İnflamatuar Meme Kanseri Hücrelerinin Kuyruk-Ven Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Özet

Endojen olarak HER2 ile amplifiye edilmiş inflamatuar meme kanseri hücre hattının kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla üretilen meme kanseri beyin metastazının bir ksenogreft fare modelini tanımladık.

Özet

Beyne metastatik yayılım, birçok kanser türünün yaygın ve yıkıcı bir tezahürüdür. Sadece Amerika Birleşik Devletleri'nde her yıl yaklaşık 200.000 hastaya beyin metastazı teşhisi konmaktadır. Primer meme kanseri ve sistemik maligniteleri olan hastalar için sağkalım sonuçlarının iyileştirilmesinde önemli ilerleme kaydedilmiştir; Bununla birlikte, klinik beyin metastazı olan hastalar için kasvetli prognoz, bu ölümcül hastalığa karşı yeni terapötik ajanlar ve stratejiler geliştirmeye acil ihtiyaç olduğunu vurgulamaktadır. Uygun deneysel modellerin olmaması, beyin metastazı biyolojisi ve tedavisi konusundaki anlayışımızın ilerlemesini engelleyen en büyük engellerden biri olmuştur. Burada, nadir ve agresif bir meme kanseri formu olan inflamatuar meme kanserinden (IBC) türetilen endojen olarak HER2 ile amplifiye edilmiş bir hücre hattının kuyruk veni enjeksiyonu yoluyla üretilen bir ksenogreft fare beyin metastazı modelini açıklıyoruz. Hücreler, beyin metastazını izlemek için ateşböceği lusiferaz ve yeşil floresan proteini ile etiketlendi ve biyolüminesans görüntüleme, floresan stereomikroskopi ve histolojik değerlendirme ile metastatik yükü ölçtü. Fareler sağlam ve tutarlı bir şekilde beyin metastazları geliştirir, bu da metastatik süreçteki anahtar aracıların araştırılmasına ve yeni tedavi stratejilerinin klinik öncesi testlerinin geliştirilmesine olanak tanır.

Giriş

Beyin metastazı, sistemik malignitelerin sık görülen ve ölümcül bir komplikasyonudur. Beyin metastazlarının çoğu, toplu olarak vakaların% 67-80'ini oluşturan akciğer, meme veya cildin primer tümörlerinden kaynaklanır ^1,2. Beyin metastazı insidansı tahminleri 100.000 ila 240.000 vaka arasında değişmektedir ve bu sayılar metastatik kanserden ölen hastalar için otopsi nadir olduğu için hafife alınabilir³. Beyin metastazı olan hastalar, beyin metastazı olmayan hastalara göre daha kötü prognoza ve daha düşük genel sağkalıma sahiptir⁴. Beyin metastazları için mevcut tedavi seçenekleri büyük ölçüde palyatiftir ve çoğu hasta için sağkalım sonuçlarını iyileştirmede başarısız^{olur 5}. Bu nedenle, beyin metastazı bir zorluk olmaya devam etmektedir ve daha etkili tedaviler geliştirmek için beyin metastazı ilerleme mekanizmalarını daha iyi anlama ihtiyacı devam etmektedir.

Deneysel modellerin kullanımı, meme kanserinin beyne metastatik ilerlemesinin spesifik mekanizmaları hakkında önemli bilgiler sağlamış ve çeşitli terapötik yaklaşımların etkinliğinin değerlendirilmesine izin vermiştir 6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 . Bununla birlikte, çok az sayıda model beyin metastazı gelişiminin inceliklerini doğru ve tam olarak özetleyebilir. Ortotopik, kuyruk damarı, intrakardiyak, intrakarotis arteriyel ve intraserebral enjeksiyonlar dahil olmak üzere farklı uygulama yollarıyla kanser hücrelerinin farelere aşılanması yoluyla birkaç deneysel in vivo model oluşturulmuştur. Her tekniğin avantajları ve dezavantajları vardır, başka bir yerde gözden geçirildiği gibi³. Bununla birlikte, bu fare modellerinin hiçbiri beyin metastazının klinik ilerlemesini tam olarak kopyalayamaz.

