מידול גרורות במוח באמצעות הזרקת ורידים בזנב של תאי סרטן שד דלקתיים

Summary

אנו מתארים מודל עכבר xenograft של גרורות במוח של סרטן השד שנוצרו באמצעות הזרקת ורידים בזנב של קו תאי סרטן שד דלקתי מוגבר אנדוגניים HER2.

Abstract

התפשטות גרורתית למוח היא ביטוי שכיח והרסני של סוגים רבים של סרטן. בארצות הברית לבדה, כ-200,000 חולים מאובחנים עם גרורות במוח מדי שנה. הושגה התקדמות משמעותית בשיפור תוצאות ההישרדות של חולות עם סרטן שד ראשוני וממאירויות סיסטמיות; עם זאת, הפרוגנוזה העגומה עבור חולים עם גרורות קליניות במוח מדגישה את הצורך הדחוף לפתח סוכנים טיפוליים חדשניים ואסטרטגיות נגד מחלה קטלנית זו. היעדר מודלים ניסיוניים מתאימים היה אחד המכשולים העיקריים המעכבים את התקדמות ההבנה שלנו של גרורות מוחיות, ביולוגיה וטיפול. במאמר זה אנו מתארים מודל עכברי של גרורות במוח שנוצרו באמצעות הזרקת וריד זנב של קו תאים אנדוגני מוגבר HER2 שמקורו בסרטן שד דלקתי (IBC), צורה נדירה ואגרסיבית של סרטן השד. התאים סומנו בלוציפראז גחלילית ובחלבון פלואורסצנטי ירוק כדי לנטר גרורות במוח, וכומתו עומס גרורתי על ידי דימות ביולומינסצנטי, סטריאומיקרוסקופיה פלואורסצנטית והערכה היסטולוגית. עכברים מפתחים גרורות במוח באופן יציב ועקבי, מה שמאפשר חקירה של מתווכים מרכזיים בתהליך הגרורתי ופיתוח בדיקות פרה-קליניות של אסטרטגיות טיפול חדשות.

Introduction

גרורות במוח הן סיבוך שכיח וקטלני של ממאירויות מערכתיות. רוב גרורות המוח מקורן בגידולים ראשוניים של הריאה, השד או העור, אשר ביחד מהווים 67-80% מהמקרים ^1,2. ההערכות לגבי היארעות גרורות במוח נעות בין 100,000 ל-240,000 מקרים, ומספרים אלה עשויים להיות מוערכים בחסר מכיוון שנתיחה לאחר המוות נדירה עבור חולים שמתו מסרטן גרורתי³. לחולים עם גרורות במוח יש פרוגנוזה גרועה יותר והישרדות כללית נמוכה יותר ביחס לחולים ללא גרורות במוח⁴. אפשרויות הטיפול הנוכחיות בגרורות במוח הן פליאטיביות ברובן ואינן מצליחות לשפר את תוצאות ההישרדות עבור רוב החולים⁵. לפיכך, גרורות במוח נותרו אתגר, והצורך נותר דחוף כדי להבין טוב יותר את המנגנונים של התקדמות גרורות במוח כדי לפתח טיפולים יעילים יותר.

השימוש במודלים ניסיוניים סיפק תובנות חשובות לגבי מנגנונים ספציפיים של התקדמות גרורתית של סרטן השד למוח ואיפשר להעריך את יעילותן של גישות טיפוליות שונות 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . עם זאת, מעט מאוד מודלים יכולים לשחזר באופן מדויק ומלא את המורכבות של התפתחות גרורות במוח. מספר מודלים ניסיוניים in vivo נוצרו באמצעות חיסון תאים סרטניים לעכברים על ידי נתיבי מתן שונים, כולל אורתוטופיים, וריד זנב, תוך לבבי, עורקי תוך קרוטיד וזריקות תוך מוחיות. לכל טכניקה יתרונות וחסרונות, כפי שנסקר במקום אחר³. עם זאת, אף אחד מהמודלים האלה של עכברים לא יכול לשכפל באופן מלא את ההתקדמות הקלינית של גרורות במוח.

