יצירת דגם תלת מימדי תלת מימדי של עור על שבב בפלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מודל עור תלת מימדי פשוט ובלתי מופרע באמצעות פלטפורמה מיקרופלואידית מיקרו-מכונות. גישת זרימה מקבילה מאפשרת תצהיר במקום של תא עורי לזרוע של תאי אפיתל על גבי, כל נשלט על ידי משאבות מזרק.

Abstract

עבודה זו מציגה פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה, חסכונית ואמינה עם פוטנציאל ליצור רקמות מרובות שכבות מורכבות. כהוכחה לרעיון, עור אנושי פשוט ובלתי מובחן המכיל תא עורי (סטרומי) ותא אפיתל (אפיתל). לשם כך פותח מכשיר רב-תכליתי וחזק המבוסס על ויניל המחולק לשני תאים, המתגבר על חלק מהחסרונות הקיימים במכשירים מיקרופלואידיים המבוססים על פולידימתילסילוקסן (PDMS) ליישומים ביו-רפואיים, כגון שימוש בציוד יקר ומיוחל או ספיגת מולקולות וחלבונים קטנים והידרופוביים. יתר על כן, פותחה שיטה חדשה המבוססת על זרימה מקבילה, המאפשרת תצהיר במקום של תאי העור והאפידרמיס. מבנה העור מורכב מטריצת פיברין המכילה פיברובלסטים ראשוניים אנושיים ומונו-שכבתית של קרטינוציטים מונצחים המושרשת למעלה, אשר נשמרת לאחר מכן בתנאי תרבות דינמיים. פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה זו פותחת את האפשרות לדגמן מחלות עור אנושיות ולהסיק את השיטה ליצירת רקמות מורכבות אחרות.

Introduction

לאחרונה, חלה התקדמות לקראת פיתוח וייצור של מודלים מעור אנושי במבחנה לניתוח הרעילות של מוצרי קוסמטיקה ותרופות¹. חוקרים בתעשיות התרופות וטיפוח העור משתמשים בבעלי חיים, עכברים הם הנפוצים ביותר, כדי לבדוק את המוצרים שלהם^2,3,4,5. עם זאת, בדיקת מוצרים על בעלי חיים אינה תמיד מנבאת את התגובה בבני אדם, אשר מוביל לעתים קרובות לכשל תרופתי או תופעות לוואי בבני אדם וכתוצאה מכך להפסדים כלכליים^5,6. בריטניה הייתה המדינה הראשונה שאסרה על שימוש בבעלי חיים לבדיקות קוסמטיות בשנת 1998. מאוחר יותר, בשנת 2013, האיחוד האירופי אסר על בדיקה והרחקה של מוצרי קוסמטיקה בבעלי חיים (תקנה קוסמטיקה של האיחוד האירופי מס '1223/2009)⁷.

איסור זה נשקלת גם על ידי מדינות אחרות כגון "חוק הקוסמטיקה ההומנית" בארה"ב⁸. בנוסף לחששות אתיים, ההבדלים האנטומיים בין עור בעלי חיים לבני אדם הופכים את הניסויים בבעלי חיים לגוזלי זמן רב, יקרים ולעתים קרובות לא יעילים. יתר על כן, גודל השוק העולמי לבדיקות רעלים במבחנה צפוי להגיע ל -26.98 מיליארד דולר עד 2025⁹. מסיבות אלה, יש צורך לפתח שיטות וחלופות חדשות עבור אלה במחקרי מבחנה, כגון מודלים של עור אנושי ביו-הנדסה, המאפשרים בדיקות לבטיחות והשפעות רעילות של קוסמטיקה ותרופות ללא שימוש בבעלי חיים.

ישנם שני סוגים שונים של מודלים מסחריים זמינים, במבחנה, עור אנושי. הסוג הראשון מורכב משכבות אפידרמיס המקבילות שכבות מרובות של קרטינוציטים הבחנה כי הם זרעים על חומרים שונים. חלקם אושרו על ידי הארגון לשיתוף פעולה ופיתוח כלכלי (OECD) ואומתו על ידי (המרכז האירופי לאימות שיטות חלופיות (ECVAM) לבדיקות קורוזיה וגירוי בעור, כגון EpiDerm או SkinEthic^10,11,12. הסוג השני הוא שווה ערך לעור מלא עם שכבה של קרטינוציטים אנושיים מובחנים המושרשים על פיגום תלת מימדי (3D) המכיל פיברובלסטים, כגון T-Skin ו- EpiDerm-FT. עם זאת, מודלים אלה הם תרבותיים בתנאים סטטיים, מה שהופך אותם לא מסוגל לייצג במדויק תנאים פיזיולוגיים אנושיים.

