPI בחשיפה של 200 ms ו- 100% כוח, Alexa 647 בחשיפה של 1500 ms ו- 100% כוח, ואלקסה 568 בחשיפה של 100 מיליות ו -40% כוח.
   9. ודא הערוצים אינם נמדדים בו זמנית על ידי לחיצה על רצף ערוץ כדי להפריד את הערוצים.
   10. תחת | ניווט הגדר פריסה, בחר את בארות המידה ובחר 9-12 שדות לבאר.
   11. במהלך ההקמה, לחץ על שדה מייצג במפת הצלחת, ובדוק כל ערוץ מדידה בתורו, כדי לוודא שהכתמים קיימים ושהתמונות ממוקדות, על ידי התאמת היסט הערוץ.
   12. כדי להעלות נתונים לשרת לניתוח מרחוק, לחץ על התיבה משימות מקוונות ועל שם המסך הרלוונטי; פעולה זו תאפשר העלאה אוטומטית של הנתונים לשרת לאחר ההדמיה.
   13. שמור את פרוטוקול ה- assay על-ידי לחיצה על לחצן שמור.
   14. לחץ על הכרטיסיה הפעל ניסוי בחלק העליון ושם את צלחת הניסוי, ולאחר מכן לחץ על התחל.

6. ניתוח נתונים

להלן שתי שיטות שונות לניתוח נתונים, בחר תת-סעיף 6.1 אם בוצע סעיף משנה 5.1, או בחר בסעיף משנה 6.2 אם בוצע סעיף משנה 5.2.

