Modellazione delle metastasi cerebrali tramite iniezione di vena della coda di cellule infiammatorie del cancro al seno

Riepilogo

Descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali di cancro al seno generate tramite iniezione di vena della coda di una linea cellulare di carcinoma mammario infiammatorio amplificata endogenamente da HER2.

Abstract

La diffusione metastatica al cervello è una manifestazione comune e devastante di molti tipi di cancro. Solo negli Stati Uniti, circa 200.000 pazienti vengono diagnosticati con metastasi cerebrali ogni anno. Sono stati compiuti progressi significativi nel miglioramento dei risultati di sopravvivenza per le pazienti con carcinoma mammario primario e tumori maligni sistemici; Tuttavia, la prognosi infausta per i pazienti con metastasi cerebrali cliniche evidenzia l'urgente necessità di sviluppare nuovi agenti terapeutici e strategie contro questa malattia mortale. La mancanza di modelli sperimentali adeguati è stato uno dei principali ostacoli che hanno impedito il progresso della nostra comprensione della biologia e del trattamento delle metastasi cerebrali. Qui, descriviamo un modello murino di xenotrapianto di metastasi cerebrali generate tramite iniezione venosa della coda di una linea cellulare amplificata endogenamente da HER2 derivata dal carcinoma mammario infiammatorio (IBC), una forma rara e aggressiva di cancro al seno. Le cellule sono state marcate con luciferasi della lucciola e proteina di fluorescenza verde per monitorare le metastasi cerebrali e quantificato il carico metastatico mediante imaging a bioluminescenza, stereomicroscopia fluorescente e valutazione istologica. I topi sviluppano in modo robusto e coerente metastasi cerebrali, consentendo lo studio di mediatori chiave nel processo metastatico e lo sviluppo di test preclinici di nuove strategie di trattamento.

Introduzione

Le metastasi cerebrali sono una complicanza comune e mortale dei tumori maligni sistemici. La maggior parte delle metastasi cerebrali provengono da tumori primari del polmone, della mammella o della pelle, che rappresentano collettivamente il 67-80% dei casi ^1,2. Le stime dell'incidenza delle metastasi cerebrali variano tra 100.000 e 240.000 casi e questi numeri possono essere sottostimati perché l'autopsia è rara per i pazienti morti di cancro metastatico³. I pazienti con metastasi cerebrali hanno una prognosi peggiore e una sopravvivenza globale inferiore rispetto ai pazienti senza metastasi cerebrali⁴. Le attuali opzioni di trattamento per le metastasi cerebrali sono in gran parte palliative e non riescono a migliorare i risultati di sopravvivenza per la maggior parte dei pazienti⁵. Pertanto, le metastasi cerebrali rimangono una sfida e rimane urgente la necessità di comprendere meglio i meccanismi di progressione delle metastasi cerebrali per sviluppare terapie più efficaci.

L'utilizzo di modelli sperimentali ha fornito importanti approfondimenti sui meccanismi specifici della progressione metastatica del carcinoma mammario al cervello e ha permesso di valutare l'efficacia di vari approcci terapeutici 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Tuttavia, pochissimi modelli possono ricapitolare in modo accurato e completo la complessità dello sviluppo delle metastasi cerebrali. Diversi modelli sperimentali in vivo sono stati generati tramite inoculazione di cellule tumorali nei topi da diverse vie di somministrazione, tra cui iniezioni ortotopiche, venose della coda, intracardiache, arteriose intracarotidi e intracerebrali. Ogni tecnica presenta vantaggi e svantaggi, come esaminato altrove³. Nessuno di questi modelli murini, tuttavia, può replicare completamente la progressione clinica delle metastasi cerebrali.

