炎症性乳癌細胞の尾静脈注射による脳転移のモデル化

要約

内因的にHER2増幅された炎症性乳癌細胞株の尾静脈注射によって生成された乳癌脳転移の異種移植マウスモデルについて説明します。

要約

脳への転移性転移は、多くの種類の癌の一般的で壊滅的な症状です。米国だけでも、毎年約20万人の患者が脳転移と診断されています。原発性乳がんおよび全身性悪性腫瘍の患者の生存転帰の改善において大きな進歩が見られました。しかし、臨床的脳転移患者の悲惨な予後は、この致命的な病気に対する新しい治療薬と戦略を開発する緊急の必要性を浮き彫りにしています。適切な実験モデルの欠如は、脳転移の生物学と治療の理解の進歩を妨げる主要なハードルの1つでした。ここでは、まれで侵攻性の乳がんである炎症性乳がん(IBC)に由来する内因性HER2増幅細胞株の尾静脈注射によって生じる脳転移の異種移植マウスモデルについて説明します。細胞をホタルルシフェラーゼと緑色蛍光タンパク質で標識して脳転移をモニターし、生物発光イメージング、蛍光実体顕微鏡、および組織学的評価によって転移負荷を定量化しました。マウスは頑健かつ一貫して脳転移を発症し、転移過程における主要なメディエーターの調査と新しい治療戦略の前臨床試験の開発を可能にします。

概要

脳転移は、全身性悪性腫瘍の一般的で致命的な合併症です。ほとんどの脳転移は、肺、乳房、または皮膚の原発腫瘍に由来し、これらをまとめて症例の67〜80%を占めています^1,2。脳転移の発生率の推定値は100,000〜240,000例の間で変動し、転移性癌で死亡した患者では剖検がまれであるため、これらの数は過小評価されている可能性があります³。脳転移のある患者は、脳転移のない患者と比較して予後が悪く、全生存期間が低くなります⁴。脳転移に対する現在の治療選択肢は大部分が緩和的であり、^{ほとんどの患者の生存}転帰を改善することができない5。したがって、脳転移は依然として課題であり、より効果的な治療法を開発するために、脳転移の進行メカニズムをよりよく理解することが引き続き急務です。

実験モデルの使用は、脳への乳がん転移進行の特定のメカニズムに関する重要な洞察を提供し、さまざまな治療アプローチの有効性の評価を可能にしました⁶、⁷、⁸、⁹、10、11、12、^{13、14、15、16}.しかし、脳転移の発生の複雑さを正確かつ完全に再現できるモデルはほとんどありません。いくつかの実験的in vivoモデルは、同所性、尾静脈、心臓内、頸動脈内、および脳内注射を含む異なる投与経路によるマウスへの癌細胞の接種によって生成されている。各手法には、他の場所でレビューされているように、^{長所と短所があります 3}.しかし、これらのマウスモデルのいずれも、脳転移の臨床的進行を完全に再現することはできません。

脳転移は、原発性乳がんのまれではあるが攻撃的な変異体である炎症性乳がん(IBC)の患者に特によく見られます。IBCは乳がん症例の1%から4%を占めていますが、米国では乳がん関連の死亡の不釣り合いな10%を占めています^17,18。IBCは急速に転移することが知られています。実際、IBC患者の3分の1は診断時に遠隔転移を持っています^19,20。脳転移に特異的なIBC患者は、非IBC²¹患者よりも脳転移の発生率が高い。最近、マウス異種移植片のIBCの特徴を再現^するER-PR-/HER2⁺ IBC患者の悪性胸水に由来するMDA-IBC3細胞株が、尾静脈注射した場合、マウスの肺転移ではなく脳転移を発症する傾向が亢進することを示し、この細胞株は脳転移の発症を研究するための優れたモデルとなっています¹⁶。

ここでは、MDA-IBC3細胞の尾静脈注射を介して脳転移を生成し、立体蛍光顕微鏡およびルシフェラーゼイメージングを介して転移負荷を評価する手順について説明します。この方法は、脳への乳がん転移の主要なメディエーターを発見し、治療的介入の有効性をテストするために使用されています¹⁶、^22、23。この技術の欠点は、脳転移過程のすべてのステップを再現しないことです。それにもかかわらず、その主な利点には、堅牢性と再現性、血管内投与の関連する転移生物学の関与、肺の横断と脳への血管外漏出、および技術の点での比較的単純さが含まれます。

