Modelando Metástase Cerebral Via Injeção Venosa Caudal de Células Inflamatórias de Câncer de Mama

Resumo

Descrevemos um modelo de metástase cerebral de câncer de mama em camundongos xenoenxerto gerada por injeção na veia caudal de uma linhagem de células inflamatórias de câncer de mama amplificadas endogenamente por HER2.

Resumo

A disseminação metastática para o cérebro é uma manifestação comum e devastadora de muitos tipos de câncer. Só nos Estados Unidos, cerca de 200 mil pacientes são diagnosticados com metástases cerebrais a cada ano. Progressos significativos foram feitos na melhoria dos resultados de sobrevida para pacientes com câncer de mama primário e neoplasias sistêmicas; No entanto, o prognóstico sombrio para pacientes com metástases cerebrais clínicas destaca a necessidade urgente de desenvolver novos agentes terapêuticos e estratégias contra essa doença mortal. A falta de modelos experimentais adequados tem sido um dos principais obstáculos que impedem o avanço de nossa compreensão da biologia e do tratamento de metástases cerebrais. Neste trabalho, descrevemos um modelo de metástase cerebral em camundongos xenoenxerto gerado por injeção na veia caudal de uma linhagem celular endogenamente amplificada por HER2 derivada de câncer de mama inflamatório (IBC), uma forma rara e agressiva de câncer de mama. As células foram marcadas com luciferase de vagalume e proteína verde de fluorescência para monitorar metástases cerebrais e quantificadas carga metastática por imagem de bioluminescência, estereomicroscopia fluorescente e avaliação histológica. Camundongos desenvolvem metástases cerebrais de forma robusta e consistente, permitindo a investigação de mediadores-chave no processo metastático e o desenvolvimento de testes pré-clínicos de novas estratégias de tratamento.

Introdução

Metástases cerebrais são complicações comuns e mortais de neoplasias malignas sistêmicas. A maioria das metástases cerebrais origina-se de tumores primários de pulmão, mama ou pele, que coletivamente representam 67-80% dos^casos1,2. As estimativas da incidência de metástases cerebrais variam entre 100.000 e 240.000 casos, e esses números podem estar subestimados, pois a autópsia é rara em pacientes que morreram de câncer metastático³. Pacientes com metástases cerebrais têm pior prognóstico e menor sobrevida global em relação aos pacientes sem metástases cerebrais⁴. As opções atuais de tratamento para metástases cerebrais são, em grande parte, paliativas e não melhoram os resultados de sobrevida da maioria dos pacientes⁵. Assim, a metástase cerebral permanece um desafio, e a necessidade permanece premente para entender melhor os mecanismos de progressão da metástase cerebral para desenvolver terapias mais eficazes.

O uso de modelos experimentais tem fornecido importantes informações sobre mecanismos específicos de progressão metastática do câncer de mama para o cérebro e permitido avaliar a eficácia de várias abordagens terapêuticas6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . No entanto, poucos modelos podem recapitular com precisão e total os meandros do desenvolvimento de metástases cerebrais. Vários modelos experimentais in vivo foram gerados via inoculação de células cancerosas em camundongos por diferentes vias de administração, incluindo injeções ortotópicas, venosas caudais, intracardíacas, intracarotídeas arteriais e intracerebrais. Cada técnica apresenta vantagens e desvantagens, conforme revisado em outra edição³. Nenhum desses modelos de camundongo, no entanto, pode replicar totalmente a progressão clínica da metástase cerebral.