Le metastasi cerebrali sono particolarmente comuni nei pazienti con carcinoma mammario infiammatorio (IBC), una variante rara ma aggressiva del carcinoma mammario primario. IBC rappresenta dall'1% al 4% dei casi di cancro al seno, ma è responsabile di uno sproporzionato 10% dei decessi correlati al cancro al seno negli Stati Uniti^17,18. IBC è noto per metastatizzare rapidamente; infatti, un terzo dei pazienti con IBC ha metastasi a distanza al momento della diagnosi^19,20. Specifico per le metastasi cerebrali, i pazienti con IBC hanno una maggiore incidenza di metastasi cerebrali rispetto ai pazienti con non-IBC²¹. Recentemente, abbiamo dimostrato che la linea cellulare MDA-IBC3, derivata dal liquido di versamento pleurico maligno di un paziente con IBC ER-/PR^-/HER2⁺ che ricapitola le caratteristiche IBC negli xenotrapianti di topo, ha una maggiore propensione a sviluppare metastasi cerebrali piuttosto che metastasi polmonari nei topi quando iniettati dalla vena della coda, rendendo questa linea cellulare un buon modello per studiare lo sviluppo delle metastasi cerebrali¹⁶.

Qui descriviamo le procedure per generare metastasi cerebrali tramite iniezione di vene della coda di cellule MDA-IBC3 e per valutare il carico metastatico tramite microscopia stereofluorescente e imaging della luciferasi. Questo metodo è stato utilizzato per scoprire mediatori chiave delle metastasi del cancro al seno al cervello e per testare l'efficacia degli interventi terapeutici 16,22,23. Lo svantaggio di questa tecnica è che non ricapitola tutti i passaggi nel processo metastatico cerebrale. Tuttavia, i suoi principali vantaggi includono robustezza e riproducibilità, coinvolgimento della biologia delle metastasi rilevanti dell'intravasazione, attraversamento dei polmoni e stravaso nel cervello e la sua relativa semplicità in termini di tecnica.

Protocollo

Il metodo qui descritto è stato approvato dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) del MD Anderson Cancer Center ed è conforme alle linee guida del National Institutes of Health per la cura e l'uso degli animali da laboratorio. Il flusso di lavoro schematico, con tutti i passaggi inclusi, è presentato come Figura 1.

1. Preparazione delle cellule

NOTA: La linea cellulare MDA-IBC3 (ER^-/PR-/HER2⁺), generata nel laboratorio²⁴ del Dr. Woodward, è stata trasdotta stabilmente con un plasmide della proteina fluorescente verde luciferasi (^Luc-GFP).

1. Le cellule trasdotte di coltura nei terreni F-12 di Ham integrate con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 1 μg / mL di idrocortisone, 5 μg / mL di insulina e l'1% di antibiotico-antimitotico.
2. Placcare le cellule MDA-IBC3-Luc-GFP a 37 °C e il 5% di CO₂ in un matraccio T-75 fino alla conflusività. Cambiare il mezzo ogni 3 giorni prima che le cellule siano abbastanza confluenti da passare.
3. Raccogliere le cellule rimuovendo i mezzi, lavando ogni matraccio con 10 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS) di 1x Dulbecco (cioè senza calcio e magnesio) e aggiungendo 2 ml di acido tripsina-etilendiamminotetraacetico (EDTA) allo 0,25%. Incubare per 3-5 minuti a 37 °C fino al distacco delle cellule.
4. Aggiungere 5 mL di mezzo completo al pallone per raccogliere le celle e trasferire l'intero contenuto in una provetta da centrifuga da 15 mL (ottimizzata per una provetta da centrifuga da 50 mL a seconda del numero totale di celle necessarie). Centrifugare a 290 x g per 5 minuti a pellet.
   NOTA: Il terreno completo è il mezzo F-12 di Ham integrato con il 10% di siero bovino fetale (FBS), 1 μg / mL di idrocortisone, 5 μg / mL di insulina e 1% di antibiotico-antimitotico.
5. Scartare il surnatante. Quindi lavare le celle con 10 ml di 1x DPBS. Centrifugare a 290 x g per 5 minuti per pellettare le cellule e scartare accuratamente il surnatante . Risospendere le celle con 1 mL di 1x DPBS fresco e mescolare bene pipettando su e giù.
6. Per realizzare sospensioni a singola cellula, filtrare le celle attraverso filtri a cellule sterili da 40 μm.
7. Calcolare la densità delle celle utilizzando un contatore automatico delle celle.
   NOTA: Per ridurre gli errori nel conteggio, creare diverse diluizioni di cellule e contarle separatamente e calcolare il valore medio per determinare la concentrazione di cellule (numero di celle/ml).
   1. Raccogliere 2 μL di sospensione cellulare + 8 μL di 1x DPBS per effettuare un campione di diluizione 1:5.
   2. Raccogliere 1 μL di sospensione cellulare + 9 μL di 1x DPBS per effettuare un campione di diluizione 1:10.
   3. Aggiungere 10 μL di colorazione blu tripano allo 0,4%. Mescolare bene la miscela del campione pipettandola su e giù alcune volte.
   4. Pipettare delicatamente 10 μL del campione nell'area di carico del campione a forma di mezzaluna dei vetrini della camera di conteggio. Assicurati che non ci siano bolle all'interno; Attendere 30 s per consentire alle cellule di depositarsi nella camera prima di contare.
8. Diluire le cellule con 1x DPBS ad una densità di 5 x 10⁵ o 1 x 10⁶ cellule per 100 μL. Trasferire la sospensione cellulare in provette da microcentrifuga da 1,7 mL per iniezione della vena della coda. Mettere le cellule sul ghiaccio fino all'iniezione per mantenere la vitalità.