プロトコル

ここで説明する方法は、MDアンダーソンがんセンターの施設動物管理および使用委員会(IACUC)によって承認されており、実験動物の世話と使用に関する国立衛生研究所のガイドラインに準拠しています。すべての手順を含む回路図のワークフローを 図 1 に示します。

1.細胞調製

注:ウッドワード博士の研究室²⁴で作製されたMDA-IBC3^(ER-/PR^-/HER2⁺)細胞株は、ルシフェラーゼ緑色蛍光タンパク質(Luc-GFP)プラスミドで安定に形質導入されました。

1. 10%ウシ胎児血清(FBS)、1 μg/mLヒドロコルチゾン、5 μg/mLインスリン、および1%抗生物質-抗有糸分裂薬を添加したHam's F-12培地で形質導入細胞を培養します。
2. MDA-IBC3-Luc-GFP細胞をT-75フラスコ中で37°Cおよび5%_CO2 でコンフルエントになるまでプレートする。細胞が継代するのに十分にコンフルエントになる前に、3日ごとに培地を交換してください。
3. 培地を除去し、各フラスコを10 mLの1x ダルベッコ(つまり、カルシウムおよびマグネシウムを含まない)リン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で洗浄し、2 mLの0.25%トリプシン-エチレンジアミン四酢酸(EDTA)を加えて細胞を回収します。細胞が剥離するまで37°Cで3〜5分間インキュベートします。
4. 5 mLの完全な培地をフラスコに加えて細胞を回収し、内容物全体を15 mLの遠沈管に移します(必要な細胞の総数に応じて50 mLの遠沈管に最適化)。290 x g で5分間遠心分離し、細胞をペレット化します。
   注:完全培地は、10%ウシ胎児血清(FBS)、1 μg / mLヒドロコルチゾン、5 μg / mLインスリン、および1%抗生物質抗有糸分裂薬を添加したハムのF-12培地です。
5. 上清を捨てる。次に、10 mLの1x DPBSで細胞を洗浄します。290 x g で5分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を注意深く廃棄します。細胞を1 mLの新鮮な1x DPBSで再懸濁し、上下にピペッティングしてよく混ぜます。
6. 単一細胞懸濁液を作るには、40 μmの滅菌セルストレーナーで細胞をろ過します。
7. 自動セルカウンターを使用してセル密度を計算します。
   注:カウントのエラーを減らすには、異なる細胞希釈液を作成して個別にカウントし、平均値を計算して細胞の濃度(細胞数/ mL)を決定します。
   1. 2 μLの細胞懸濁液+8 μLの1x DPBSを収集して、1:5希釈サンプルを作成します。
   2. 1 μLの細胞懸濁液+9 μLの1x DPBSを収集して、1:10希釈サンプルを作成します。
   3. 10 μLの0.4%トリパンブルーステインを加えます。サンプル混合物を数回上下にピペッティングしてよく混合します。
   4. 10 μLのサンプルを、計数チャンバースライドの半月形のサンプルローディングエリアに静かにピペットで入れます。内部に気泡がないことを確認してください。カウントする前に、細胞がチャンバー内に落ち着くまで30秒待ちます。
8. 細胞を1x DPBSで100 μLあたり5 x 10⁵ または1 x 10⁶ 細胞の密度に希釈します。 細胞懸濁液を1.7 mLマイクロ遠心チューブに移し、尾静脈注射を行います。生存率を維持するために、注射まで細胞を氷の上に置きます。

2.尾静脈注射

1. 4〜6週齢の雌の無胸腺SCID/ベージュマウスを使用します。
2. 30 Gシリンジを準備して、100 μLの細胞懸濁液を吸引します。気泡をすべて取り除きます。
3. マウスをげっ歯類の拘束具(直径約1インチ)に入れて、尾静脈注射を容易にし、注射プロセス中の怪我の動きを防ぎます。
4. アルコール綿パッド(70%エタノール製)を使用して、マウスの尾を3〜4回そっと拭き、5〜10秒間保持して、尾静脈をよりはっきりと見えるようにします。
5. シリンジをマウスの尾に15〜30°の角度で挿入します。細胞懸濁液をゆっくりと尾静脈に押し込みます。
6. 注射器をそっと取り外し、綿パッドを使用して尾を数秒間保持し、出血を防ぎます。
7. マウスをケージに戻し、注射後2〜4時間で副作用が発生しないことを確認します。