גרורות במוח שכיחות במיוחד בחולות עם סרטן שד דלקתי (IBC), גרסה נדירה אך אגרסיבית של סרטן שד ראשוני. IBC מהווה 1% עד 4% ממקרי סרטן השד, אך הוא אחראי ל -10% לא פרופורציונליים ממקרי המוות הקשורים לסרטן השד בארצות הברית^17,18. IBC ידוע לשלוח גרורות במהירות; ואכן, לשליש מחולי IBC יש גרורות מרוחקות בזמן האבחנה^19,20. ספציפית לגרורות במוח, חולים עם IBC יש שכיחות גבוהה יותר של גרורות במוח מאשר חולים עם IBC שאינו IBC²¹. לאחרונה, הדגמנו כי קו התאים MDA-IBC3, הנגזר מנוזל ההיתוך הפלאורלי הממאיר של חולה ^{עם ER-}/PR^-/HER2⁺ IBC המשחזר מאפייני IBC בקסנוגרפטים של עכברים, הוא בעל נטייה מוגברת לפתח גרורות במוח ולא גרורות ריאה בעכברים כאשר מוזרק על ידי וריד הזנב, מה שהופך את קו התאים הזה למודל טוב לחקר התפתחות גרורות במוח¹⁶.

במאמר זה נתאר את ההליכים ליצירת גרורות במוח באמצעות הזרקת תאי MDA-IBC3 לווריד הזנב ולהערכת העומס הגרורתי באמצעות מיקרוסקופ סטריאופלואורסצנטי והדמיית לוציפראז. שיטה זו שימשה לגילוי מתווכים מרכזיים של גרורות סרטן השד למוח ולבדיקת היעילות של התערבויות טיפוליות 16,22,23. החיסרון של טכניקה זו הוא שהיא אינה משחזרת את כל השלבים בתהליך הגרורתי במוח. עם זאת, יתרונותיו העיקריים כוללים חוסן ויכולת שחזור, מעורבות של הביולוגיה הרלוונטית של גרורות של intravasation, חציית הריאות ו extravasation לתוך המוח, ואת הפשטות היחסית שלה במונחים של טכניקה.

Protocol

השיטה המתוארת כאן אושרה על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מרכז הסרטן MD Anderson ועומדת בהנחיות המכונים הלאומיים לבריאות לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. זרימת העבודה הסכמטית, עם כל השלבים הכלולים, מוצגת כאיור 1.

1. הכנת תאים

הערה: קו התאים MDA-IBC3 (ER-/PR^-/HER2⁺), שנוצר במעבדה²⁴ של ד"ר וודוורד, הומר ביציבות עם פלסמיד חלבון פלואורסצנטי ירוק לוציפראז (Luc-GFP).

1. תרבית תאים מותמרים במדיה F-12 של Ham בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1 מיקרוגרם / מ"ל הידרוקורטיזון, 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, ו 1% אנטיביוטי-אנטימיטוטי.
2. צלחת MDA-IBC3-Luc-GFP תאים ב 37 ° C ו 5% CO₂ בבקבוק T-75 עד למפגש. שנה מדיה כל 3 ימים לפני שהתאים נפגשים מספיק כדי לעבור.
3. קצור תאים על ידי הסרת מדיה, שטיפת כל בקבוק עם 10 מ"ל של 1x Dulbecco (כלומר, ללא סידן ומגנזיום) פוספט חוצץ מלוחים (DPBS), והוספת 2 מ"ל של 0.25% חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA). יש לדגור במשך 3-5 דקות בטמפרטורה של 37°C עד שהתאים מתנתקים.
4. הוסף 5 מ"ל של מדיה שלמה לבקבוק כדי לאסוף את התאים ולהעביר את כל התוכן לצינור צנטריפוגה של 15 מ"ל (מותאם לצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל בהתאם למספר התאים הכולל הדרוש). צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך 5 דקות לתאי כדור.
   הערה: המדיה המלאה היא מדיה F-12 של Ham בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS), 1 מיקרוגרם / מ"ל הידרוקורטיזון, 5 מיקרוגרם / מ"ל אינסולין, ו 1% אנטיביוטי-אנטימיטוטי.
5. השליכו את הסופרנטנט. לאחר מכן לשטוף את התאים עם 10 מ"ל של 1x DPBS. צנטריפוגה ב 290 x גרם במשך 5 דקות כדי לגלול את התאים ולהשליך את supernatant בזהירות. להשעות מחדש את התאים עם 1 מ"ל של DPBS טרי 1x ולערבב היטב על ידי pipeting למעלה ולמטה.
6. כדי ליצור תרחיפים חד-תאיים, סנן תאים דרך מסננות של תאים סטריליים בגודל 40 מיקרומטר.
7. חשב צפיפות תאים באמצעות מונה תאים אוטומטי.
   הערה: כדי להפחית שגיאות בספירה, צור דילולי תאים שונים וספור אותם בנפרד, וחשב את הערך הממוצע כדי לקבוע את ריכוז התאים (מספר תאים/מ"ל).
   1. אסוף 2 μL של תרחיף תאים + 8 μL של DPBS 1x כדי לבצע דגימת דילול 1:5.
   2. אסוף 1 μL של תרחיף תאים + 9 μL של 1x DPBS כדי לבצע דגימת דילול 1:10.
   3. הוסף 10 μL של 0.4% כתם כחול טריפאן. מערבבים היטב את תערובת הדגימה על ידי פיטינג שלה למעלה ולמטה כמה פעמים.
   4. פיפט בעדינות 10 μL של הדגימה לתוך אזור טעינת הדגימה בצורת חצי ירח של שקופיות תא הספירה. ודא שאין בועות בפנים; המתן 30 שניות כדי לאפשר לתאים להתיישב בתא לפני הספירה.
8. לדלל את התאים עם 1x DPBS לצפיפות של 5 x 10⁵ או 1 x 10⁶ תאים לכל 100 μL. העברת תרחיף התא לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגות 1.7 מ"ל להזרקת ורידים זנב. מניחים תאים על קרח עד להזרקה כדי לשמור על כדאיות.