העניין האחרון התמקד ביצירת מודלים של עור במבחנה תלת-ממדית בפורמטים של הוספת תרבית תאים (CCI) עם זלוף דינמי^{13,14,15,16,17,18,19}. עם זאת, מערכות אלה לא יכולות להיחשב קפדניות sensu כמו עור על שבבים microfluidic לפי ההגדרה הקלאסית שלהם בתחום. ההגדרה של אינגר לאיברים על שבב קובעת כי האיבר חייב להיות ממוקם בתוך הערוצים microfluidic, שהוא מצב כי רק כמה מכשירים למלא^20,21. עור על שבבים יש עד כה מודל בעיקר אפיתליה פשוטה כמו שכבות תא יחיד ו / או שכבות תא עור מופרדות על ידי קרום נקבובי^22,23. למרות שהיו כמה התקדמות מידול העור במערכות microfluidic^16,24, אין כרגע ספרות המציגה מערכת איבר על שבב שמתאימה להגדרה של אינגר, מסוגל לייצר עור רב שכבתי במקום וכולל הן רכיבים אפיתל סטרומיים.

בעבודה זו מוצגת פלטפורמה מיקרופלואידית חדשה, חסכונית, חזקה ומבוססת ויניל עבור יישומי עור על שבב. פלטפורמה זו הופקה על ידי עיבוד מיקרו, המספק פשטות רבה יותר בתהליך הייצור, כמו גם גמישות מוגברת ורב-תכליתיות בפריסת המכשיר, תוך התגברות על חלק מהמגבלות של PDMS²⁵. כמו כן תוכננה דרך להציג מבנה עור פשוט באמצעות זרימה מקבילה הנשלטת באמצעות משאבות מזרק. זרימה מקבילה מאפשרת שני נוזלים עם צמיגות שונה מאוד (חיץ ופיברין pre-gel במקרה זה) להיות perfused דרך ערוץ מבלי לערבב אחד עם השני. כהוכחה לרעיון, הוכנס למכשיר מבנה דרמו-אפידרמיס המכיל פיברובלסטים המוטבעים במטריצת פיברין המחקה את הדרמיס, ומעליו נטען מונולייר של קרטינוציטים כדי לחקות את האפידרמיס הגלי. ניתן לאפנן את גובה התא העורי על-ידי שינוי קצבי הזרימה. החידוש העיקרי של עבודה זו, בהשוואה לדגמים שתוארו בעבר^{22,26,27,28,29}, הוא פיתוח של מבנה תלת מימדי בתוך microchamber באמצעות מיקרופלואידיקה. למרות מאמר זה מציג עור פשוט לא מובחן, המטרה לטווח ארוך היא ליצור ולאפיין מבנה עור מובחן לחלוטין כדי להדגים את הכדאיות שלה ואת הפונקציונליות למטרות בדיקה סמים וקוסמטיים.

Protocol

1. עיצוב שבבים ומיקרו-מכונות פרמטרים

1. עצב את שכבות השבב המיקרופלואידיות באמצעות תוכנת עיצוב קוד פתוח של FreeCAD; עיין בטבלה 1 עבור ממדי הערוצים. כלול ארבעה חורים בקוטר 2.54 מ"מ בעיצוב לשימוש ביישר יישור מותאם אישית עבור שכבת-על נכונה.

	אורך (מיקרומטר)	רוחב (מיקרומטר)
תא תחתון	28,400	800
תא עליון	31,000	800

טבלה 1: מידות הערוצים העליונים והתחתונים של ההתקן.