3. 脳転移負荷の評価

1. 希釈したD-ルシフェリン溶液を調製する。
   注:ストック濃度は47.6 mM(15.15 mg / mL)で、使用濃度は1.515 mg / mLです。
   1. 5 mLの1x DPBSをD-ルシフェリンボトルに追加します。
   2. 2.5 mLの溶液を2本の50 mLコニカルチューブのそれぞれに入れます。
   3. さらに5 mLの1x DPBSをD-ルシフェリンボトルに再度加えてすすぎます。各50 mLコニカルチューブに2.5 mLを入れます。
   4. さらに5mLの1xDPBSをボトルに入れ、もう一度すすぎます。すすぎプロセスを2回繰り返します。
   5. 各50 mLチューブに1x DPBSを加えて、合計66 mLにします(チューブあたり約33 mL)。各チューブに約33mLの溶液が入っているはずです。
   6. チューブをよく混合し、両方を滅菌ろ過ユニット(150 mL PESフィルター0.45 μm)に混ぜ合わせます。
   7. 溶液をろ過し、ろ過した溶液を滅菌済みの琥珀色の1.7 mLマイクロチューブに分注します。
2. ルシフェラーゼイメージングによる脳転移の検出。
   1. 氷上に保持してD-ルシフェリンを解凍し、マウスに注射する前にボルテックスする。
   2. アルコール綿パッドで注射部位を洗浄し、0.5 mLインスリンシリンジ(ケージごとに1シリンジ)を使用して、マウスあたり100 μLのD-ルシフェリンを腹腔内注射します。
   3. 10分後、小動物誘導室に接続された動物用気化器を使用して、マウスをイソフルラン(2%_O2〜2.5%イソフルラン)で5分間麻酔します。
   4. in vivoイメージングシステムの電源を入れます。最初のケージのマウスが麻酔下にある間に、次のケージのマウスにD-ルシフェリンを注射します。
   5. マウスをin vivoイメージングシステムマシンに入れ、腹側と背側の画像を取得します。2分の露光時間を選択し、フィールドビューでオプションE(全身)を選択します。 [取得]を押します。次に、画像を保存します(図2)。
      注意: 画像にルミネセンスの彩度が表示されている場合は、露光時間を短くしてください。
3. GFPイメージングによる脳転移の検出
   1. 脳組織の準備。
      1. 細胞の注射後約8〜10週間、またはマウスが脳転移のために瀕死の状態にある場合 負荷、IACUCによって承認されたプロトコルに従って、イソフルランの過剰摂取とそれに続く頸部脱臼の吸入によってマウスを安楽死させます。
      2. イソフルランによる安楽死とそれに続く頸部脱臼の後、マウスに70%エタノール溶液をスプレーし、ハサミで頭の部分と耳から毛皮を取り除きます。次に、首の頸部に切り込みを入れます(マウスを斬首しないように注意してください)。頭蓋骨を切り取って引き出します。次に、慎重に脳を取り除きます。
      3. 収集した脳を組織カセットに入れます。
      4. カセットを冷たい1xDPBSの入った容器に移します。
         注意: 脳サンプルは、1xDPBSに1時間以上保持しないでください。複数の脳サンプルを同時に収集する場合は、一度に数匹のマウスのみを安楽死させます(ラウンドごとに10匹)。
   2. 実体顕微鏡イメージング。
      1. 脳全体を100cmのティッシュ皿の蓋に移します。
      2. 実体顕微鏡とUVライトをオンにして、レンズを0.5倍にして、 図3A (赤い四角)に示すように脳全体を視覚化できるようにします。
      3. ライブビューを押します(図3A、緑色の四角)。
      4. 脳が腹側位置にある間にビューに焦点を合わせます。
      5. ソフトウェアでGFP(細胞が GFP 標識されている場合)または TXRED (細胞がRFP標識されている場合)を選択し(図3A、黄色の四角)、顕微鏡で適切なフィルターを選択して写真を撮ります。
         注意: SOLA光源の設定を約30%に保ちます。GFPが明るすぎる場合は、適切な信号が観察されるまで下げます。
      6. サンプルを動かさずに、明るい光をオンにしてBFを選択します(図3A、黄色の四角)。写真を撮ります。
      7. 脳を背側の位置にして前の手順を繰り返します。
         注:サイズによっては、同じGFP陽性の脳転移病変が腹側と背側の両方の位置に現れる可能性があります。このような場合は、同じ病変の重複定量は避けてください。画像をTIFF拡張子(画像ファイル内のすべての情報を保持する)で保存します。
      8. 画像をTIFF拡張子(画像ファイル内のすべての情報を保持する)で保存します。
      9. すべてのサンプルに対して手順を繰り返します。
      10. TIFF画像をJPEGに変換して、関連するソフトウェアがインストールされていない任意のコンピューターでファイルを開くことができるようにします(File |インポート/エクスポート |ファイルを変換します)。
      11. 蛍光画像を明視野画像とマージするには、両方の画像を開いて [ファイル]|チャンネルをマージします。GFPの場合は緑色、BFの場合は明視野の適切なコンポーネントを選択し、[ OK]を押します。結合された画像を保存します。
      12. 脳腫瘍領域を定量化するには、蛍光画像を使用します。 [測定] |手動測定 |エリア。自動選択を選択し(図3B、緑色の四角)、矢印をGFPポジティブ領域に移動してクリックすると、選択が自動的に作成されます。もう一度クリックして選択を確認すると、すべての測定値が表示されます(図3B、赤い四角)。GFP陽性領域が複数存在する場合は、手順を繰り返します。
   3. 脳画像が得られたら、10%中性緩衝ホルマリンを使用した通常の組織固定プロトコルに進みます。
      1. 脳が固定されたら、標準的な組織学的切片作成に進み、続いてヘマトキシリンおよびエオジン染色を行って脳転移の存在を確認し、免疫組織化学的染色を行って選択したマーカーを検出します。
         注:免疫細胞化学は、既知のマーカーの免疫組織化学染色のための標準化されたプロトコルを持つUT MDアンダーソンがんセンターの病理学コアラボで実施されました。