2. הזרקת ורידים זנב

1. יש להשתמש בנקבות עכברי SCID/בז' אתימיות בנות 4 עד 6 שבועות.
2. הכינו מזרק 30 גרם כדי לצייר 100 μL של השעיית התא. הסירו את כל בועות האוויר.
3. הניחו את העכבר במתקן ריסון מכרסם (קוטר של כ-1 אינץ') כדי להקל על הזרקת ורידי הזנב ולמנוע פציעות כתוצאה מתנועה במהלך תהליך ההזרקה.
4. השתמש רפידות כותנה אלכוהול (עשוי עם 70% אתנול) כדי לנגב בעדינות את זנב העכבר 3-4 פעמים להחזיק במשך 5-10 שניות כדי להפוך את וריד הזנב גלוי יותר.
5. הכנס את המזרק לזנב העכבר בזווית של 15-30°. דחפו באיטיות את מתלה התא לתוך וריד הזנב.
6. הסר את המזרק בעדינות והשתמש בכרית הצמר גפן כדי להחזיק את הזנב למשך מספר שניות כדי לעזור לעצור כל דימום.
7. החזירו את העכברים לכלובים שלהם ובדקו אותם 2-4 שעות לאחר ההזרקה כדי לוודא שלא מתרחשות תופעות לוואי.