2. חותכים 95 מיקרומטר עבה, דבק, יריעות ויניל שקופות לתוך 30 ס"מ x 30 ס"מ ריבועים כדי להתאים את התווין כראוי.
3. השתמש בתוכנת Brother CanvasWorkspace כדי ליצור סביבת עבודה של 30 ס"מ על 30 ס"מ, ולמלא אותה בתבניות המעוצבות לשכבות השונות של השבב(איור 1A). אחסן אותו בקובץ .svg.
4. חותכים את יריעות ויניל בגודל 30 ס"מ על 30 ס"מ עם נתח הקצה(איור 1B-D).
   1. יש לתקוע את יריעת הוויניל על מחצלת דבק נמוכה, ולחסל את כל בועות האוויר במידת הצורך.
   2. העלה את קובץ .svg לתוויה, והגדר את פרמטרי החיתוך: להב חיתוך: רמה 3; חיתוך לחץ: רמה 0; מהירות חיתוך: רמה 1. מניחים את מחצלת הדבק עם הוויניל לתוך הקושר, ומתחילים את תהליך החיתוך.
5. גזור את תבנית הערוץ העליון על ויניל סרט דו-צדדי בעובי 12 מיקרומטר על-ידי ביצוע השלבים הקודמים.

איור 1: עיצוב שבב ותהליך מיקרו-מכונות. (A)פריסת תוכנה המציגה את מרחב העבודה המלא בתבניות העליונות והתחתון המיועדות לשבב. (B)קושר קצה במהלך תהליך חיתוך; להב חיתוך, יריעת ויניל שלמה ומחצלת דבק מוצגים. (ג)ויניל בדוגמת ניתוק מגיליון החיתוך. (D)דגימה של שכבת ויניל דבק בדוגמת עיצוב הערוץ העליון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

2. ייצור שכבת PDMS

1. מערבבים את ה-PDMS ואת סוכן הריפוי ביחס של 10:1 (v/v), ומניחים את התערובת תחת ואקום למשך 15 דקות להסרת בועות אוויר. יוצקים 55 מ"ל מהתערובת לצלחת תרבות של 55 ס"מ² ריבועית כדי לקבל שכבה בעובי 2 מ"מ. הסר בועות עם מחט.
2. לרפא את התערובת (שלב 2.1) בתנור במשך 1 שעה ב 80 °C (80 °F). תפרקו את ה-PDMS וחתכו אותו למלבנים עם מידות השבב. לעשות חורים עבור צינורות עם מחט מזרק 18 G.

3. הרכבת שבב

הערה: להבנה טובה יותר, ראו איור 2.

1. הרכב את ההתקן כולו באמצעות קשת יישור להתאמת ערוצים, פרצונים ושקעים כראוי. עורמים ארבע שכבות ויניל (עם המיקרו-פלטרן התחתון המתאים) להרכבת הערוץ התחתון, תוך שמירה על סרט הכיסוי של השכבה התחתונה כדי להימנע מהדבקה ליישר היישור.
2. לחתוך ולהניח את הקרום פוליקרבונט (PC) נקבובי על גבי הערוץ התחתון כדי להפריד אותו מן העליון. היזהר לא לכסות את המפרצונים של הערוץ התחתון.
3. הוסף עשר שכבות ויניל עם עיצוב התא העליון. תקע שכבת ויניל דו-צדדית עם תבנית הערוץ העליון למעלה. הסר את השבב מיישר היישור ותדביק אותו על שקופית הזכוכית.
4. הניחו גיליון PDMS בעובי 2 מ"מ על גבי שכבת ויניל סרט דו-צדדית כדי לספק עיגון מתאים לצינורות ולהימנע מדליפה. השאר משקל על גבי השבב לילה כדי להבטיח את השבב הוא אטום לחלוטין. לחטא את השבב על ידי שטיפה 70% v / v אתנול במשך 5 דקות, ולאחר מכן לשטוף עם מזוקק H₂O.

איור 2: הרכבה של שבב מיקרופלואידי. (א)ערכה כללית של הרכבת ההתקן. התאים התחתונים והעליונים מורכבים מארבעה ואחד עשר יריעות ויניל על גבי, בהתאמה. (B)נופים עליונים ו לרוחב של השבב המיקרופלואידי. הערוצים העליונים והתחתונים מיוצגים בוורוד וכחול, בהתאמה. (C)תמונה של הרכבת השבב באמצעות קשת יישור מותאמת אישית. (D)תמונת שבב לאחר הרכבה מלאה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

4. חיבורי משאבה

הערה: הייצוג הגרפי של חיבורי המשאבות מוצג באיור 3.

1. חבר את משאבה 1 למפרצון העליון 1 (UCi1).
2. חבר משאבה 2 למפרצון התא העליון 2 (UCi2).
3. חברו את משאבה 3 למפרצון התא התחתון (LCi).
4. חבר שקע תא עליון (UCo) ושקע תא תחתון (LCo) לצינור פסולת.
5. חבר את המזרקים לכל מפרצון באמצעות צינורות פוליטרפלואורואתילן (PTFE) ומחברי נירוסטה 18 G.