Beyin metastazları, primer meme kanserinin nadir fakat agresif bir varyantı olan inflamatuar meme kanseri (IBC) hastalarında özellikle yaygındır. IBC, meme kanseri vakalarının %1 ila %4'ünü oluşturur, ancak Amerika Birleşik Devletleri'nde meme kanserine bağlı ölümlerin orantısız bir şekilde %10'undan sorumludur^17,18. IBC'nin hızla metastaz yaptığı bilinmektedir; Gerçekten de, IBC hastalarının üçte birinde tanı anında uzak metastaz vardır^19,20. Beyin metastazı spesifik olarak, IBC'li hastalarda beyin metastazı insidansı, IBC olmayan hastalara göre daha yüksektir²¹. Son zamanlarda, fare ksenogreftlerinde IBC özelliklerini özetleyen ^ER-/PR-/HER2⁺ IBC'li bir hastanın malign plevral efüzyon sıvısından türetilen MDA-IBC3 hücre hattının, kuyruk damarı ile enjekte edildiğinde farelerde akciğer metastazlarından ziyade beyin metastazı geliştirme eğiliminin arttığını gösterdik, bu da bu hücre hattını beyin metastazının gelişimini incelemek için iyi bir model haline getirdi¹⁶.

Burada, MDA-IBC3 hücrelerinin kuyruk-ven enjeksiyonu ile beyin metastazı oluşturma ve stereofloresan mikroskopi ve lusiferaz görüntüleme ile metastatik yükü değerlendirme prosedürleri açıklanmaktadır. Bu yöntem, meme kanseri metastazının beyne anahtar aracılarını keşfetmek ve terapötik müdahalelerin etkinliğini test etmek için kullanılmıştır 16,22,23. Bu tekniğin dezavantajı, beyin metastatik sürecindeki tüm adımları özetlememesidir. Bununla birlikte, başlıca avantajları arasında sağlamlık ve tekrarlanabilirlik, intravazasyonun ilgili metastaz biyolojisinin katılımı, akciğerleri geçme ve beyne ekstravazasyon ve teknik açıdan göreceli basitliği sayılabilir.

Protokol

Burada açıklanan yöntem, MD Anderson Kanser Merkezi'nin Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır ve Laboratuvar Hayvanlarının Bakımı ve Kullanımı için Ulusal Sağlık Enstitüleri Kılavuzları ile uyumludur. Şematik iş akışı, tüm adımlarla birlikte Şekil 1'de sunulmuştur.

1. Hücre hazırlığı

NOT: Dr. Woodward'ın laboratuvarında^24'te üretilen MDA-IBC3 ^(ER-/PR^-/HER2⁺) hücre hattı, bir lusiferaz-yeşil floresan proteini (Luc-GFP) plazmidi ile stabil bir şekilde transdüksiyona tabi tutuldu.