1. ניתוח תמונות פאגוציטוזיס שהושגו על ידי מיקרוסקופ זמן-זמן-זמן של תאים חיים
   1. הורד והתקן את תוכנת הקוד הפתוח המומלצת(ראה טבלת חומרים ). פתח את התוכנה.
   2. בתיבה מודולי קלט, בחר תמונות.
   3. מתוך סייר Windows, לפתוח את תיקיית הנתונים, המכיל תיקיות משנה בשם ביקון-1, ביקון-2, וכו '. בחר וגרור את כל התיקיות Beacon לתיבת הרשימה קובץ.
   4. בתיבה מודולי קלט, בחר מטה-נתונים. עבור חילוץ מטה-נתונים?, בחר כן. בתפריט הנפתח לצד שיטת החילוץ של מטה-נתונים, בחר חלץ משמות קבצים/תיקיות. עבור מקור המטה-נתונים, בחר שם תיקיה. לחץ על הזכוכית המגדלת מימין לביטוי רגיל, והקלד ".*[\.*](? P.*)$" בתיבת הטקסט של Regex (לא כולל סימוני הצעת המחיר). לחץ על שלח. ל'חילוץ מטה-נתונים מ-, בחרו 'כל התמונות'. לחץ על עדכן בתחתית המסך. התמונות יקובצו כעת באמצעות משואה.
   5. בתיבה מודולי קלט, בחר שמותסוגים. התהליך הבא יאפשר להקצות תמונות לכל נקודת זמן לערוץ הפלואורסצנטיות הנכון. הקצה שם לכללים תואמי תמונות (תפריט נפתח). בחר את קריטריוני הכלל התואמים לכל (תפריט נפתח) של הכללים הבאים. קובץ (תפריט נפתח), האם (תפריט נפתח), מכיל (תפריט נפתח), DAPI (תיבת טקסט). שם להקצאה לתמונות אלה DAPI (תיבת טקסט). בחרו את סוג התמונה 'אימג e'(תפריט נפתח). קבע טווח עוצמה ממטא-נתונים של תמונה (תפריט נפתח).
   6. בתחתית המסך, לחץ על הוסף תמונה אחרתוחזור על שלב 6.1.5. החלף את DAPI ב- RFP, כך שתמונות ה- RFP יקובצו.
   7. חזור על שלב 6.1.6 עבור תמונות ערוץ CY5.
   8. לחץ על עדכן בתחתית המסך, קבצי התמונה יירשמו כעת בשלוש עמודות שכותרתן DAPI, RFP ו- CY5.
   9. בתיבה מודולי קלט, בחר קבוצות. עבור האם ברצונך לקבץ את התמונות שלך?, בחר כן. בתפריט הנפתח עבור קטגוריית מטה-נתונים, בחר ביקון.
   10. בתיבה מודולי ניתוח, לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על הרווח הלבן כדי לקרוא לרשימה של כל המודולים.
   11. לחץ על הוסף | | עיבוד תמונה משפרי הלחץFeatures. בחר DAPI מהתיבה הנפתחת הראשונה כתמונת הקלט. תן שם לתמונת הפלט כ-"DAPIspeckles". בחר את סוג הפעולה שפר את סוג התכונה כתמים, בגודל תכונה של 20 פיקסלים. בחר באפשרות המהירות והדיוק מהירה/משושה.
   12. צור מודול חדש. הוסף | | עיבוד אובייקטים זההפרימריהאבג'ים. בחר DAPIspeckles מהתיבה הנפתחת הראשונה כתמונת הקלט. תן שם לאובייקטים הראשיים "גרעינים". הזן את הקוטר הטיפוסי של עצמים כ- 10 עד 35 יחידות פיקסלים; ניתן למטב פרמטר זה. בחר את אסטרטגיית הסף Global, שיטת הסף RidlerCalvard, שיטת ההחלקה אוטומטית, ולתת את גורם תיקון הסף כמו 12 עם גבולות נמוכים ועליונות 0-1. שנה את השיטה כדי להבחין בין אובייקטים מגושמים לצורה אך השאר פרמטרים אחרים בהגדרות ברירת המחדל שלהם.
       הערה: גרעיני iPSC-מקרופאג' פולחו בערך בשלב 6.1.12, לאחר שלב עיבוד תמונה שמפחית את הקוטר ומגביר את הניגודיות של הגרעינים. חשוב שרק הגרעינים הבהירים ביותר ייבחרו מכיוון שה- SH-SY5Ys יופיעו כגרעין חלש יותר ויטעו כמו iPSC-מקרופאגים אחרת. כדי להתאים את שיעור הגרעינים שנבחרו, הגדל או הקטן את גורם תיקון הסף. במהלך שלב הבדיקה, השווה את בחירת הגרעינים המתקבלת לתמונת פאזה של המשואה, שם קל להבחין בין iPSC-מקרופאג' ו- SH-SY5Y באמצעות מורפולוגיה של תאים.
   13. צור מודול חדש. הוסף | | עיבוד תמונה CorrectIlluminationCalculate. בחר CY5 מהתיבה הנפתחת הראשונה כתמונת הקלט. תן שם לתמונת הפלט "IllumCY5". ל'בחר כיצד התאורה', בחרו 'רקע' מהתפריט הנפתח. השאר את הפרמטרים האחרים בהגדרות ברירת המחדל שלהם.
   14. צור מודול חדש. לחץ על הוסף | | עיבוד תמונה תיקוןהחלה. בחר CY5 מהתיבה הנפתחת הראשונה כתמונת הקלט. תן שם לתמונת הפלט "CorrCY5". ל'בחר בתאורה',בחרו 'IllumCY5' מהתפריט הנפתח. ל'בחר כיצד התאורה', בחרו 'הפרד' מהתפריט הנפתח.
       הערה: מטרת השלבים 6.1.13-6.1.14 היא לתקן וריאציה בתאורת הרקע של תמונות CY5, שאחרת הייתה מפריעה לפילוח התא הנכון.
   15. צור מודול חדש. לחץ על הוסף | | עיבוד אובייקטים זהה אתSecondaryObjects. בחר CorrCY5 מהתיבה הנפתחת הראשונה כתמונת הקלט. בחרו 'גרעינים' כאובייקטי הקלט. תן שם לאובייקטים המשניים "Mac". בחר את שיטת הזיהוי כמרחק - B. בחר אסטרטגיית סף כללית, שיטת סף RidlerCalvard, שיטת ההחלקה ללא החלקה, ולתת את גורם תיקון הסף כמו 1 עם גבולות נמוכים וגבוהים 0-1. השאר פרמטרים אחרים בהגדרות ברירת המחדל שלהם.
       הערה: שלב פילוח תאים זה עשוי לדרוש מיטוב, על-ידי התאמת גורם תיקון הסף כדי לגדול או לכווץ את גבולות התא. ניתן לשפר את יעילות הפילוח גם על-ידי הגדלת עוצמת הכתמת iPSC-מקרופאגים, או הארת קוביית האור CY5 במהלך ההדמיה.
   16. צור מודול חדש. לחץ על הוסף | | עיבוד תמונה משפרי הלחץFeatures. בחרו RFP מהתיבה הנפתחת הראשונה כתמונת הקלט. תן שם לתמונת הפלט כ-"FilteredRFP". בחר את סוג הפעולה שפר את סוג התכונה כתמים, בגודל תכונה של 15 פיקסלים. ניתן למטב את גודל התכונה. בחר באפשרות המהירות והדיוק מהירה/משושה.
   17. צור מודול חדש. לחץ על הוסף | | עיבוד אובייקטים זההפרימריהאבג'ים. בחר סינוןRFP מהתיבה הנפתחת הראשונה כתמונת הקלט. תן שם לאובייקטים ראשיים "pHr". הזן את הקוטר הטיפוסי של אובייקטים כיחידות של 5-20 פיקסלים. בחר את מדריךאסטרטגיית הסף והקלד סף באופן ידני, למשל, 0.005. שנה את השיטה כדי להבחין בין אובייקטים מגושמים לצורה אך השאר את הפרמטרים האחרים בהגדרות ברירת המחדל שלהם.
       הערה: ה- SH-SY5Ys פולחו בשלב 6.1.17, לאחר שלב עיבוד תמונה המפחית את הקוטר ומגביר את הניגודיות של הפונקטה. זה קריטי לבצע סף ידני, שכן עוצמת הצבע הרגיש pH עולה עם הזמן חלקיקים פאגוציטוס, ואסטרטגיות סף אחרות יהיה לנפח באופן מלאכותי את מספר puncta צבע רגיש pH בנקודות זמן מוקדמות. יש להתאים את הסף הידני עבור כל חזרה ניסיונית עוקבת, באמצעות מצב הבדיקה.
   18. צור מודול חדש. לחץ על הוסף | | עיבוד אובייקטים התייחסו ל-Objects. בחר את אובייקטי הצאצא קלט pHr מהתפריט הנפתח. בחרו ב-Mac של אובייקטי אב הקלט מהתפריט הנפתח. עבור חשב אמצעי אב עבור כל מדידות הצאצא?, בחר כן. אל תחשב מרחקי צאצא-הורה(ללא).
       הערה: שלב 6.1.18 מתייחס לאות הצבע הרגיש ל- pH ל- iPSC-מקרופאגים, ומאפשר מדידה של המספר הממוצע של אובייקטים פאגוציטוס לכל iPSC-מקרופאג'.
   19. צור מודול חדש. לחץ על הוסף | | עיבוד קבצים ExportToSpreadsheet. בחר את מפריד העמודות ככרטיסיה והוסף קידומת עבור שמות קבצים כדי לציין את מספר המשואה. בחר מדידות ספציפיות לייצוא, כפי שצוין להלן (שלבים 6.1.19.1 - 6.1.19.4); השארת פרמטרים אחרים בהגדרות ברירת המחדל שלהם.
       1. | תמונה ספירת | בחירת pHr ו- Mac
       2. | תמונה שם קובץ
       3. | תמונה קבוצה
       4. מק | ילדים | pHr
   20. בתיבה פלט, לחץ על הצג הגדרות פלט. צור תיקיה חדשה בשולחן העבודה עבור ניסוי זה והגדר זאת כתיקיית הפלט המשמשת כברירת מחדל.
   21. שמור את | קובץ הצינור שמור אתProject as....
   22. בדוק ומיטוב הצינור בתמונה מייצגת על-ידי לחיצה על התחל מצב בדיקה בפינה הימנית התחתונה. התוכנית בוחרת באופן אוטומטי את התמונה הראשונה לבדיקה וניתן להציג כל שלב של הצינור על ידי לחיצה על סמלי העין, מה שהופך את הפלט לגלוי ולאחר מכן לחיצה על הפעל. כדי לשנות את המשואה המשמשת לבדיקה, בשורת התפריטים העליונה לחץ על בדיקת | בחרו 'קבוצת תמונות'. כדי לשנות את התמונה (נקודת זמן) בתוך משואה, בשורת התפריטים העליונה לחץ על בדיקת | בחרו 'ערכת תמונות'. פרמטרים שיש למטב מפורטים בשלבים הקודמים.
   23. כאשר אתה מרוצה מהצינור, לחץ על מצב בדיקת יציאה ולחץ על סמלי העין הפתוחה כדי לסגור אותם. שמור את הצינור. לחץ על ניתוח תמונות כדי להתחיל את ניתוח התמונה המלא.
   24. ניתן לפתוח את קבצי הטקסט הנוצרים כגליונות אלקטרוניים עם תוכנת גיליון אלקטרוני מתאימה, והקובץ שכותרתו "תמונה" יכיל שורה עבור כל נקודת זמן של תמונה, כאשר העמודות מייצגות פרמטרים.
       הערה: Count_Mac Count_pHr מייצגים את מספר המקרופאגים של iPSC ואת מספר האובייקטים הרגישים ל- pH שזוהו בתמונה. אל תשתמש בנתונים Count_pHr, שכן הספירה כוללת SH-SY5Ys פלואורסצנטי עמום שלא עברו פאגוציטוס. העמודה Mean_Mac_Children_pHr_Count לוקחת את המספר הממוצע של אובייקטי pHr phagocytosed לכל Mac (שלב 6.1.18 RelateObjects) עבור תמונה בודדת, כלומר, נקודת זמן בודדת של משואה.
   25. סדר את הנתונים כך שכל משואה היא עמודה נפרדת בגיליון האלקטרוני, התמונות המסודרות כשורות בסדר כרונולוגי, עם פרמטרים שונים הכובשים גליונות שונים של חוברת העבודה של הגיליון האלקטרוני.
   26. הכפל את המידות Mean_Mac_Children_pHr_Count ב- Count_Mac, כדי ליצור את הפרמטר מספר כתמים לתמונה. חשב את Count_Mac הממוצע עבור כל ביקון. חלק את מספר הנקודות לתמונה לפי Count_Mac הממוצע עבור משואה זו, יצירת הפרמטר מספר כתמים לתא.
       הערה: שלב 6.1.26 מתקן כל תנודות שגויות שעלולות להתרחש בספירת המקרופאגים של iPSC (Count_Mac), על-ידי נרמול הנתונים לספירת iPSC-מקרופאג' הממוצעת בכל נקודות הזמן של ביקון.
   27. הקצה את הזמן מאז phagocytosis החל (במיני) לכל שורת תמונה.
   28. ליצור אמצעים סטיית תקן עבור לשכפל בארות / משואות. גרף את מספר הנקודות לתא (ציר y) כנגד הזמן (ציר x) כדי לדמיין את קצב הפאגוציטוזיס.