Metástases cerebrais são particularmente comuns em pacientes com câncer de mama inflamatório (IBC), uma variante rara, mas agressiva, do câncer de mama primário. O IBC é responsável por 1% a 4% dos casos de câncer de mama, mas é responsável por 10% desproporcionais das mortes relacionadas ao câncer de mama nos Estados Unidos^17,18. Sabe-se que o IBC metástase rapidamente; de fato, um terço dos pacientes com CIG apresenta metástases à distância no momento do diagnóstico^19,20. Especificamente para metástases cerebrais, pacientes com CIM têm maior incidência de metástases cerebrais do que pacientes sem CBI²¹. Recentemente, demonstramos que a linhagem celular MDA-IBC3, derivada do líquido de derrame pleural maligno de um paciente com IBC ER-/PR^-/HER2⁺ que recapitula as características do IBC em xenoenxertos de camundongos, tem maior propensão a desenvolver metástases cerebrais em vez de metástases pulmonares em camundongos quando injetada pela veia caudal, tornando essa linhagem celular um bom modelo para estudar o desenvolvimento de metástases^cerebrais16.

Descrevemos os procedimentos para gerar metástases cerebrais via injeção na veia caudal de células MDA-IBC3 e avaliar a carga metastática via microscopia estereofluorescente e imagem com luciferase. Esse método tem sido utilizado para descobrir mediadores-chave da metástase do câncer de mama para o cérebro e testar a eficácia de intervenções terapêuticas 16,22,23. A desvantagem desta técnica é que ela não recapitula todas as etapas do processo metastático cerebral. No entanto, suas principais vantagens incluem robustez e reprodutibilidade, envolvimento da biologia relevante da metástase do intravasamento, atravessando os pulmões e extravasamento para o cérebro, e sua relativa simplicidade em termos de técnica.

Protocolo

O método aqui descrito foi aprovado pelo Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) do MD Anderson Cancer Center e está em conformidade com as Diretrizes do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O fluxo de trabalho esquemático, com todas as etapas incluídas, é apresentado como Figura 1.

1. Preparação celular

NOTA: A linhagem celular MDA-IBC3 (ER-/PR^-/HER2⁺), gerada no laboratório²⁴ do Dr. Woodward, foi transduzida de forma estável com um plasmídeo de proteína fluorescente verde luciferase (Luc-GFP).

1. Cultura de células transduzidas em meio F-12 de Ham, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 1 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina e 1% de antibiótico-antimitótico.
2. Placa MDA-IBC3-Luc-GFP a 37 °C e 5% CO₂ em frasco T-75 até confluente. Troque de meio a cada 3 dias antes que as células sejam confluentes o suficiente para passar.
3. Colher as células removendo o meio, lavando cada frasco com 10 mL de solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de 1x Dulbecco (i.e., isento de cálcio e magnésio) e adicionando 2 mL de ácido tripsina-etilenodiaminotetracético (EDTA) a 0,25%. Incubar durante 3-5 minutos a 37 °C até que as células se desprendam.
4. Adicionar 5 mL de meio completo ao balão para coletar as células e transferir todo o conteúdo para um tubo de centrífuga de 15 mL (otimizado para 50 mL de tubo de centrífuga, dependendo do número total de células necessárias). Centrifugar a 290 x g por 5 min para células de pellets.
   NOTA: O meio completo é o meio F-12 de Ham, suplementado com 10% de soro fetal bovino (SFB), 1 μg/mL de hidrocortisona, 5 μg/mL de insulina e 1% de antibiótico-antimitótico.
5. Descarte o sobrenadante. Em seguida, lave as células com 10 mL de 1x DPBS. Centrifugar a 290 x g por 5 min para peletizar as células e descartar o sobrenadante cuidadosamente. Ressuspenda as células com 1 mL de 1x DPBS fresco e misture bem pipetando para cima e para baixo.
6. Para fazer suspensões de célula única, filtre as células através de filtros de células estéreis de 40 μm.
7. Calcule a densidade celular usando um contador de células automatizado.
   NOTA: Para reduzir os erros na contagem, crie diferentes diluições de células e conte-as separadamente e calcule o valor médio para determinar a concentração de células (número de células/mL).
   1. Recolher 2 μL de suspensão celular + 8 μL de 1x DPBS para fazer uma amostra de diluição 1:5.
   2. Recolher 1 μL de suspensão celular + 9 μL de 1x DPBS para fazer uma amostra de diluição 1:10.
   3. Adicionar 10 μL de coloração azul de tripano a 0,4%. Misture bem a mistura da amostra, pipetando-a para cima e para baixo algumas vezes.
   4. Pipetar suavemente 10 μL da amostra para a área de carregamento da amostra em forma de meia-lua das lâminas da câmara de contagem. Certifique-se de que não há bolhas dentro; Aguarde 30 s para permitir que as celas se acomodem na câmara antes de contar.
8. Diluir as células com 1x DPBS para uma densidade de 5 x 10⁵ ou 1 x 10⁶ células por 100 μL. Transfira a suspensão celular para tubos de microcentrífuga de 1,7 mL para injeção na veia caudal. Coloque as células no gelo até a injeção para manter a viabilidade.