2. Iniezione della vena caudale

1. Utilizzare topi SCID/Beige atimici femmina di 4-6 settimane.
2. Preparare una siringa da 30 G per aspirare 100 μL di sospensione cellulare. Rimuovere tutte le bolle d'aria.
3. Posizionare il topo in un sistema di ritenuta per roditori (diametro circa 1 pollice) per facilitare l'iniezione della vena della coda e prevenire lesioni da movimento durante il processo di iniezione.
4. Utilizzare dischetti di cotone alcolico (realizzati con etanolo al 70%) per pulire delicatamente la coda del topo 3-4 volte e tenere premuto per 5-10 secondi per rendere la vena della coda più chiaramente visibile.
5. Inserire la siringa nella coda del mouse con un angolo di 15-30°. Spingere lentamente la sospensione cellulare nella vena della coda.
6. Rimuovere delicatamente la siringa e utilizzare il batuffolo di cotone per tenere la coda per alcuni secondi per aiutare a fermare qualsiasi sanguinamento.
7. Riportare i topi nelle loro gabbie e controllarli 2-4 ore dopo l'iniezione per assicurarsi che non si verifichino effetti avversi.

3. Valutazione del carico di metastasi cerebrali

1. Preparare la soluzione diluita di D-luciferina.
   NOTA: la concentrazione dello stock è di 47,6 mM (15,15 mg/ml) e la concentrazione per l'uso è di 1,515 mg/ml.
   1. Aggiungere 5 ml di 1x DPBS al flacone di D-luciferina.
   2. Introdurre 2,5 mL della soluzione in ciascuno dei due tubi conici da 50 ml.
   3. Aggiungere altri 5 ml di 1x DPBS al flacone di D-luciferina di nuovo per risciacquarlo. Inserire 2,5 mL in ogni tubo conico da 50 mL.
   4. Introdurre altri 5 ml di 1x DPBS nel flacone e risciacquare nuovamente. Ripetere il processo di risciacquo due volte.
   5. Aggiungere 1x DPBS a ciascun tubo da 50 mL per un totale di 66 mL (circa 33 mL per provetta). Ci dovrebbero essere circa 33 ml della soluzione in ogni tubo.
   6. Mescolare bene i tubi e quindi combinarli entrambi in un'unità di filtrazione sterile (filtro PES da 150 mL 0,45 μm).
   7. Filtrare la soluzione e quindi aliquotare la soluzione filtrata in microtubi sterili ambrati da 1,7 ml.
2. Rilevamento delle metastasi cerebrali mediante imaging della luciferasi.
   1. Scongelare la D-luciferina mantenendo sul ghiaccio e vortice prima dell'iniezione nei topi.
   2. Pulire l'area di iniezione con tamponi di cotone alcool e iniettare 100 μL di D-luciferina per topo per via intraperitoneale utilizzando una siringa da insulina da 0,5 ml, una siringa per ogni gabbia.
   3. Dopo 10 minuti, anestetizzare i topi con isoflurano (2% O 2-_2,5% isoflurano) per 5 minuti utilizzando il vaporizzatore veterinario collegato alla camera di induzione dei piccoli animali.
   4. Accendere il sistema di imaging in vivo. Mentre i topi della prima gabbia sono sotto anestesia, iniettare la D-luciferina nei topi nella gabbia successiva.
   5. Inserire i topi nella macchina del sistema di imaging in vivo e ottenere immagini ventrali e dorsali. Selezionate un tempo di esposizione di 2 minuti e nella vista campo scegliete l'opzione E (corpo intero). Premere Acquisisci. Quindi, salvare l'immagine (Figura 2).
      NOTA: se l'immagine mostra saturazione della luminescenza, ridurre il tempo di esposizione.
3. Rilevamento delle metastasi cerebrali mediante imaging GFP.
   1. Preparazione del tessuto cerebrale.
      1. Circa 8-10 settimane dopo l'iniezione di cellule o quando i topi sono moribondi a causa del carico di metastasi cerebrali, eutanasia i topi per inalazione di un sovradosaggio di isoflurano seguito da lussazione cervicale, in conformità con i protocolli approvati dalla IACUC.