איור 2: פילוח תאים בניתוח פאגוציטוזיס בעל תוכן גבוה. איור להדגמת פילוח טוב לעומת גרוע של מקרופאג' iPSC בסמיכות ל- SH-SY5Y שאינו פאגוציטוס, עם פאגוציטוס שני SH-SY5Y מלא. כאשר שני סוגי התאים מוצגים באפור, גבול התא iPSC-מקרופאג' המסווג על-ידי ניתוח המחשב מסומן בקווים לרמות (כחול). SH-SY5Ys הנספרים כאירועי פאגוציטוזיס מסומנים בירוק או באדום עם קו מיתאר אם אינם נכללים בניתוח. התמונה באמצע מציגה פילוח לקוי; ל- iPSC-מקרופאג' יש תיוג תת-אופטימלי הכולל את ה- SH-SY5Y הלא-פאגוציטוס בתוך גבול התא, אשר ייספר כאירוע פאגוציטוזיס. התמונה מימין מציגה פילוח טוב עקב פרמטרים מחמירים יותר המגדירים את גבול התא iPSC-מקרופאג ', מה שהוביל לכך ש- SH-SY5Y שאינו phagocytosed לא נכלל כראוי בניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. ניתוח של תמונות פאגוציטוזיס שהושגו עם מיקרוסקופ בעל תוכן גבוה
   1. היכנס לתוכנת עיבוד התמונה המומלצת (ראה טבלת חומרים).
   2. בחר את תיקיית שם המסך ותיקיית המשנה של הפעלת ההדמיה מהתפריט הימני. לחץ על סמל ניתוח תמונה (מסך עם זכוכית מגדלת). בחר באר נציג בפריסת הלוח להגדרת צינור הניתוח.
   3. אבן הבניין הראשונה של הניתוח היא תמונת קלט. השאר את הגדרות ברירת המחדל לעיבוד מחסנית(מטוסים בודדים)ותיקון שדה שטוח (ללא). לחץ על הסימן + בפינה השמאלית העליונה של הבלוק, כדי להוסיף את אבן הבניין הבאה ובחר מצא גרעינים.
   4. ב חיפוש גרעינים, הגדר את הערוץ כ- DAPI, את אוכלוסיית ההפחתה כ- None, את שיטת הפילוח כ- C. תיבת פעולת השירות מכילה תפריט נפתח המאפשר למטב את הפרמטר, עם הגדרות עבור הסף המשותף (כלומר, 0.40) והאזור (כלומר, >30 מיקרומטר²). תן שם לאוכלוסיית הפלט "גרעינים". הוסף את אבן הבניין הבאה על-ידי לחיצה על הסימן + ובחר חפש ציטופלסמה.
   5. ב Find Cytoplasm, הגדר את הערוץ כאלקסה 647 ואת השיטה כמו B. תיבת פעולת השירות מכילה תפריט נפתח המאפשר למטב את הפרמטר, עם הגדרות עבור הסף המשותף (כלומר, 0.45) והסף הבודד (כלומר, 0.20). הוסף את אבן הבניין הבאה על-ידי לחיצה על הסימן + ובחר בחר אוכלוסיה.
      הערה: חשוב לייעל כראוי את הפילוח של הציטופלסמה כך שהוא לא יכלול את כל מטוסי ה-SH-SY5Y הסמוכים שלא עברו פאגוציטוס אך אינם שוללים מטען פאגוציטוס (ראו איור 2).
   6. בתיבה בחר אוכלוסיה, שמור על הגדרות ברירת המחדל, שיהיו גרעיניאוכלוסיה , שיטה מסננים נפוצים, שנתון להסרת אובייקטי גבולואוכלוסיית הפלט בשם "גרעינים נבחרים". הוסף את אבן הבניין הבאה על-ידי לחיצה על הסימן + ובחר חשב מאפייני מורפולוגיה.
   7. ב חשב מאפייני מורפולוגיה, הגדר את האוכלוסייה כגרעין שנבחר, האזור לתא, השיטה כסטנדרט. בתפריט הנפתח, ודא שהאזור והעגול נבחרו (μm²). תן שם לאוכלוסיית הפלט "תא מורפולוגיה". הוסף את אבן הבניין הבאה על-ידי לחיצה על הסימן + ובחר בחר אוכלוסיה.
   8. ב באפשרות בחירת אוכלוסיה (2), בחר באפשרות האוכלוסיה 'גרעינים שנבחרו'ואת פעולת השירות 'סנן לפי מאפיינים'. בתיבה הנפתחת תחת מסנן F1, בחר אזור תא מורפולוגיה [μm²]. בחר > מהתיבה הנפתחת מימין והקלד 160 בתיבה שמימין לה. תן שם לאוכלוסיית הפלט "גרעינים נבחרו 2". הוסף את אבן הבניין הבאה על-ידי לחיצה על הסימן + ובחר חפש כתמים.
      הערה: שלב זה אינו כולל תאים מפולחים כראוי, וכל התאים המתים מניתוח נוסף. ייתכן שיהיה צורך לייעל על ידי הגדלת או הקטנת גודל החיתוך.
   9. ב חיפוש כתמים, בחר את הערוץ Alexa 568, אוכלוסיית ROI גרעינים נבחרו 2, תאאזור ROI , שיטה B, ותן שם לאוכלוסיית הפלט "כתמים". ניתן למטב את השיטה, במידת הצורך, באמצעות התפריט הנפתח, עם הגדרות לרגישות לזיהוי (כלומר, 0.20) ורגישות פיצול (כלומר, 0.400). הוסף את אבן הבניין הבאה על-ידי לחיצה על הסימן + ובחר חשב מאפייני מורפולוגיה.
   10. ב חשב מאפייני מורפולוגיה (2), בחר את נקודותהאוכלוסייה , אזור ספוטואת פעולת השירות רגיל. בתפריט הנפתח, ודא שהאזור והעגול נבחרו (μm²). תן שם למאפייני הפלט "נקודת מורפולוגיה". הוסף את אבן הבניין הבאה על-ידי לחיצה על הסימן + ובחר בחר אוכלוסיה.
   11. בבחירת אוכלוסיה (3),בחר את נקודות האוכלוסייה ואת פעולת השירות סנן לפי מאפיינים. בתיבות הנפתחות תחת מסנן F1, בחר אזור ספוט [px²], >, 20. בתיבות הנפתחות תחת מסנן F2, בחר אזור ספוט [px²], <, 2500. בתיבות הנפתחות תחת מסנן F3, בחר מעוגלות ספוט מורפולוגית, >, 0.6. בתיבות הנפתחות תחת מסנן F4, בחר ספוט לעוצמת אזור, >, 2.5. תן שם לאוכלוסיית הפלט "כתמים נבחרו". הוסף את אבן הבניין הבאה על-ידי לחיצה על הסימן + ובחר בחר אוכלוסיה.
       הערה: בחירת הספוט האוטומטית תפלח כתמים פלואורסצנטיים זעירים רבים הנובעים מגופים אוטופלואורסצנטיים בתוך המקרופאגים של iPSC. שלב זה נועד לסנן גופים autofluorescent על ידי החלת חתכים מחמירים על האזור, העגולות, ועוצמת הכתמים, ועשוי לדרוש אופטימיזציה מסוימת.
   12. בבחירת אוכלוסיה (4),בחר באפשרות גרעין האוכלוסייה שנבחר 2 ואת פעולת השירות סנן לפי מאפיינים. בתיבות הנפתחות תחת מסנן F1, בחר מספר כתמים, >, 0.5. תן שם לאוכלוסיית הפלט "ספוט תאים חיוביים". הוסף את אבן הבניין הבאה על-ידי לחיצה על הסימן + ובחר הגדר תוצאות.
   13. בהגדרת תוצאות, בחר את השיטה הראשונה כרשימת יציאות. הגדרת ברירת המחדל היא עבור מספר האובייקטים שיחושב עבור כל אוכלוסייה. לחץ על התפריט הנפתח עבור אוכלוסיה: גרעינים נבחרו 2 וודא שמספר האובייקטים מסומן, ובתפריט הנפתח החל על הכל בחר הכל. עבור התא החיובי של ספוטבאוכלוסייה , ודא שמספר האובייקטים מסומן. עבור האוכלוסיות האחרות, אין צורך לדווח על כל הפרמטרים. בחר את השיטה השניה כפלט נוסחהוהקלד את הנוסחה (a/b)*100. בחרו כמשתנה תא חיובי ספוט- מספר עצמים,ומשתנה B בחרו 'גרעינים נבחרו 2- מספר אובייקטים' . תן שם לפלט כ"ספוט תאים חיוביים (%)".
   14. שמור את הצינור: לחץ על הסמל שמור ניתוח בדיסק (תקליטון עם חץ למטה).
   15. לחץ על הסמל ניתוח אצווה (משפך וסמל גלגלי שיניים לאורך החלק העליון של המסך). מהתיקיות הניסיוניות מימין, בחר את קובץ הנתונים הגולמי, שאמור לעדכן את מספר המדידות שנבחרו ל- 1. באזור אפשרויות ניתוח, לחץ על התפריט הנפתח עבור שיטהובחר ניתוח קיים. לחץ על ... סמל לצד קובץ Script, וחפש את קובץ הניתוח שנשמר (סיומת .aas). לאחר מכן, לחץ על החץ הירוק לצד התחל ניתוח. ניתן לעקוב אחר התקדמות הניתוח על ידי לחיצה על מצב משימה (בפינה השמאלית העליונה של המסך).
   16. לאחר השלמת הניתוח, לחץ על הכרטיסיה ייצוא, בחר את תיקיית הניסוי ובחר תיקיית יעד. השאר את הגדרות ברירת המחדל, המייצאות נתונים אך לא תמונות TIFF, ומתחילות בייצוא.
   17. פתח את הקובץ שהורד כגליונות אלקטרוניים בתוכנת גיליון אלקטרוני מתאימה. הבארות מסודרות בשורות ובפרמטרים בעמודות. בחר את הנתונים בעמודות שכותרתן תאים חיוביים ספוט (%), גרעינים נבחרו 2 - מספר כתמים - ממוצע לבאר, ו- Nuclei נבחר 2 - אזור ספוט כולל - ממוצע לבאר, והעתק אותם לגיליונות אלקטרוניים טריים עבור כל פרמטר. חשב את ממוצע הפרמטר עבור בארות משוכפלות של כל תנאי וגרף בהתאם לצורך.