1. %10 fetal sığır serumu (FBS), 1 μg/mL hidrokortizon, 5 μg/mL insülin ve %1 antibiyotik-antimitotik ile takviye edilmiş Ham'ın F-12 ortamındaki kültür transdüksiyonlu hücreler.
2. MDA-IBC3-Luc-GFP hücrelerini 37 ° C'de ve% 5 CO₂ birleşene kadar bir T-75 şişesinde plakalayın. Hücreler geçiş için yeterince birleşene kadar her 3 günde bir ortamı değiştirin.
3. Ortamı çıkararak, her şişeyi 10 mL 1x Dulbecco'nun (yani kalsiyum ve magnezyum içermeyen) fosfat tamponlu salin (DPBS) ile yıkayarak ve 2 mL %0.25 tripsin-etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ekleyerek hücreleri hasat edin. Hücreler ayrılana kadar 37 ° C'de 3-5 dakika inkübe edin.
4. Hücreleri toplamak ve tüm içeriği 15 mL'lik bir santrifüj tüpüne (ihtiyaç duyulan toplam hücre sayısına bağlı olarak 50 mL santrifüj tüpüne optimize edilmiş) aktarmak için şişeye 5 mL tam ortam ekleyin. Pelet hücrelerine 5 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin.
   NOT: Komple besiyeri, %10 fetal sığır serumu (FBS), 1 μg/mL hidrokortizon, 5 μg/mL insülin ve %1 antibiyotik-antimitotik ile desteklenmiş Ham'ın F-12 besiyeridir.
5. Süpernatanı atın. Ardından hücreleri 10 mL 1x DPBS ile yıkayın. Hücreleri peletlemek için 5 dakika boyunca 290 x g'da santrifüjleyin ve süpernatanı dikkatlice atın. Hücreleri 1 mL taze 1x DPBS ile tekrar süspanse edin ve yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
6. Tek hücreli süspansiyonlar yapmak için, hücreleri 40 μm steril hücre süzgeçlerinden süzün.
7. Otomatik hücre sayacı kullanarak hücre yoğunluğunu hesaplayın.
   NOT: Sayımdaki hataları azaltmak için, farklı hücre seyreltmeleri oluşturun ve bunları ayrı ayrı sayın ve hücrelerin konsantrasyonunu (hücre sayısı/mL) belirlemek için ortalama değeri hesaplayın.
   1. 1:5 seyreltme numunesi yapmak için 2 μL hücre süspansiyonu + 8 μL 1x DPBS toplayın.
   2. 1:10 seyreltme numunesi yapmak için 1 μL hücre süspansiyonu + 9 μL 1x DPBS toplayın.
   3. 10 μL% 0.4 tripan mavisi lekesi ekleyin. Numune karışımını birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyerek iyice karıştırın.
   4. Numunenin 10 μL'sini sayım odası slaytlarının yarım ay şeklindeki numune yükleme alanına nazikçe pipetleyin. İçeride kabarcık olmadığından emin olun; Saymadan önce hücrelerin hazneye yerleşmesi için 30 saniye bekleyin.
8. Hücreleri 1x DPBS ile 100 μL başına 5 x 10⁵ veya 1 x 10⁶ hücre yoğunluğuna seyreltin. Kuyruk damarı enjeksiyonu için hücre süspansiyonunu 1.7 mL mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Canlılığı korumak için hücreleri enjeksiyona kadar buzun üzerine yerleştirin.

2. Kuyruk damar enjeksiyonu

1. 4 ila 6 haftalık dişi timik SCID / Bej fareler kullanın.
2. 100 μL hücre süspansiyonu çekmek için 30 G'lik bir şırınga hazırlayın. Tüm hava kabarcıklarını çıkarın.
3. Kuyruk damarı enjeksiyonunu kolaylaştırmak ve enjeksiyon işlemi sırasında hareketten kaynaklanan yaralanmaları önlemek için fareyi bir kemirgen tutucuya (yaklaşık 1 inç çapında) yerleştirin.
4. Farenin kuyruğunu 3-4 kez nazikçe silmek için alkollü pamuklu pedler (%70 etanolden yapılmış) kullanın ve kuyruk damarını daha net görünür hale getirmek için 5-10 saniye basılı tutun.
5. Şırıngayı farenin kuyruğuna 15-30° açıyla yerleştirin. Hücre süspansiyonunu yavaşça kuyruk damarına doğru itin.
6. Şırıngayı nazikçe çıkarın ve herhangi bir kanamayı durdurmaya yardımcı olmak için kuyruğu birkaç saniye tutmak için pamuklu pedi kullanın.
7. Fareleri kafeslerine geri koyun ve herhangi bir yan etki oluşmadığından emin olmak için enjeksiyondan 2-4 saat sonra kontrol edin.