3. הערכת עומס גרורות במוח

1. הכן פתרון D-luciferin מדולל.
   הערה: ריכוז המלאי הוא 47.6 מילימטר (15.15 מ"ג/מ"ל), והריכוז לשימוש הוא 1.515 מ"ג/מ"ל.
   1. הוסף 5 מ"ל של DPBS 1x לבקבוק D-luciferin.
   2. מניחים 2.5 מ"ל של התמיסה לתוך כל אחד משני צינורות חרוטי 50 מ"ל.
   3. הוסף עוד 5 מ"ל של DPBS 1x לבקבוק D-luciferin שוב כדי לשטוף אותו. שים 2.5 מ"ל לתוך כל 50 מ"ל צינור חרוט.
   4. הכניסו עוד 5 מ"ל של 1x DPBS לבקבוק ושטפו אותו שוב. חזור על תהליך השטיפה פעמיים.
   5. הוסף DPBS אחד לכל צינור 50 מ"ל לסך של 66 מ"ל (כ -33 מ"ל לכל צינור). צריך להיות בערך 33 מ"ל של הפתרון בכל צינור.
   6. מערבבים היטב את הצינורות ולאחר מכן משלבים את שניהם ליחידת סינון סטרילית (מסנן PES של 150 מ"ל 0.45 מיקרומטר).
   7. סנן את התמיסה ולאחר מכן aliquot את הפתרון מסונן לתוך microtubes ענבר סטרילי 1.7 מ"ל.
2. איתור גרורות במוח על ידי הדמיית לוציפראז.
   1. הפשירו D-luciferin על ידי שמירה על קרח, ומערבולות לפני הזרקה לתוך העכברים.
   2. נקו את אזור ההזרקה עם רפידות כותנה אלכוהוליות והזריקו 100 מיקרוליטר D-לוציפרין לכל עכבר תוך צפקית באמצעות מזרק אינסולין 0.5 מ"ל, מזרק אחד לכל כלוב.
   3. לאחר 10 דקות, מרדימים את העכברים עם איזופלורן (2% O_2-2.5% איזופלורן) למשך 5 דקות באמצעות וופורייזר וטרינרי המחובר לתא השראת בעלי חיים קטנים.
   4. הפעל את מערכת ההדמיה in vivo. בזמן שהעכברים מהכלוב הראשון נמצאים תחת הרדמה, הזריקו את D-luciferin לעכברים בכלוב הבא.
   5. הכניסו עכברים למכונת מערכת ההדמיה in vivo וקבלו תמונות גחון וגב. בחר זמן חשיפה של 2 דקות, ובתצוגת השדה בחר באפשרות E (כל הגוף). לחץ על Acquire. לאחר מכן, שמרו את התמונה (איור 2).
      הערה: אם התמונה מציגה רוויה של עוצמת האור, קצר את זמן החשיפה.
3. איתור גרורות במוח על ידי הדמיית GFP.
   1. הכנת רקמת המוח.
      1. כ-8-10 שבועות לאחר הזרקת התאים או כאשר העכברים מתים עקב עומס גרורות במוח, יש להרדים את העכברים על ידי שאיפת מנת יתר של איזופלורן ואחריה פריקת צוואר הרחם, בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי IACUC.
      2. לאחר המתת חסד עם isoflurane ואחריו נקע צוואר הרחם, לרסס את העכברים עם פתרון אתנול 70% ולהסיר את הפרווה מאזור הראש והאוזניים עם מספריים. לאחר מכן, בצע חתך באזור צוואר הרחם של הצוואר (נזהר לא לערוף את ראשו של העכבר). חותכים את הגולגולת ומושכים אותה החוצה. לאחר מכן, בזהירות להסיר את המוח.
      3. הכניסו את המוחות שנאספו לקלטות רקמה.
      4. מעבירים את הקלטות למיכל עם DPBS 1x קר.
         הערה: אין לשמור דגימות מוח ב-DPBS אחד למשך יותר משעה אחת. אם רוצים לאסוף כמה דגימות מוח בו זמנית, הרדימו רק כמה עכברים בכל פעם (10 בכל סיבוב).
   2. הדמיה סטריאומיקרוסקופית.
      1. העבירו את כל המוח למכסה צלחת רקמה בקוטר 100 ס"מ.
      2. הפעילו את הסטריאומיקרוסקופ ואת אור העל-סגול, במיקום 3 עם עדשה 0.5x, כדי לאפשר הדמיה של המוח כולו כפי שמוצג באיור 3A (ריבוע אדום).
      3. לחץ על תצוגת Live (איור 3A, ריבוע ירוק).
      4. מקדו את הנוף בזמן שהמוח נמצא במצב הגחון.
      5. בחר GFP (אם התאים מסומנים בתווית GFP ) או TXRED (אם התאים מסומנים בתווית RFP) (איור 3A, ריבוע צהוב) בתוכנה, בחר את המסנן המתאים במיקרוסקופ וצלם תמונה.
         הערה: שמור על הגדרת מקור האור של SOLA על כ- 30%; אם ה- GFP בהיר מדי, צמצם עד לצפייה באות הנכון.
      6. מבלי להזיז את הדגימה, הדליקו את האור הבהיר ובחרו BF (איור 3A, ריבוע צהוב). צלמו תמונה.
      7. חזור על השלבים הקודמים עם המוח במצב גבי.
         הערה: בהתאם לגודל, אותו נגע גרורות מוחי חיובי GFP יכול להופיע הן במצב הגחון והן במצב גבי. במקרה כזה, הימנעו מכימות כפול של אותו נגע. שמור את התמונות עם סיומת TIFF (השומרת את כל המידע בקובץ התמונה).
      8. שמור את התמונות עם סיומת TIFF (השומרת את כל המידע בקובץ התמונה).
      9. חזור על שלבים עבור כל הדגימות.
      10. המר את תמונות TIFF ל- JPEG כך שניתן יהיה לפתוח את הקבצים עם כל מחשב שבו לא מותקנת התוכנה המשויכת (קובץ | ייבוא/ייצוא | להמיר קבצים).
      11. כדי למזג את התמונה הפלואורסצנטית עם תמונת השדה הבהיר, פתח את שתי התמונות ועבור אל קובץ | מיזוג ערוצים. בחר את הרכיבים המתאימים, ירוק עבור GFP ושדה בהיר עבור BF, ולחץ על אישור. שמור את התמונה הממוזגת.
      12. כדי לכמת את אזור הגידול במוח, השתמש בתמונה הפלואורסצנטית. בחר מידה | מדידה ידנית | אזור. בחרו בחירה אוטומטית (איור 3B, ריבוע ירוק), הזיזו את החץ לאזור GFP חיובי ולחצו ליצירת בחירה אוטומטית. לחץ שוב כדי לאשר את הבחירה ולאחר מכן כל המדידות יוצגו (איור 3B, ריבוע אדום). אם קיים יותר מאזור GFP חיובי אחד, חזור על ההליך.
   3. לאחר קבלת תמונות מוחיות, המשיכו לפרוטוקולים שגרתיים של קיבוע רקמות באמצעות פורמלין חוצץ ניטרלי 10%.
      1. לאחר תיקון המוח, המשך לחתך היסטולוגי סטנדרטי ואחריו צביעת המטוקסילין ואוזין כדי לאשר את נוכחותם של גרורות במוח וצביעה אימונוהיסטוכימית כדי לזהות סמנים נבחרים.
         הערה: אימונוציטוכימיה בוצעה במעבדת הליבה הפתולוגית במרכז הסרטן UT MD Anderson שיש לה פרוטוקול סטנדרטי לצביעה אימונוהיסטוכימית של סמנים ידועים.