איור 3: חיבורי משאבה ומיקום מכניסות/שקעים. (A)דיאגרמה המציגה את החיבור של שלוש המשאבות השונות למפרצונים המתאימים להן. שקעים מתחברים למיכל פסולת. (B)תמונת שבב עם מפרצונים ושקעים מסומנים. קיצורים: LCi = מפרצון התא התחתון; LCo = שקע תא תחתון; UCi1 = מפרצון התא העליון 1; UCi2 = מפרצון החדר העליון 2; UCo = שקע תא עליון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

5. תרבות התא

הערה: לקו התא של ה-HaCaT מקור מסחרי. פיברובלסטים ראשוניים אנושיים מגיעים מתורמים בריאים והושגו מאוסף של דגימות ביולוגיות ממוצא אנושי הרשומות ב"Registro Nacional de Biobancos para Investigación Biomédica del Instituto de Salud Carlos III".

1. לעבוד בשכונת תרבית תאים, בעבר מעוקר תחת אור אולטרה סגול וניגב עם אתנול.
2. הפשרת תאי H2B-GFP-HaCaT (קרטינוציטים מונצחים אנושיים בעור, hKCs) ופיברובלסטים ראשיים GFP-אנושיים (hFBs) ב 37 °C (57 °C), להוסיף 2 מ"ל של בינוני תרבות, וצנטריפוגה במשך 7 דקות ב 20 °C (50 °F) ב 250 × גרם.
   הערה: תאי H2B-GFP-HaCaT הם קרטינוציטים מונצחים אנושיים המותאמים כדי לבטא חלבון פלואורסצנטי הירידי H2B-ירוק (GFP), המספק את הגרעינים שלהם עם פלואורסצנטיות ירוקה. GFP-hFBs הם פיברובלסטים ראשוניים אנושיים שהשתנו עם pLZRS-IRES-EGFP וקטור כדי לבטא פלואורסצנטיות ירוקה ציטופלסמית. תאים אלה שונו בעקבות פרוטוקולים שפורסמו בעבר^30,31
3. תרבית הן hKCs והן hFBs ב- 1x DMEM בתוספת סרום בקר עוברי 10% ו-1% מהפתרון האנטיביוטי/אנטי-ממיקוטי. מחממים מראש את המדיום התרבותי ב 37 °C (50 °F) לפני השימוש.
4. לנתק את התאים על ידי שטיפת אותם עם 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS), הוספת 2 מ"ל של טריפסין / אתילנדיאמין חומצה טטראצטית (EDTA) ודגורת אותם במשך 10 דקות ב 37 °C (50 °F).
5. טריפסין לא מומת הוספת 4 מ"ל של מדיום תרבות. respend התאים, ולהעביר אותם לצינור 15 מ"ל. הסר 10 μL לספור תאים על תא Neubauer ולקבוע את הריכוז המתאים.
6. צנטריפוגה צינור 15 מ"ל במשך 7 דקות ב 20 °C (50 °F) ב 250 × גרם. הסר את supernatant, ו resuspend הכדורים בריכוז הרצוי: hFBs ב 50,000 תאים / mL ו hKCs ב 5·× 10⁶ תאים / מ"ל.

6. הכנת פיברינוגן לפני ג'ל

1. הפעל תרומבין על ידי הוספת 1mL של CaCl₂ (1% w/v ב- NaCl) לבקביון.
2. הוסף את הרכיבים הבאים כדי להשיג 1 מ"ל של הידרוג'ל פיברין בריכוז הסופי של פיברין של 3.5 מ"ג / מ"ל: 59 μL של תרומבין מופעל (10 יחידות NIH / מ"ל), 59 μL של חומצה טרנקסמית (טבלת חומרים, 100 מ"ג / מ"ל), 764 μL של בינוני תרבות המכיל 50,000 hFBs / mL, 118 μL של פיברינוגן (20 מ"ג / מ"ל ב NaCl (0.9% w / v)).
   הערה: פיברינוגן חייב להתווסף ברגע האחרון.