7. בדיקת בקרת איכות להומוגניות של SH-SY5Ys קבוע

1. לאסוף aliquot של SH-SY5Ys חי מהשלב 2.2 ו resuspend במאגר כריכת הסיפוח מתוך ערכה עבור להכתמת V-FITC annexin (ראה טבלה של חומרים) בריכוז של כ 200,000 תאים למ"ל.
2. לאסוף aliquot של SH-SY5Ys קבוע מהשלב 2.4 ו resuspend במאגר כריכת סיפוח בריכוז של כ 200,000 תאים למ"ל.
3. הכן שתי מבחנות עם 5 μL של נספח V-FITC ו 5 μL של יוד פרופידיום (ראה טבלה של חומרים). הוסף 500 μL של SH-SY5Ys חי לצינור אחד, ו 500 μL של SH-SY5Ys קבוע לשני.
4. הכן שלושה צינורות בקרה: אחד עם 5 μL של נספח V-FITC, אחד עם 5 μL של יוד propidium, וצינור אחד ריק. ערבבו יחד יחס של 1:1 של SH-SY5Ys חיים וקבועים והוסיפו 500 מיקרו-אל של זה לכל צינור בקרה.
5. מערבבים צינורות בעדינות על ידי צנרת. דגירה בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות, מוגנת מפני האור.
6. מיד למדוד על cytometer זרימה(Ex = 488 ננומטר; Em = 530 ננומטר) באמצעות גלאי אותות FITC (בדרך כלל FL1) עבור נספח V-FITC, וגלאי אותות פליטת פיקוריתרין (בדרך כלל FL2) עבור יוד פרופידיום.
7. השתמש בכל תוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה כדי להציג התוויות נקודה של אות FITC vs PI ולהשתמש בכלי gating מלבני כדי לבחור את האוכלוסייה הכפולה שלילית. בתוך האוכלוסייה הכפולה שלילית, להציג FSC לעומת SSC ולהשתמש בכלי gating מצולעים כדי ליצור שער הדרה סביב האוכלוסייה עם FSC נמוך מאוד SSC, אשר מסווג כמו פסולת ולכן לא נכלל ניתוח נוסף. הצג את האירועים הנותרים כאות FITC vs PI והשתמש בפקדים המוכתמים הבודדים והבלתי נגועים כדי להגדיר שער רבעים לאירועי FITC-/PI, FITC+/PI-, FITC -/PI+, ו-FITC+/PI+.
   הערה: הימנע מטיפול גס, מערבולת או דגירה ארוכה עם SH-SY5Ys חי, אשר יכול לגרום באופן מלאכותי פוספטידילסרין להציג. המשך לציטומטריה זורמת ללא דיחוי. תוצאה רצויה היא כי שיעור FITC-/PI- אירועים הוא <5% ב SH-SY5Ys קבוע. תוצאות מייצגות מוצגות באיור S1 משלים.

תוצאות

הדמיית זמן לשגות של תאים חיים בוצעה באמצעות הפרוטוקול שתויג בעבר, עם מקרופאגים מסוג iPSC מסוג פראי שנזרעו ב-20,000 תאים לבאר. כמויות שונות של SH-SY5Ys הוחלו (10,000-30,000 לבאר, מוערך מספירת התאים בשלב 3.1), ואת מעכב הפגוציטוזיס ציטואצ'אלסין D היה דגירה מראש (1 שעות) עם כמה בארות, מתנהג כמו בקרה כדי לעכב phagocytosis עבור כל כמות של SH-SY5Ys. ההדמיה החלה 40 דקות לאחר הוספת SH-SY5Ys ותמונות נלכדו במרווחים של 5 דקות למשך 3 השעות הבאות (הנתונים כוללים את העיכוב הראשוני של 40 דקות). סרטון ייצוגי של זמן לשגות נכלל בנתונים המשלימיםוניתח נתונים כמותיים המוצגים באיור 3. עם כמות של 10,000 SH-SY5Ys לבאר, מספר החלקיקים phagocytosed (כתמים) לתא גדל ליניארית עם הזמן, היה מעוכב על ידי כ 50% על ידי ציטוצ'אלסין D. העיכוב על ידי cytochalasin D היה חלש מהצפוי, ככל הנראה נגרם על ידי שכפולים טכניים או ביולוגיים מספיקים, כמו רק באר אחת לכל תנאי היה בתמונה עם שלושה שדות תמונה. עם כמויות גבוהות יותר של SH-SY5Ys לבאר (20,000 ו 30,000), phagocytosis הפגין ליניאריות ירודה, ככל הנראה בשל פילוח לקוי של iPSC-מקרופאגים ו SH-SY5Ys בשדה ראייה צפוף יותר.

הדמיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים בוצעה באמצעות הפרוטוקול שתווה בעבר, עם מקרופאגים מסוג iPSC-macrophages מסוג בר ב-20,000 תאים לבאר, מספר כמויות שונות של SH-SY5Ys (10,000-80,000 לבאר), ולוח ה- Assay תוקן וצוות התמונה לאחר 5 שעות. תמונה מייצגת של פאגוציטוזיס מוצגת באיור 4A, והנתונים המנותחים המוצגים באיור 4B¹⁷. הגדלת כמות SH-SY5Ys הביאה למספר גבוה יותר של חלקיקים פאגוציטוס (כתמים) לתא; עם זאת, הכפלה של כמות SH-SY5Y מובילה רק לעלייה של פי 1.5 במספר הנקודות לתא. זה מצביע על כך שהסכומים שנבדקו אינם מגבילים את הקצב לפגוציטוזיס. לאחר מכן, בדיקה של פאגוציטוזיס הדמיה בעלת תוכן גבוה אומתה באמצעות מספר מעכבים של פאגוציטוזיס (איור 4C)¹⁷. מעכבי פילמור אקטין ציטוצ'לאסין D ו jasplakinolide עכבות באופן משמעותי פאגוציטוזיס על ידי 91% ו 90%, בהתאמה, כאשר דגירה מראש במשך 1 שעה לפני phagocytosis. Z' החזק של ה- assay כאשר ציטוצ'אלסין D או jasplakinolide משמשים פקדים שליליים מחושב כמו 0.7 ו 0.8, בהתאמה²⁰. מעכב החמצת ליזוזום bafilomycin A1 הפחית באופן משמעותי פאגוציטוזיס על ידי 31%, כאשר דגירה 1 שעה לפני phagocytosis. ההשפעה החלשה יותר של מעכב החמצת ליזוזום לעומת מעכבי אקטין מצביעה על כך שזיהוי המטען המופנם עשוי שלא לדרוש החמצה מלאה של הפאגום. סיפוח רקומביננטי V שימש כפקד כדי לחסום במיוחד פוספטידילסרין שנחשף על פני השטח של SH-SY5Ys, מניעת קולטנים פאגוציטים מגישה לליגנד, אות חשוב "לאכול אותי". תוספת של סיפוח רקומביננטי V הפחיתה באופן משמעותי את הפאגוציטוזיס ב -30%, כאשר מוסיפים לבארות מיד לפני תוספת SH-SY5Y. קבוע SH-SY5Ys אושר לחשוף פוספטידילסרין, באמצעות גשושית סיפוח פלואורסצנטי V, ואילו SH-SY5Ys חי היו שליליים עבור כתמי סיפוח V(איור 4D).

קולטן הפגוציטוזיס המיקרוגליאלי TREM2 הוכח בעבר כחשוב עבור פאגוציטוזיס של נוירונים אפופוטוטיים²¹. מוטציה R47H של TREM2 הוא גן סיכון לתגלה מאוחרת של מחלת אלצהיימר, והוא משוער כדי להפחית את כריכת ליגנד של TREM2²³. במטרה להעריך את התפקוד הפגוציטי של R47H TREM2 ו- TREM2 KO, בדיקת הפגוציטוזיס בעלת התוכן הגבוה של התא הקבוע בוצעה באמצעות קווי iPSC-מקרופאגים איזוגניים עם WT/ R47H / KO TREM2¹⁷. נבדקו מספר אורכים של משך הפגוציטוזיס מ 1 עד 5 שעות, באמצעות תוספת מדהימה של מטען פאגוציטי (40,000 SH-SY5Ys). האות המתקבל עולה באופן ליניארי ל-4 שעות, ומתייצב מעט ב-5 שעות(איור 5)^17. שיעור phagocytosis מופחת וקיבולת (% תאים חיוביים נקודתיים) ניכר TREM2 KO לעומת WT, בעוד מוטציה R47H TREM2 לא הראה פאגוציטוזיס שונה. הפגוציטי פגוציט בתאי TREM2 KO אינו פנוקופי על ידי מוטציה R47H TREM2, לכאורה משום שתפקוד TREM2 מספיק כדי לתמוך בפגוציטוזיס רגיל.

איור 3: נתונים לדוגמה לבדיקת פאגוציטוזיס בזמן של תאים חיים. ספיגת SH-SY5Ys מתים על ידי סוג פראי iPSC-מקרופאגים BIONi010-C (מזהה ECACC: 66540023) בתמונה במרווחים של 5 דקות למשך 3 שעות. הזמנים המוצגים בגרף הם מייזום של פאגוציטוזיס, כולל 40 הדקות הראשונות ללא מדידה. המספר הממוצע של כתמים לתא משלוש בארות משוכפלות משורטטים. Phagocytosis של 10,000 SH-SY5Ys מעוכב עם 10 μM ציטוצ'לאסין D עם 1 שעות טרום טיפול, בעוד כמויות גבוהות יותר של SH-SY5Ys (20,000 ו 30,000) יש כימות תת-אופטימלי של פאגוציטוזיס. ממוצע ± סטיית תקן (SD), N = 1 ניסוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: אופטימיזציה ואימות של בדיקות פאגוציטוזיס בעלות תוכן גבוה בתאים קבועים. (A)תמונת מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה מייצגת של SH-SY5Ys phagocytos המופקת על ידי BIONi010-C מסוג iPSC-מקרופאגים (מזהה ECACC: 66540023). נקודת זמן של 3 שעות עם 40,000 SH-SY5Ys מוצגת. ערוצי פלואורסצנטיות ממוזגים, עם כתם iPSC-מקרופאג' המוצג כאותום, גרעינים כחולים ו- SH-SY5Ys כצהוב. החלונית inset היא מקטע של התמונה מוגדל 3x. (B) מספר כתמים לכל תא של SH-SY5Ys מת phagocytos לאחר 5 שעות, באמצעות כמויות שונות של תוספת מטען iPSC-מקרופאגים מסוג פראי. ממוצע ± שגיאה סטנדרטית של הממוצע (SEM), עבור N = 3 קציר. (C)פאגוציטוזיס (3 שעות) מעוכב עם 10 μM ציטוצ'אלסין D (Cyt), 1 μM bafilomycin A1 (Baf), 1 μM jasplakinolide (עם 1 שעות טרום טיפול; Jas), ו 13 מיקרוגרם / מ"ל רקומביננטי נספח V (הוסיף בו זמנית SH-SY5Ys מת; אן). iPSC-מקרופאגים ללא SH-SY5Ys נוספו שימשו כפקד שלילי (-ve), והפקד החיובי (+ve) אינו מטופל iPSC-מקרופאגים עם SH-SY5Ys נוסף. הנתונים נוטרמלו לממוצע לחזרת הניסוי. פירושו ± SEM, עבור N = 3-6 יבולים ועם שני קווי תאים מסוג בר (SFC840-03-03, האפיון של קו זה מתואר ב ( פרננדס ואח^'21 ו BIONi010-C). ANOVA בכיוון אחד עם הבדיקה שלאחר הוק של דאנט, השוואות לתאים לא מטופלים. * p < 0.05, ***p < 0.001. (D)כתם SH-SY5Ys קבוע טרי באופן אחיד לתצוגת פוספטידילסרין (annexin V-FITC) ויש להם חדור תאים מוגבל (יודיד פרופידיום). SH-SY5Ys חיים אינם מכתימים עבור נספח V-FITC או פרופידיום יודיד, למעט כתמי מוקד הקיימים על התאים המתים המעטים בתרבית. הנתונים משוחזרים באישור ממחקר אלצהיימר וטיפול¹⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: פאגוציטוזיס מופחתת ב- TREM2 KO אך לא ב- R47H TREM2 iPSC-מקרופאגים. בדיקות פאגוציטוזיס בעלות תוכן גבוה שבוצעו עם 40,000 SH-SY5Ys לבאר עם תוספות מדהימות. האמצעים היו כימותו עבור הפרמטרים: מספר כתמים לתא, סכום אזורי ספוט (μm²) לתא, ואחוז התאים המכילים חלקיקים phagocytosed לכל שדה. הנתונים היו מנורמלים למשמעות של כל גנוטיפ לניסוי. ממוצע ± SEM, עבור N = 3 יבולים. ANOVA דו-כיווני חוזר, המבחן שלאחר ההוק של Dunnett, השוואות זוגיות ל- WT עבור כל פעם: *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001. הנתונים משוחזרים באישור ממחקר אלצהיימר וטיפול¹⁷. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: QC לדוגמה להכנת SH-SY5Ys. SH-SY5Ys מנותקים תוקנו במשך 10 דקות עם 0% (תאים חיים), 1%, ו 2% של paraformaldehyde (PFA), ולאחר מכן שטף. התאים הוכתמו באגף V-FITC ו-propidium iodide (PI) ונמדדו מיד על ידי ציטומטריית זרימה. התוויות נקודות צפיפות צבע נוצרו בתוכנת ניתוח ציטומטריית זרימה, באמצעות הפקדים המוכתמים הבודדים והבלתי מזוהמים כדי להציב שער רבע. לרבעים יש ביאורים עם אחוז האירועים בתוך הרביע הזה. תאים חיים הם בעיקר ברבעון הרביעי, ותאים קבועים הם בעיקר ברבעון השני. Q1 = annexin V-/PI-, Q2 = annexin V+/PI+, Q3 = annexin V+/PI-, Q4 = annexin V-/PI- (תאים חיים). נא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

וידאו משלים: פאגוציטוזיס בזמן-זמן-זמן-תא חי. וידאו מייצג של SH-SY5Ys phagocytosed על ידי סוג פראי iPSC-מקרופאגים BIONi010-C (מזהה ECACC: 66540023). התמונות צולמו כל 5 דקות במשך 3 שעות. הווידאו נחתך ופועל במהירות של 3 פריימים לשנייה, ומראה את 1.5 השעות האחרונות של ה-assay. ה-SH-SY5Ys המוכתמים בצבע רגיש לחומצה מוצגים באדום ועוצמת האות עולה עם החמצה פאגוזום. גרעיני תאים מוכתמים בהוכסט 33342 מוצגים בכחול. אנא לחץ כאן כדי להוריד וידאו זה.