תוצאות

עם הרציונל שתאים מסומנים מאפשרים ניטור והדמיה של גרורות במוח במודלים פרה-קליניים של עכברים, תייגנו תאי MDA-IBC3 עם Luc ועם GFP כדי לנטר גרורות במוח ולכמת את העומס הגרורתי באמצעות הדמיה ביולומינסנטית וסטריאומיקרוסקופיה פלואורסצנטית. הזרקת תאי MDA-IBC3 המסומנים לוורידי הזנב של עכברי SCID/בז' מדוכאי חי?...

Discussion

הפרוטוקול כולל מספר שלבים קריטיים. תאים צריכים להישמר על קרח לא יותר משעה אחת כדי לשמור על כדאיות. יש להשתמש ברפידות כותנה אלכוהוליות כדי לנגב את זנבות העכברים לפני ההזרקה, תוך הקפדה לא לנגב חזק מדי או לעתים קרובות מדי כדי למנוע פגיעה בעור הזנב. ודא שאין בועות אוויר בתרחיף התא, כדי למנוע מעכ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
1000 µL pipette tip filtered	Genesee Scientific	23430
10 mL Serological Pipets	Genesee Scientific	12-112
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	1%
Centrifuge tubes 15 mL bulk	Genesee Scientific	28103
Corning  500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine	GIBICO Inc. USA	MT10080CV
Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific	21-031-CV
Eppendorf centufuge 5810R	Eppendorf
Fetal bovine serum (FBS)	GIBICO Inc. USA	16000044	10%
Fisherbrand  Sterile Cell Strainers (40 μm)	Thermo Fisher Scientific	22-363-547
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	1 µg/mL
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014	5 µg/mL
Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
MDA-IBC3 cell lines	MD Anderson Cancer Center		Generated by Dr. Woodward's lab24
Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid	System Biosciences	BLIV713PA-1
microtubes clear sterile 1.7 mL	Genesee Scientific	24282S
Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile	Genesee Scientific	23-401C
TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent	Genesee Scientific	25-209
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Tail vein injection
C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige	Envigo	SCID/beige mice
BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm)	BD	328466
Plas Labs  Broome-Style Rodent Restrainers	Plas Labs 551BSRR	01-288-32A	Order fromThermo Fisher Scientific
Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof)	Thermo Fisher Scientific	50420872	70 % used
Imaging
BD Lo-Dose  U-100 Insulin Syringes	BD	329461
Disposable PES Filter Units 0.45 µm	Fisherbrand	FB12566501	filter system to sterilize the D-luciferin
D-Luciferin	Biosynth	L8220-1g	stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL
1.7 mL microtube amber	Genesee Scientific	24-282AM
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC-14043-704-06	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
IVIS 200	PerkinElmer		machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine
Plastic Containers with Lids	Fisherbrand	02-544-127
Tissue Cassettes	Thermo Scientific	1000957
Webcol Alcohol Prep	Covidien	6818
Stereomicroscope Imaging
Stereomicroscope AZ100	Nikon	model AZ-STGE	software NIS-ELEMENT
Formalin 10%	Fisher Chemical	SF100-4
TC treated dishes 100x20 mm	Genesee Scientific	25202