2. Injeção da veia caudal

1. Use camundongos SCID/bege fêmeas de 4 a 6 semanas de idade.
2. Prepare uma seringa de 30 G para retirar 100 μL de suspensão celular. Remova todas as bolhas de ar.
3. Coloque o rato num redutor de roedores (diâmetro de cerca de 1 polegada) para facilitar a injeção da veia caudal e evitar lesões durante o processo de injeção.
4. Use almofadas de algodão com álcool (feitas com etanol 70%) para limpar suavemente a cauda do rato 3-4 vezes e segure por 5-10 s para tornar a veia da cauda mais claramente visível.
5. Introduza a seringa na cauda do rato num ângulo de 15-30°. Empurre lentamente a suspensão celular para a veia da cauda.
6. Retire a seringa suavemente e use o algodão para segurar a cauda por alguns segundos para ajudar a parar qualquer sangramento.
7. Devolva os ratos às suas gaiolas e verifique-os 2-4 h após a injeção para garantir que não ocorram efeitos adversos.

3. Avaliação da carga de metástases cerebrais

1. Preparar solução diluída de D-luciferina.
   NOTA: A concentração de estoque é de 47,6 mM (15,15 mg/mL), e a concentração para uso é de 1,515 mg/mL.
   1. Adicionar 5 mL de 1x DPBS ao frasco de D-luciferina.
   2. Colocar 2,5 ml da solução em cada um dos dois tubos cónicos de 50 ml.
   3. Adicione mais 5 mL de 1x DPBS ao frasco de D-luciferina novamente para enxaguar. Colocar 2,5 mL em cada tubo cônico de 50 mL.
   4. Coloque mais 5 mL de 1x DPBS no frasco e enxágue novamente. Repita o processo de enxágue duas vezes.
   5. Adicione 1x DPBS a cada tubo de 50 mL para um total de 66 mL (cerca de 33 mL por tubo). Deve haver cerca de 33 mL da solução em cada tubo.
   6. Misture bem os tubos e, em seguida, combine ambos em uma unidade de filtração estéril (filtro de PES de 150 mL 0,45 μm).
   7. Filtrar a solução e, em seguida, aliquotar a solução filtrada em microtubos âmbar estéreis de 1,7 ml.
2. Detecção de metástases cerebrais por imagem de luciferase.
   1. Descongelar a D-luciferina mantendo o gelo e o vórtice antes da injeção nos ratos.
   2. Limpe a área de injeção com almofadas de algodão de álcool e injete 100 μL de D-luciferina por camundongo por via intraperitoneal usando uma seringa de insulina de 0,5 mL, uma seringa para cada gaiola.
   3. Após 10 min, anestesiar os camundongos com isoflurano (2% O 2-_2,5% isoflurano) por 5 min usando o vaporizador veterinário conectado à câmara de indução do pequeno animal.
   4. Ligue o sistema de imagem in vivo. Enquanto os camundongos da primeira gaiola estiverem sob anestesia, injete a D-luciferina nos camundongos da próxima gaiola.
   5. Coloque camundongos na máquina do sistema de imagem in vivo e obtenha imagens ventrais e dorsais. Selecione um tempo de exposição de 2 min e, na visualização de campo, escolha a opção E (corpo inteiro). Pressione Adquirir. Em seguida, salve a imagem (Figura 2).
      NOTA: Se a imagem apresentar saturação de luminescência, reduza o tempo de exposição.
3. Detecção de metástases cerebrais por imagem de GFP.
   1. Preparação do tecido cerebral.
      1. Cerca de 8-10 semanas após a injeção de células ou quando os camundongos estão moribundos devido à carga de metástase cerebral, eutanasiar os camundongos por inalação de uma overdose de isoflurano seguida de luxação cervical, de acordo com os protocolos aprovados pela IACUC.