Discussion

למיקרוגליה יש פונקציות חשובות המשפיעות על ייזום והתקדמות של מחלות ניווניות, כולל פאגוציטוזיס של נוירונים אפופטוטיים. פגוציטוזיס מיקרוגליאלי לקוי ופגוציטוזיס לא הולם של סינפסות קושרו שניהם למחלות ניווניות, אם כי המנגנונים הבסיסיים והסיבתיות אינם מובנים היטב^4,23. מאמר זה מתאר פתגם אסאי כדי למדוד פאגוציטוזיס של תאים אפופטוטיים על ידי iPSC-מקרופאגים, עם קריאת הדמיה בזמן-זמן של תאים חיים או מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה של תאים קבועים, או שילוב של שניהם על בסיס אחד. רב-תכליתיות זו פירושה שניתן להשתמש בבדיקה כדי לחקור אירועים פאגוציטיים בודדים לאורך זמן בכמה בארות או לשמש להקרנה בתכולה גבוהה עם תנאים או טיפולים מרובים. מכיוון שההתוכן הגבוה קבוע בנקודת זמן אחת, ניתן להכין לוחות צ'ק מרובים בו זמנית. לבדיקה בעלת התוכן הגבוה יש תועלת פוטנציאלית לאפיון מקרופאגים/מיקרוגליה עם וריאנטים גנטיים הקשורים למחלות או סינון מעכבי מולקולות קטנות לשינויים בפגוציטוזיס. ניתן גם להתאים את הבחינה בקלות לחקר פאגוציטוזיס של מודלים אחרים של מיקרוגליה, או אסטרוציטים פוטנציאליים. ניתן לבצע את ההבחנה של פאגוציטוזיס עם כתמי הדמיה של תאים חיים, למשל, מיטוכונדריה, סידן או ROS, וניתן לבצע כתמים אימונופלואורסצנטיים לאחר קיבעון לחלבונים בעלי עניין. בהשוואה לתפיסות פאגוציטוזיס קיימות המשתמשות בתאים עצביים אפופטוטיים, היתרונות העיקריים שפרוטוקול זה מעניק הם שהכנת המטען הפאגוציטי היא פשוטה ומהירה יחסית, ותוצאותיה מוצר אחיד. הבדיקות האחרות גורמות לאפופטוזיס של נוירונים או SH-SY5Ys עם S-nitroso-L-ציסטאין עבור 2 h²⁵, חומצה אוקדאית עבור 3 שעות²², staurosporine עבור 4-16 שעות^26,27,28,29 או UV-הקרנה עבור 24 שעות³⁰, והוא יכול לגרום לתאים בשלבים שונים של אפופטוזיס. יתר על כן, הדמיית תאים חיים וקריאות הדמיה בעלות תוכן גבוה לא תוארו בעבר, ככל הידוע למחברים. המגבלה העיקרית של שימוש בתיקון paraformaldehyde כדי להכין את המטען הפאגוציטי היא שהוא אינו מסכם באופן מלא את תהליך האפופטוזיס, שכן הקיבעון מונע מהתאים להתפצל לגופים אפופוטוטיים, אשר צפויים להיות phagocytosed מהר יותר בשל גודלם הקטן יותר. לא ידוע איזו השפעה יש קיבעון על הפרשת אותות "מצא אותי" נוקלאוטיד (למשל, ATP, UDP) מתא היעד המושכים פאגוציטים. בדומה לתאים אפופטוטיים, SH-SY5Ys הקבועים מציגים כמה קרום חלחול פרופידיום יודיד. קרום מחלחל קשור לשחרור של אותות "מצא אותי"; עם זאת, זה לא נחקר ב SH-SY5Ys קבוע, ואם הנוקלאוטיד משתחרר מהר מדי, הם יישטפו לפני SH-SY5Ys מתווספים iPSC-מקרופאגים.

השלב הקריטי הראשון בפרוטוקול הוא כתמים של SH-SY5Ys מת עם אסתר STP של צבע פלואורסצנטי אדום רגיש ל- pH. צבע זה מגיב במהירות ובקובלנטיות עם אמינים ראשוניים בחינם על פני השטח של SH-SY5Ys המת. משך הכתמים לא צריך להיות ממוטב; עם זאת, יש להקפיד על טיפול בצבע לפני התיוג. אין לבצע את תגובת התיוג במאגרים המכילים אמינים בחינם. יתר על כן, קיים סיכון של משקעים אם מניית DMSO מדוללת במאגר מימי קר או בריכוז סופי גבוה. משקעים יופיעו כאובייקטים כהים צפופים מתחת למיקרוסקופ. בנוסף, תמיסת הצבע הרגישה ל-pH נדבקת לצינורות צנטריפוגות פלסטיק רגילים ונשטפת לאט; לכן, צינורות כריכה נמוכה מומלצים עבור שלב התיוג. שימוש בצבע רגיש ל-pH, במקום צבע פלואורסצנטי לצמיתות, מסייע לזיהוי חלקיקים נבלעים, לעומת חלקיקים השכנים לקרום הפלזמה. מכיוון שיש פלואורסצנטיות מסוימת ב- pH נייטרלי, יש לשמור על צפיפות המטען הפגוציטי ו- iPSC-מקרופאגים נמוכים מספיק עבור פילוח מדויק, אם כי גבוה מספיק כי אירועים פאגוציטיים רבים נתפסים. מיקרוסקופיה בעלת תוכן גבוה הייתה מסוגלת לזהות במדויק פאגוציטוזיס עם צפיפות בינונית של מטען בבאר (יותר מ-2 SH-SY5Ys ל-iPSC-מקרופאג'). לעומת זאת, בשל רגישות חלשה יותר של המיקרוסקופ בספקטרום האדום העמוק, פילוח iPSC-מקרופאגים בנתוני ההדמיה של זמן לשגות של תאים חיים היה פחות בטוח והיה צורך להשתמש בצפיפות נמוכה מאוד של מטען כדי להפחית את הסבירות לחיוביות שגויות (1 SH-SY5Y עבור כל שני iPSC-מקרופאגים). אימות של פילוח נכון וצפיפות מטען צריך להתבצע עם השוואות בין בארות מטופלות וציטוצ'לאסין D טופלו. בבחינה ממוטבת היטב, ציטוצ'לאסין D אמור להפחית את מספר הנקודות הממוצע לתא ב-90% ביחס לדגימות שלא טופלו.