      2. Dopo l'eutanasia con isoflurano seguita da lussazione cervicale, spruzzare i topi con una soluzione di etanolo al 70% e rimuovere la pelliccia dalla zona della testa e dalle orecchie con le forbici. Quindi, fai un taglio nella zona cervicale del collo (facendo attenzione a non decapitare il topo). Taglia il cranio e tiralo fuori. Quindi, rimuovere con attenzione il cervello.
      3. Metti i cervelli raccolti in cassette di tessuto.
      4. Trasferire le cassette in un contenitore con 1x DPBS freddo.
         NOTA: I campioni cerebrali non devono essere conservati in 1x DPBS per più di 1 ora. Se devono essere raccolti più campioni di cervello contemporaneamente, eutanasia solo pochi topi alla volta (10 per round).
   2. Imaging stereomicroscopico.
      1. Trasferire l'intero cervello su un coperchio di tessuto di 100 cm.
      2. Accendere lo stereomicroscopio e la luce UV, in posizione 3 con lente 0,5x, per consentire la visualizzazione dell'intero cervello come mostrato in Figura 3A (quadrato rosso).
      3. Premere Live View (Figura 3A, quadrato verde).
      4. Focalizza la vista mentre il cervello è in posizione ventrale.
      5. Selezionare GFP (se le celle sono etichettate con GFP ) o TXRED (se le celle sono etichettate RFP) (Figura 3A, quadrato giallo) nel software, selezionare il filtro appropriato sul microscopio e scattare una foto.
         NOTA: Mantenere l'impostazione della sorgente luminosa SOLA a circa il 30%; se la GFP è troppo luminosa, ridurre fino a quando non si osserva il segnale corretto.
      6. Senza spostare il campione, accendere la luce intensa e selezionare BF (Figura 3A, quadrato giallo). Scatta una foto.
      7. Ripeti i passaggi precedenti con il cervello in posizione dorsale.
         NOTA: A seconda delle dimensioni, la stessa lesione da metastasi cerebrale GFP positiva può comparire sia in posizione ventrale che dorsale. In tal caso, evitare la quantificazione duplicata della stessa lesione. Salvare le immagini con un'estensione TIFF (che mantiene tutte le informazioni nel file di immagine).
      8. Salvare le immagini con un'estensione TIFF (che mantiene tutte le informazioni nel file di immagine).
      9. Ripetere i passaggi per tutti i campioni.
      10. Convertire le immagini TIFF in JPEG in modo che i file possano essere aperti con qualsiasi computer in cui non è installato il software associato (File | Import/Export | convertire i file).
      11. Per unire l'immagine fluorescente con l'immagine in campo chiaro, apri entrambe le immagini e vai su File | Unisci canali. Selezionare i componenti appropriati, verde per GFP e campo luminoso per BF, quindi premere OK. Salvare l'immagine unita.
      12. Per quantificare l'area del tumore al cervello, utilizzare l'immagine fluorescente. Seleziona misura | Misurazione manuale | zona. Selezionare la selezione automatica (Figura 3B, quadrato verde), spostare la freccia nell'area positiva GFP e fare clic per creare automaticamente una selezione. Fare nuovamente clic per confermare la selezione e quindi verranno visualizzate tutte le misurazioni (Figura 3B, quadrato rosso). Se è presente più di un'area GFP-positiva, ripetere la procedura.
   3. Dopo aver ottenuto le immagini cerebrali, procedere ai protocolli di fissazione dei tessuti di routine utilizzando formalina tamponata neutra al 10%.
      1. Una volta che il cervello è stato fissato, procedere al sezionamento istologico standard seguito dalla colorazione dell'ematossilina e dell'eosina per confermare la presenza di metastasi cerebrali e colorazione immunoistochimica per rilevare marcatori selezionati.
         NOTA: L'immunocitochimica è stata eseguita presso il Pathology Core Laboratory presso l'UT MD Anderson Cancer Center che ha standardizzato il protocollo per la colorazione immunoistochimica di marcatori noti.