      2. Após a eutanásia com isoflurano seguida de deslocamento cervical, pulverizar os camundongos com uma solução de etanol a 70% e remover o pelo da área da cabeça e orelhas com tesoura. Em seguida, faça um corte na região cervical do pescoço (tomando cuidado para não decapitar o rato). Corte o crânio e retire-o. Em seguida, remova cuidadosamente o cérebro.
      3. Coloque os cérebros coletados em de tecido.
      4. Transfira os para um recipiente com 1x DPBS frio.
         NOTA: As amostras de cérebro não devem ser mantidas em 1x DPBS por mais de 1 h. Se forem recolhidas várias amostras cerebrais ao mesmo tempo, eutanasiar apenas alguns ratinhos de cada vez (10 por ronda).
   2. Imagem estereomicroscópica.
      1. Transfira todo o cérebro para uma tampa de prato de tecido de 100 cm.
      2. Ligue o estereomicroscópio e a luz UV, na posição 3 com lente 0,5x, para permitir a visualização de todo o cérebro como mostra a Figura 3A (quadrado vermelho).
      3. Pressione Visualização dinâmica (Figura 3A, quadrado verde).
      4. Concentre a visão enquanto o cérebro está na posição ventral.
      5. Selecione GFP (se as células forem marcadas com GFP ) ou TXRED (se as células forem marcadas com RFP) (Figura 3A, quadrado amarelo) no software, selecione o filtro apropriado no microscópio e tire uma foto.
         NOTA: Mantenha a configuração da fonte de luz SOLA em cerca de 30%; se a GFP for muito brilhante, reduza até que o sinal adequado seja observado.
      6. Sem mover a amostra, acenda a luz brilhante e selecione BF (Figura 3A, quadrado amarelo). Tire uma foto.
      7. Repita os passos anteriores com o cérebro na posição dorsal.
         NOTA: Dependendo do tamanho, a mesma lesão de metástase cerebral positiva para GFP pode aparecer nas posições ventral e dorsal. Nesse caso, evitar a quantificação duplicada da mesma lesão. Salve as imagens com uma extensão TIFF (que mantém todas as informações no arquivo de imagem).
      8. Salve as imagens com uma extensão TIFF (que mantém todas as informações no arquivo de imagem).
      9. Repita as etapas para todas as amostras.
      10. Converta as imagens TIFF em JPEG para que os arquivos possam ser abertos com qualquer computador que não tenha o software associado instalado (Arquivo | Importação/Exportação | converter arquivos).
      11. Para mesclar a imagem fluorescente com a imagem de campo brilhante, abra as duas imagens e vá para Arquivo | Mesclar canais. Selecione os componentes adequados, verde para GFP e brightfield para BF e pressione Ok. Salve a imagem mesclada.
      12. Para quantificar a área do tumor cerebral, use a imagem fluorescente. Selecione Medida | Medição Manual | área. Selecione a seleção automática (Figura 3B, quadrado verde), mova a seta para a área positiva para GFP e clique para criar automaticamente uma seleção. Clique novamente para confirmar a seleção e, em seguida, todas as medidas serão exibidas (Figura 3B, quadrado vermelho). Se mais de uma área positiva para GFP estiver presente, repita o procedimento.
   3. Após a obtenção das imagens cerebrais, proceder-se aos protocolos rotineiros de fixação tecidual com formalina tamponada a 10%.
      1. Uma vez fixados os cérebros, proceder-se ao corte histológico padrão, seguido de coloração de hematoxilina e eosina para confirmar a presença de metástases cerebrais e coloração imuno-histoquímica para detectar marcadores selecionados.
         NOTA: A imunocitoquímica foi realizada no Laboratório do Núcleo de Patologia do UT MD Anderson Cancer Center, que padronizou o protocolo para coloração imuno-histoquímica de marcadores conhecidos.