צעד קריטי נוסף בפרוטוקול הוא כתמי iPSC-מקרופאגים, המאפשר לזהות ולפלח את התא בניתוח תמונה כך שכל SH-SY5Ys חיצוניים לא ייכללו בספירה. הצבע המומלץ הוא חדור לתא, מומר למוצר פלואורסצנטי בלתי מסיס בתוך הציטופלסמה, ניתן לתיקון ולא רעיל (ראה טבלת חומרים). שלב ההכתמה היה ממוטב לשימוש iPSC-מקרופאגים עם phagocytosis הדמיה תוכן גבוה, ואנחנו מציעים שזה צריך להיות אופטימיזציה מחדש אם סוגים אחרים של תאים משמשים. ניתן להגדיל את משך הכתמת התא כדי לשפר את התצהיר של המוצר הפלואורסצנטי המסיס בתוך התאים. אם ריכוז הצבע מותאם, יש לנקוט זהירות כדי למנוע רמות רעילות של רכב ממס אורגני.

הגורם הקריטי השלישי להצלחת הבדיקה הוא ניתוח הנתונים. צינורות הניתוח המסופקים נועדו להיות של הדרכה ולא תיאורית מראש, כמו הבדלים בעוצמה מכתימה או מורפולוגיה של תאים יכול להפחית את האפקטיביות של פילוח של הצינורות כפי שנכתב. לפיכך, יידרשו מיטובים מסוימים, עם בדיקת הצינור בפקדים חיוביים ושליליים מתאימים, והפרמטרים שיש למטב מצוינים בטקסט הפרוטוקול. פקדים שליליים צריכים לכלול מצב שבו iPSC-מקרופאגים מטופלים מראש עם מעכב פאגוציטוזיס חזק כגון ציטוצלסין D לפני תוספת של SH-SY5Ys. שליטה שלילית אפשרית נוספת היא תוספת של SH-SY5Ys לבארות שלא טופלו בעבר של iPSC-מקרופאגים בסוף בדיקה, 10 דקות לפני הקיבעון, המאפשר קצת התיישבות של המטען אבל הוא קצר מדי עבור כמות ניכרת של phagocytosis להתרחש. אירוע פאגוציטוזיס מוגדר כאובייקט פלואורסצנטי אדום בתוך גבולות iPSC-מקרופאג ', המוגדר על ידי אלגוריתם התוכנה באמצעות ערוץ הפלואורסצנטיות האדום העמוק. אם הפילוח של התאים גרוע(איור 2),SH-SY5Ys רבים שאינם פאגוציטוס בסמיכות ל- iPSC-מקרופאגים עשויים להיכלל בטעות בניתוח, כלומר, תוצאות חיוביות שגויות. הגורם החשוב ביותר להשגת פילוח טוב הוא תיוג מחמיר של iPSC-מקרופאגים. פילוח עבור שני ניתוחים הוא אוטומטי, ולכן לא ניתן להשיג פילוח מושלם עבור כל תא; עם זאת, ניתן להתאים מספר פרמטרים כדי להפוך את הפילוח לאופטימלי יותר, תוך שימוש בכמה תמונות בדיקה כהפניה. בקרת Cytochalasin D חשובה להערכת פילוח אופטימלי מכיוון שמספר גבוה של אירועים פאגוציטיים שזוהו במצב זה מצביע על כך שהפילוח הוא תת אופטימלי. אופטימיזציה של צינור ניתוח הנתונים צריך לחזור באופן אידיאלי עד מספר האירועים הפאגוציטיים לתא הוא 80%-90% נמוך יותר במצב ציטוצלסין D לעומת אין מעכב.

הבעיות עם בדיקת phagocytosis כי הם הסבירים ביותר להתרחש הם: (1) פלואורסצנטיות חלשה רגישה ל- pH בבקרות חיוביות, (2) התפלגות דלילה או לא אחידה של מקרופאגים בסוף הבדיקה, או (3) מספרים גבוהים של חיובי שווא בניתוח מ SH-SY5Ys שאינם פאגוציטוס. פתרון בעיות של פלואורסצנטיות חלשה רגישה ל- pH צריך קודם כל לבדוק כי הכתם של SH-SY5Ys הביא גלולה תא עם צבע מגנטה חזק. אם הצבע חלש, ודאו שנעשה שימוש במלאי צבע טרי, ודאו כי מאגר התיוג נקי ממין, הוסיפו שטיפה נוספת ל-SH-SY5Y לפני הכתמים, בדקו אם המספר הנכון של SH-SY5Ys הוכתם, ודאו כי אין משקעים בצבע כראיות, ומיטבו את ריכוז התיוג של הצבע. אם ה-SH-SY5Ys מוכתמים מאוד, בדקו אם הריכוז שנוסף ללוח הבדיקה נכון, וודאו שה-iPSC-מקרופאגים בריאים ולא ישנים מדי. הסוג השני של בעיה, התפלגות מקרופאגים לא אחידה, יכול לנבוע מאובדן תאים במהלך צנרת ויש לנקוט צעדים כדי להפחית את כוחות הצינורות שחווים התאים, הימנעות טיפים צרים נשא. אם הבעיה נשארת, צמצם את זמן הדגירה של טעינת iPSC-מקרופאגים עם צבע מחלחל לתא. הבעיה השלישית, לגבי הכללה שגויה של חלקיקים שאינם phagocytosed בניתוח, עולה כי דרוש אופטימיזציה נוספת של צינור הניתוח. פתרון הבעיות צריך להתמקד תחילה בפילוח תאים ואם התוכנה כוללת אובייקטים סמוכים. פרמטרים ספציפיים שניתן להתאים מוצעים בהערות שמתחת לשלבים הרלוונטיים (שלבים 6.1.11-6.1.15 לניתוח זמן לשגות בתא חי ושלבים 6.2.4-6.2.8 לניתוח תוכן גבוה). אם לא ניתן לשפר עוד יותר את פילוח התאים, לניתוח התוכן הגבוה יש שלב נוסף (שלב 6.2.8) שאינו כולל מקרופאגים iPSC-מקרופאגים מפולחים באופן לא תקין. יתר על כן, ניתן למטב את המודול המסנן כתמים מקובלים של פלואורסצנטיות רגישה ל- pH בתוך iPSC-macrophages, להגדיל את עוצמת הסף של אובייקטים מקובלים, אשר אמור לעזור לא לכלול SH-SY5Ys שאינם phagocytosed (שלב 6.1.17 עבור ניתוח זמן לשגות זמן של תאים חיים, ושלב 6.2.11 לניתוח תוכן גבוה).

פיתחנו שני סוגים של קריאת מיקרוסקופיה לבדיקת הפאגוציטוזיס שלכל אחד מהם יש יתרונות ומגבלות. להדמיה בזמן של תאים חיים יש את היתרונות של מתן מידע נוסף על קינטיקה של פאגוציטוזיס והיא זמינה באופן נרחב יותר מאשר פלטפורמות הדמיה בעלות תוכן גבוה. תוכנת הקוד הפתוח המומלצת היא אגנוסטית למקור המיקרוסקופ וניתן להשתמש בה עם כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי באיכות טובה, עם או בלי יכולת זמן של תאים חיים. המגבלה העיקרית של הדמיית התא החי היא רגישות מוגבלת ואופטיקה, מה להפוך את זה מאתגר יותר לזהות ולבצע פילוח טוב של iPSC-מקרופאגים. ניתן להקל על מגבלה זו על-ידי הגדלת משך הכתמת iPSC-מקרופאגים, או על-ידי מעבר למיקרוסקופ רגיש יותר, אם הוא זמין. בדיקת phagocytosis הדמיה בעלת תוכן גבוה היא הקריאה המומלצת אם קיימת מערכת הדמיה בעלת תוכן גבוה. מערכות הדמיה בעלות תוכן גבוה מאפשרות תפוקה גבוהה יותר ונתונים אמינים יותר, ומאפשרות שימוש בבדיקה זו להקרנה, שבה צפוי Z חזק של ≥0.7 עבור פלט "מספר המקומות לתא"²⁰. בהשוואה לשיטת זמן ההפוגה של התא החי, לקריאת המיקרוסקופיה בעלת התוכן הגבוה יש רגישות גבוהה יותר, רמה גבוהה יותר של אוטומציה ומהירות, ניתן לעבד יותר בארות ושדות הדמיה, ותמונות קונפוקליות ברזולוציה גבוהה מיוצרות. פילוח תאים יעיל יותר עם תמונות טובות, וסגמנטציה נעזרת בנוסף בתוכנת ניתוח הדמיה בעלת תוכן גבוה המספקת שיטות פילוח תאים רבות יותר המתאימות לתאים בעלי צורה חריגה ביותר. תוכנת ניתוח הדמיה בעלת תוכן גבוה חישבה גם פרמטרים נוספים של פאגוציטוזיס, בהשוואה לתוכנת הקוד הפתוח, כגון אחוז התאים הפאגוציטים. המגבלה העיקרית של בדיקת phagocytosis תוכן גבוה היא אחת של עלות ונגישות של מערכת ההדמיה ותוכנת ניתוח.