Risultati

Con il razionale che le cellule marcate facilitano il monitoraggio e la visualizzazione delle metastasi cerebrali in modelli murini preclinici, abbiamo taggato le cellule MDA-IBC3 con Luc e con GFP per monitorare le metastasi cerebrali e quantificare il carico metastatico utilizzando l'imaging a bioluminescenza e la stereomicroscopia fluorescente. L'iniezione delle cellule MDA-IBC3 marcate nelle vene caudali di topi immunocompromessi SCID/Beige ha provocato alte percentuali di topi che sviluppano metastasi cerebrali (cio...

Discussione

Il protocollo include diversi passaggi critici. Le cellule devono essere tenute sul ghiaccio per non più di 1 ora per mantenere la vitalità. I dischetti di cotone alcolico devono essere usati per pulire le code dei topi prima dell'iniezione, facendo attenzione a non pulire troppo forte o troppo spesso per evitare di danneggiare la pelle della coda. Assicurarsi che non siano presenti bolle d'aria nella sospensione cellulare, per evitare che i topi muoiano a causa degli emboli dei vasi sanguigni. Mantenere l'angolo di in...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
1000 µL pipette tip filtered	Genesee Scientific	23430
10 mL Serological Pipets	Genesee Scientific	12-112
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	1%
Centrifuge tubes 15 mL bulk	Genesee Scientific	28103
Corning  500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine	GIBICO Inc. USA	MT10080CV
Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific	21-031-CV
Eppendorf centufuge 5810R	Eppendorf
Fetal bovine serum (FBS)	GIBICO Inc. USA	16000044	10%
Fisherbrand  Sterile Cell Strainers (40 μm)	Thermo Fisher Scientific	22-363-547
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	1 µg/mL
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014	5 µg/mL
Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
MDA-IBC3 cell lines	MD Anderson Cancer Center		Generated by Dr. Woodward's lab24
Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid	System Biosciences	BLIV713PA-1
microtubes clear sterile 1.7 mL	Genesee Scientific	24282S
Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile	Genesee Scientific	23-401C
TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent	Genesee Scientific	25-209
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Tail vein injection
C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige	Envigo	SCID/beige mice
BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm)	BD	328466
Plas Labs  Broome-Style Rodent Restrainers	Plas Labs 551BSRR	01-288-32A	Order fromThermo Fisher Scientific
Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof)	Thermo Fisher Scientific	50420872	70 % used
Imaging
BD Lo-Dose  U-100 Insulin Syringes	BD	329461
Disposable PES Filter Units 0.45 µm	Fisherbrand	FB12566501	filter system to sterilize the D-luciferin
D-Luciferin	Biosynth	L8220-1g	stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL
1.7 mL microtube amber	Genesee Scientific	24-282AM
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC-14043-704-06	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
IVIS 200	PerkinElmer		machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine
Plastic Containers with Lids	Fisherbrand	02-544-127
Tissue Cassettes	Thermo Scientific	1000957
Webcol Alcohol Prep	Covidien	6818
Stereomicroscope Imaging
Stereomicroscope AZ100	Nikon	model AZ-STGE	software NIS-ELEMENT
Formalin 10%	Fisher Chemical	SF100-4
TC treated dishes 100x20 mm	Genesee Scientific	25202