3. Beyin metastaz yükünün değerlendirilmesi

1. Seyreltilmiş D-lusiferin çözeltisi hazırlayın.
   NOT: Stok konsantrasyonu 47.6 mM (15.15 mg/mL) ve kullanım konsantrasyonu 1.515 mg/mL'dir.
   1. D-lusiferin şişesine 5 mL 1x DPBS ekleyin.
   2. İki adet 50 mL'lik konik tüpün her birine 2,5 mL çözelti yerleştirin.
   3. Durulamak için tekrar D-lusiferin şişesine 5 mL 1x DPBS daha ekleyin. Her 50 mL'lik konik tüpe 2,5 mL koyun.
   4. Şişeye 5 mL daha 1x DPBS koyun ve tekrar durulayın. Durulama işlemini iki kez tekrarlayın.
   5. Her 50 mL'lik tüpe toplam 66 mL'ye (tüp başına yaklaşık 33 mL) 1x DPBS ekleyin. Her tüpte yaklaşık 33 mL çözelti bulunmalıdır.
   6. Tüpleri iyice karıştırın ve ardından her ikisini de steril bir filtreleme ünitesinde (150 mL PES filtresi 0,45 μm) birleştirin.
   7. Çözeltiyi süzün ve ardından filtrelenmiş çözeltiyi steril kehribar 1.7 mL mikrotüplere ayırın.
2. Lusiferaz görüntüleme ile beyin metastazlarını tespit etmek.
   1. D-lusiferini buz üzerinde tutarak çözün ve farelere enjeksiyondan önce girdap yapın.
   2. Enjeksiyon alanını alkollü pamuklu pedlerle temizleyin ve her kafes için bir şırınga olmak üzere 0.5 mL'lik bir insülin şırıngası kullanarak intraperitoneal olarak fare başına 100 μL D-lusiferin enjekte edin.
   3. 10 dakika sonra, küçük hayvan indüksiyon odasına bağlı veteriner buharlaştırıcıyı kullanarak fareleri izofluran (% 2 O 2 -%_2.5 izofluran) ile 5 dakika boyunca uyuşturun.
   4. In vivo görüntüleme sistemini açın. İlk kafesteki fareler anestezi altındayken, D-lusiferin'i bir sonraki kafesteki farelere enjekte edin.
   5. Fareleri in vivo görüntüleme sistemi makinesine koyun ve ventral ve dorsal görüntüler elde edin. 2 dakikalık bir pozlama süresi seçin ve alan görünümünde E seçeneğini (tüm vücut) seçin. Al'a basın. Ardından, görüntüyü kaydedin (Şekil 2).
      NOT: Görüntü lüminesans doygunluğu gösteriyorsa, pozlama süresini azaltın.
3. GFP görüntüleme ile beyin metastazlarını tespit etmek.
   1. Beyin dokusu hazırlığı.
      1. Hücrelerin enjeksiyonundan yaklaşık 8-10 hafta sonra veya fareler beyin metastaz yükü nedeniyle can çekiştiğinde, IACUC tarafından onaylanan protokollere uygun olarak, bir izofluran doz aşımını soluyarak fareleri ötenazi yapın ve ardından servikal çıkık yapın.
      2. İzofluran ile ötenaziden ve ardından servikal çıkıktan sonra, farelere% 70 etanol çözeltisi püskürtün ve kürkü baş bölgesinden ve kulaklardan makasla çıkarın. Daha sonra, boynun servikal bölgesinde bir kesim yapın (farenin başını kesmemeye dikkat edin). Kafatasını kesin ve dışarı çekin. Sonra, beyni dikkatlice çıkarın.
      3. Toplanan beyinleri doku kasetlerine yerleştirin.
      4. Kasetleri soğuk 1x DPBS'li bir kaba aktarın.