לסיכום, phagocytosis כמותי assay המוצג במאמר זה הוא כלי שימושי עבור מודל מיקרוגליה phagocytosis של נוירונים מתים במבחנה. המיקרוגליה מעוצבת על ידי iPSC-מקרופאגים והנוירונים המתים מעוצבים על ידי SH-SY5Ys קבוע paraformaldehyde. אמנם לא המיקרוגליה האותנטית ביותר ומודלים נוירונים מתים / אפופטוטיים שפורסמו, אלה קלים להכנה מדרגית. ה- assay עצמו הוא רב-תכליתי ביותר, עם שני סוגים של קריאת הדמיה מפורטת, ויש לו פוטנציאל להיות מותאם לשימוש עם מודלים שונים של מיקרוגליה / מקרופאג 'מונוקולטורה, או סוג תא אחר לשמש כמטען פאגוציטי. קריאת ההדמיה בעלת התוכן הגבוה מועילה להשגת נתונים כמותיים וניתן להרחיב אותה עד לבדיקת אפננים של מולקולות קטנות של פאגוציטוזיס, או וריאנטים גנטיים של מסך ב- iPSC-מקרופאגים. עם זאת, מכיוון שמערכות הדמיה בעלות תוכן גבוה יקרות וכבדות נתונים, קריאה חלופית להדמיה נכללה בפרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ זמן לשגות בתא חי, אשר ניתן להחליף כל מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי באיכות טובה, במידת הצורך.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL conical centrifuge tube	Falcon	352096	For centrifugation of cells
2-20 µL, 20-200 µL, 100-1000 µL single-channel micropipettes
2-mercaptoethanol 50 mM	Gibco	31350010	Component of Factory media
4% paraformaldehyde in PBS	Alfa Aesar	J61899	For fixation of cells
6-well plate, tissue culture treated
AggreWell-800 24-well plate	STEMCELL Technologies	34815	Microwell low-adherence 24-well plate for formation of embryoid bodies
Annexin V-FITC Apoptosis Staining / Detection Kit	Abcam	ab14085	Kit for annexin V-FITC staining , as an assay for quality control of fixed SH-SY5Ys. Kit contains annexin binding buffer, annexin V-FITC, and propidium iodide.
Automated cell counter
Benchtop centrifuge
Benchtop microcentrifuge
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid	Perkin Elmer	6055302	96-well tissue culture (TC)-treated microplate with black well walls and an optically-clear bottom, for phagocytosis assay
CellProfiler software			Open-source software for analysis of phagocytosis images obtained by live-cell time-lapse microscope. Download for free from website (http://cellprofiler.org/), this protocol used version 2.2.0.
CellTracker Deep Red dye	Thermo Fisher	C34565	Deep red-fluorescent, cell-permeant, succinimidyl ester-reactive dye for staining cytoplasm of iPS-macrophages. Dissolve CellTracker Deep Red dye in DMSO to 2 mM (1.4 mg/mL). Use at 1 μM, by dilution of DMSO stock with Macrophage media.
Class 2 laminar air flow safety cabinet
CO2 gas bottle			Accessory for EVOS FL Auto
CO2 incubator, set to 37°C and 5 % CO2
Columbus Image Data Storage and Analysis System	Perkin Elmer	Columbus	Data storage and analysis platform for Opera Phenix. Supports all major high content screening instruments.
Cytochalasin D	Cayman	11330	Negative control treatment for phagocytosis assay. Reconstitute in DMSO to 10 mM and store aliquots at -20°C, avoid further freeze-thaw cycles. Use at final concentration 10 µM.
DMEM/F12	Gibco	11320074	Component of SH-SY5Y media
DMSO	Sigma	D8418	Solvent for CellTracker and pHrodo dyes
EVOS FL Auto Imaging System	Thermo Fisher	AMF4300	Live-cell time-lapse imaging microscope
EVOS Light Cube CY5	Thermo Fisher	AMEP4656	Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube DAPI	Thermo Fisher	AMEP4650	Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Light Cube RFP	Thermo Fisher	AMEP4652	Accessory for EVOS FL Auto
EVOS Onstage Incubator	Thermo Fisher	AMC1000	Accessory for EVOS FL Auto
Fetal Bovine Serum	Sigma	F4135	Component of SH-SY5Y media
Flow cytometer
Flow cytometry analysis software
Geltrex LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane Matrix	Invitrogen	A1413302	hESC-qualified basement membrane matrix for iPSC culture
GlutaMAX Supplement	Gibco	35050-038	Component of both Factory and Macrophage media
HBSS	Lonza	BE 10-547F	Hank’s balanced salt solution for washing steps
Human recombinant BMP4	Gibco	PHC9534	Component of Embryoid Body media
Human recombinant IL-3	Gibco	PHC0033	Component of both Factory and Macrophage media
Human recombinant SCF	Miltenyi Biotech	130-096-695	Component of Embryoid Body media
Human recombinant VEGF	Gibco	PHC9394	Component of Embryoid Body media
Live Cell Imaging Solution	Thermo Fisher	A14291DJ	Phenol red-free HEPES-buffered media for labelling dead SH-SY5Ys
Low protein binding 2 mL tubes	Eppendorf	30108.132	For staining SH-SY5Ys
M-CSF	Thermo Fisher	PHC9501	Component of both Factory and Macrophage media
mTeSR1 Medium	STEMCELL Technologies	85850	iPSC media
Multichannel 20-200 uL pipette			For liquid handling of 96-well plate
NucBlue Live ReadyProbes Reagent	Thermo Fisher	R37605	Hoechst 33342 formulation in a dropper bottle for staining nuclei of iPS-macrophages, use 0.5 drops/mL in Macrophage media.
Opera Phenix High-Content Screening System	Perkin Elmer	HH14000000	High-content imaging microscope, used with Harmony software version 4.9.
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122	Component of Factory, Macrophage, and SH-SY5Y media
pHrodo iFL Red STP-Ester	Thermo Fisher	P36011	pH-sensitive red fluorescent dye for labelling dead SH-SY5Ys. Reconstitute pHrodo iFL Red STP Ester powder in DMSO to a 5 mg/mL concentration. For each 1 million SH-SY5Ys, add 2.5 μL (12.5 μg) of pHrodo iFL Red STP Ester stock to pre-warmed cells suspended in Live Cell Imaging Solution.
Serological pipette filler
T175 flask, tissue culture treated			Vessel for differentiations of iPSC-macrophage precursors, known as "Factories"
T75 flask			Vessel for SH-SY5Y culture
Transparent plate sealers	Greiner Bio-One	676001	For assay plate storage and transportation
TrypLE Express (1X), no phenol red	Gibco	12604013	Cell dissociation buffer containing recombinant trypsin-like enzymes and 1.1 mM EDTA, use neat.
Water bath, set to 37°C
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine, gentamicin, and phenol red	Lonza	BE04-418F	Component of Factory and Macrophage media
X-VIVO 15 Medium with L-glutamine; without gentamicin or phenol red	Lonza	04-744Q	Phenol red-free macrophage media, for use in phagocytosis without additives or growth factors