Resultados

Com o raciocínio de que as células marcadas facilitam o monitoramento e a visualização de metástases cerebrais em modelos pré-clínicos de camundongos, marcamos células MDA-IBC3 com Luc e com GFP para monitorar metástases cerebrais e quantificar a carga metastática usando imagens de bioluminescência e estereomicroscopia fluorescente. A injeção de células MDA-IBC3 marcadas nas veias caudais de camundongos SCID/Beige imunocomprometidos resultou em altas porcentagens de camundongos desenvolvendo metástases cer...

Discussão

O protocolo inclui várias etapas críticas. As células devem ser mantidas no gelo por não mais de 1 hora para manter a viabilidade. Almofadas de algodão com álcool devem ser usadas para limpar as caudas dos ratos antes da injeção, com cuidado para não limpar com muita força ou com muita frequência para evitar danificar a pele da cauda. Certifique-se de que não há bolhas de ar presentes na suspensão celular, para evitar que os ratos morram de êmbolos dos vasos sanguíneos. Mantenha o ângulo de injeção a 4...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
1000 µL pipette tip filtered	Genesee Scientific	23430
10 mL Serological Pipets	Genesee Scientific	12-112
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	1%
Centrifuge tubes 15 mL bulk	Genesee Scientific	28103
Corning  500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine	GIBICO Inc. USA	MT10080CV
Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific	21-031-CV
Eppendorf centufuge 5810R	Eppendorf
Fetal bovine serum (FBS)	GIBICO Inc. USA	16000044	10%
Fisherbrand  Sterile Cell Strainers (40 μm)	Thermo Fisher Scientific	22-363-547
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	1 µg/mL
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014	5 µg/mL
Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
MDA-IBC3 cell lines	MD Anderson Cancer Center		Generated by Dr. Woodward's lab24
Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid	System Biosciences	BLIV713PA-1
microtubes clear sterile 1.7 mL	Genesee Scientific	24282S
Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile	Genesee Scientific	23-401C
TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent	Genesee Scientific	25-209
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Tail vein injection
C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige	Envigo	SCID/beige mice
BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm)	BD	328466
Plas Labs  Broome-Style Rodent Restrainers	Plas Labs 551BSRR	01-288-32A	Order fromThermo Fisher Scientific
Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof)	Thermo Fisher Scientific	50420872	70 % used
Imaging
BD Lo-Dose  U-100 Insulin Syringes	BD	329461
Disposable PES Filter Units 0.45 µm	Fisherbrand	FB12566501	filter system to sterilize the D-luciferin
D-Luciferin	Biosynth	L8220-1g	stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL
1.7 mL microtube amber	Genesee Scientific	24-282AM
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC-14043-704-06	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
IVIS 200	PerkinElmer		machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine
Plastic Containers with Lids	Fisherbrand	02-544-127
Tissue Cassettes	Thermo Scientific	1000957
Webcol Alcohol Prep	Covidien	6818
Stereomicroscope Imaging
Stereomicroscope AZ100	Nikon	model AZ-STGE	software NIS-ELEMENT
Formalin 10%	Fisher Chemical	SF100-4
TC treated dishes 100x20 mm	Genesee Scientific	25202