         NOT: Beyin örnekleri 1x DPBS'de 1 saatten fazla tutulmamalıdır. Aynı anda birkaç beyin örneği toplanacaksa, bir seferde sadece birkaç fareye ötenazi yapın (tur başına 10).
   2. Steremikroskobik görüntüleme.
      1. Tüm beyni 100 cm'lik bir doku kabı kapağına aktarın.
      2. Şekil 3A'da (kırmızı kare) gösterildiği gibi tüm beynin görselleştirilmesine izin vermek için stereomikroskobu ve UV ışığını 3x lens ile 0.5x konumunda açın.
      3. Basın Canlı view (Şekil 3A, yeşil kare).
      4. Beyin ventral pozisyondayken görüşe odaklanın.
      5. Yazılımda GFP'yi (hücreler GFP etiketliyse) veya TXRED'i (hücreler RFP etiketliyse) (Şekil 3A, sarı kare) seçin, mikroskopta uygun filtreyi seçin ve bir resim çekin.
         NOT: SOLA ışık kaynağı ayarını yaklaşık %30'da tutun; GFP çok parlaksa, uygun sinyal gözlemlenene kadar azaltın.
      6. Numuneyi hareket ettirmeden parlak ışığı açın ve BF'yi seçin (Şekil 3A, sarı kare). Bir fotoğraf çekin.
      7. Beyin sırt pozisyonundayken önceki adımları tekrarlayın.
         NOT: Büyüklüğüne bağlı olarak, aynı GFP pozitif beyin metastazı lezyonu hem ventral hem de dorsal pozisyonlarda ortaya çıkabilir. Böyle bir durumda, aynı lezyonun tekrarlanmasından kaçının. Görüntüleri bir TIFF uzantısıyla kaydedin (tüm bilgileri resim dosyasında tutar).
      8. Görüntüleri bir TIFF uzantısıyla kaydedin (tüm bilgileri resim dosyasında tutar).
      9. Tüm örnekler için adımları tekrarlayın.
      10. TIFF görüntülerini JPEG'e dönüştürün, böylece dosyalar ilişkili yazılımın yüklü olmadığı herhangi bir bilgisayarla açılabilir (Dosya | İthalat/İhracat | dosyaları dönüştürün).
      11. Floresan görüntüyü parlak alan görüntüsüyle birleştirmek için her iki görüntüyü de açın ve Dosya | Kanalları birleştirin. GFP için yeşil ve BF için parlak alan olmak üzere uygun bileşenleri seçin ve Tamam'a basın. Birleştirilen görüntüyü kaydedin.
      12. Beyin tümörü alanını ölçmek için floresan görüntüyü kullanın. Ölçü Seç | Manuel Ölçüm | Alanı. Otomatik seçimi seçin (Şekil 3B, yeşil kare) ve oku GFP-pozitif alanına getirin ve otomatik olarak bir seçim oluşturmak için tıklayın. Seçimi onaylamak için tekrar tıklayın, ardından tüm ölçümler gösterilecektir (Şekil 3B, kırmızı kare). Birden fazla GFP pozitif alan varsa, prosedürü tekrarlayın.
   3. Beyin görüntüleri elde edildikten sonra, %10 nötral tamponlu formalin kullanarak rutin doku fiksasyon protokollerine geçin.
      1. Beyinler sabitlendikten sonra, seçilen belirteçleri tespit etmek için beyin metastazı ve immünohistokimyasal boyamanın varlığını doğrulamak için standart histolojik kesitlemeye ve ardından hematoksilen ve eozin boyamaya devam edin.
         NOT: İmmünositokimya, bilinen belirteçlerin immünohistokimyasal boyanması için standart protokole sahip UT MD Anderson Kanser Merkezi'ndeki Patoloji Çekirdek Laboratuvarı'nda gerçekleştirildi.