結果

標識細胞が前臨床マウスモデルにおける脳転移のモニタリングと可視化を容易にするという理論的根拠に基づいて、MDA-IBC3細胞にLucおよびGFPでタグを付け、生物発光イメージングと蛍光実体顕微鏡を使用して脳転移をモニターし、転移負荷を定量化しました。免疫不全SCID/ベージュマウスの尾静脈に標識されたMDA-IBC3細胞を注射すると、脳転移を発症したマウスの割合が高くなりました(すなわ...

ディスカッション

プロトコルには、いくつかの重要なステップが含まれています。細胞は生存能力を維持するために1時間以内氷上に保たれるべきです。アルコール綿パッドを使用して、注射前にマウスの尾を拭き、尾の皮膚を傷つけないように強く拭きすぎたり、頻繁に拭いたりしないように注意する必要があります。マウスが血管塞栓で死亡するのを防ぐために、細胞懸濁液に気泡が存在しないことを確認...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
1000 µL pipette tip filtered	Genesee Scientific	23430
10 mL Serological Pipets	Genesee Scientific	12-112
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	1%
Centrifuge tubes 15 mL bulk	Genesee Scientific	28103
Corning  500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine	GIBICO Inc. USA	MT10080CV
Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific	21-031-CV
Eppendorf centufuge 5810R	Eppendorf
Fetal bovine serum (FBS)	GIBICO Inc. USA	16000044	10%
Fisherbrand  Sterile Cell Strainers (40 μm)	Thermo Fisher Scientific	22-363-547
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	1 µg/mL
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014	5 µg/mL
Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
MDA-IBC3 cell lines	MD Anderson Cancer Center		Generated by Dr. Woodward's lab24
Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid	System Biosciences	BLIV713PA-1
microtubes clear sterile 1.7 mL	Genesee Scientific	24282S
Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile	Genesee Scientific	23-401C
TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent	Genesee Scientific	25-209
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Tail vein injection
C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige	Envigo	SCID/beige mice
BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm)	BD	328466
Plas Labs  Broome-Style Rodent Restrainers	Plas Labs 551BSRR	01-288-32A	Order fromThermo Fisher Scientific
Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof)	Thermo Fisher Scientific	50420872	70 % used
Imaging
BD Lo-Dose  U-100 Insulin Syringes	BD	329461
Disposable PES Filter Units 0.45 µm	Fisherbrand	FB12566501	filter system to sterilize the D-luciferin
D-Luciferin	Biosynth	L8220-1g	stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL
1.7 mL microtube amber	Genesee Scientific	24-282AM
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC-14043-704-06	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
IVIS 200	PerkinElmer		machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine
Plastic Containers with Lids	Fisherbrand	02-544-127
Tissue Cassettes	Thermo Scientific	1000957
Webcol Alcohol Prep	Covidien	6818
Stereomicroscope Imaging
Stereomicroscope AZ100	Nikon	model AZ-STGE	software NIS-ELEMENT
Formalin 10%	Fisher Chemical	SF100-4
TC treated dishes 100x20 mm	Genesee Scientific	25202