Sonuçlar

Etiketli hücrelerin klinik öncesi fare modellerinde beyin metastazının izlenmesini ve görselleştirilmesini kolaylaştırdığı gerekçesiyle, biyolüminesans görüntüleme ve floresan stereomikroskopi kullanarak beyin metastazlarını izlemek ve metastatik yükü ölçmek için MDA-IBC3 hücrelerini Luc ve GFP ile etiketledik. Etiketli MDA-IBC3 hücrelerinin bağışıklığı baskılanmış SCID/Bej farelerin kuyruk damarlarına enjeksiyonu, yüksek oranda beyin metastazı gelişen farelerle sonuçlandı (yani, ...

Tartışmalar

Protokol birkaç kritik adım içerir. Canlılığı korumak için hücreler 1 saatten fazla buz üzerinde tutulmamalıdır. Enjeksiyondan önce farelerin kuyruklarını silmek için alkollü pamuklu pedler kullanılmalı, kuyruk derisine zarar vermemek için çok sert veya çok sık silmemeye özen gösterilmelidir. Farelerin kan damarı embolisinden ölmesini önlemek için hücre süspansiyonunda hava kabarcığı bulunmadığından emin olun. Kuyruklardaki kan damarının delinmesini önlemek için enjeksiyon açıs?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell Culture
1000 µL pipette tip filtered	Genesee Scientific	23430
10 mL Serological Pipets	Genesee Scientific	12-112
Antibiotic-antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	1%
Centrifuge tubes 15 mL bulk	Genesee Scientific	28103
Corning  500 mL Hams F-12 Medium [+] L-glutamine	GIBICO Inc. USA	MT10080CV
Countess II Automated Cell Counter (Invitrogen)	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
1x DPBS	Thermo Fisher Scientific	21-031-CV
Eppendorf centufuge 5810R	Eppendorf
Fetal bovine serum (FBS)	GIBICO Inc. USA	16000044	10%
Fisherbrand  Sterile Cell Strainers (40 μm)	Thermo Fisher Scientific	22-363-547
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0888	1 µg/mL
Insulin	Thermo Fisher Scientific	12585014	5 µg/mL
Invitrogen Countess Cell Counting Chamber Slides	Thermo Fisher Scientific	C10228
MDA-IBC3 cell lines	MD Anderson Cancer Center		Generated by Dr. Woodward's lab24
Luciferase–green fluorescent protein (Luc–GFP) plasmid	System Biosciences	BLIV713PA-1
microtubes clear sterile 1.7 mL	Genesee Scientific	24282S
Olympus 10 µL Reach Barrier Tip, Low Binding, Racked, Sterile	Genesee Scientific	23-401C
TC Treated Flasks (T75), 250mL, Vent	Genesee Scientific	25-209
Trypan Blue Stain (0.4%) for use with the Countess Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	T10282
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red	Thermo Fisher Scientific	25200114
Tail vein injection
C.B-17/IcrHsd-Prkdc scid Lyst bg-J - SCID/Beige	Envigo	SCID/beige mice
BD Insulin Syringe with the BD Ultra-Fine Needle 0.5mL 30Gx1/2" (12.7mm)	BD	328466
Plas Labs  Broome-Style Rodent Restrainers	Plas Labs 551BSRR	01-288-32A	Order fromThermo Fisher Scientific
Volu SolSupplier Diversity Partner Ethanol 95% SDA (190 Proof)	Thermo Fisher Scientific	50420872	70 % used
Imaging
BD Lo-Dose  U-100 Insulin Syringes	BD	329461
Disposable PES Filter Units 0.45 µm	Fisherbrand	FB12566501	filter system to sterilize the D-luciferin
D-Luciferin	Biosynth	L8220-1g	stock concentration = 47.6 mM (15.15 mg/mL); use concentration = 1.515 mg/mL
1.7 mL microtube amber	Genesee Scientific	24-282AM
Isoflurane	Patterson Veterinary	NDC-14043-704-06	Liquid anesthetic for use in anesthetic vaporizer
IVIS 200	PerkinElmer		machine for luciferase imaging, up to 5 mice imaging at the same time, with anesthesia machine
Plastic Containers with Lids	Fisherbrand	02-544-127
Tissue Cassettes	Thermo Scientific	1000957
Webcol Alcohol Prep	Covidien	6818
Stereomicroscope Imaging
Stereomicroscope AZ100	Nikon	model AZ-STGE	software NIS-ELEMENT
Formalin 10%	Fisher Chemical	SF100-4
TC treated dishes 100x20 mm	Genesee Scientific	25202