7. פרוטוקול זרימה מקבילית

1. משאבה 1x PBS עם משאבה 3 דרך LCi ב 50 μL / min במהלך כל התהליך.
2. משאבת נוזל הקרבה (1x PBS) עם משאבה 2 דרך UCi2 ב 100 μL / min.
3. טענו את המזרק עם הג'ל שלפני, הניחו אותו במהירות במשאבה 1, והפעילו אותו במהירות של 200 μL/min(איור 4A).
4. עצור משאבות 1 ו -2 ברגע שהג'ל מראש יוצא UCo.
5. השאירו את השבב מבלי להסיר את הצינורות ב 37 °C (50 °F) לפחות 10 דקות כדי לאפשר gelation.
6. משאבת תרבות בינונית ב 50 μL / שעה עם משאבה 3 עד UCi2 לילה.
7. חסום את UCi1 עם מכסה.

8. זריעת מונו-שכבתית hKCs

1. בדוק מתחת למיקרוסקופ כי hFBs מפוזרים 24 שעות לאחר הדור של התא העורי.
2. הציגו את ה-hKCs עם משאבה 2 עד UCi2 ב-5 ×·10⁶ תאים/מ"ל ב-40 μL/min למשך דקה אחת(איור 4B).
3. השאירו את השבב למשך הלילה ב 37 °C בקו חממה רווית לחות עבור חיבור לתא.
4. משאבת תרבות טרייה בינונית עם משאבה 3 רק דרך LCi ב 50 μL / min (איור 4C).

איור 4: פרוטוקול מיקרופלואידי ליצירת המבנה הדרמו-אפידרמלי. (A)חתך רוחבי המציג את תהליך הזרימה המקביל ליצירת התא העורי. (B)קרטינוציט מונו-שכבתית זורעת 24 שעות לאחר יצירת תא עורי. (C)תחזוקת תרבית התא בתוך המכשיר המיקרופלואידי. (ד)בילוי חתך של העור בתוך השבב. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

9. תוואי התא

הערה: ערכה חיה/מתה מכתימה תאים עם פלואורסצנטיות ירוקה או אדומה בהתאם למצבם החי או המת. לבידול כדאיות, בשלב זה יש להשתמש ב- hKCs ו- hFBs שאינם פלואורסצנטיים. כל השלבים בהליך מתבצעים באמצעות UCi2 עם משאבה 2.

1. לשטוף את הערוץ העליון עם 1x PBS במשך 5 דקות ב 50 μL / min כדי להסיר בינוני תרבות.
2. לשאוב אוויר כדי להסיר את 1x PBS ב 50 μL / min.
3. הכן Calcein AM / אתידיום הומודימר-1 ערכת (חי/ מת) פתרון על ידי ביצוע הוראות היצרן.
4. משאבה חי / מת פתרון ב 50 μL / דקה במשך 2 דקות.
5. דגירה 30 דקות ב 37 °C (50 °F) בחושך.
6. לשטוף את הערוץ העליון על ידי שאיבת 1x PBS ב 50 μL / min במשך 2 דקות כדי להסיר כל ריאגנט הנותרים.
7. שים לב לדגימה מתחת למיקרוסקופ הקונפוקלי. השתמש אורך גל עירור של 495/590 ננומטר ואורך גל פליטה של 519/617 ננומטר עבור תאים חיים ומתים, בהתאמה.

תוצאות

השבב המעוצב מורכב משני תאים נוזליים המופרדים על ידי קרום מחשב בגודל 5 מיקרומטר המאפשר את צמיחת התא על ידי מתן אפשרות למעבר של מולקולות מקדמות צמיחה מהתא התחתון. התא העליון מחזיק את מבנה הרקמה, במקרה זה, monolayer של hKCs על הידרוג'ל פיברין המכיל hFBs.

גובה הערוצים נקבע לפי מספר גליונו?...

Discussion

המוטיבציה לפתח שיטה זו הייתה הרצון לדגמן מחלות עור וללמוד את ההשפעות של טיפולים חדשים וחדשניים בפלטפורמה בעלת תפוקה גבוהה. עד כה, מעבדה זו מייצרת את המקבילות הדרמו-אפידרמיס האלה על ידי יציקה - באופן ידני או בעזרת טכנולוגיית הביו-הדפסה התלת-ממדית - ג'ל הפיברין עם פיברובלסטים לתוך צלחת הכנסת ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amchafibrin	Rottafarm		Tranexamic acid
Antibiotic/antimycotic	Thermo Scientific HyClone
Calcium chloride	Sigma Aldrich
Culture plates	Fisher
DMEM	Invitrogen Life Technologies
Double-sided tape vynil	ATP Adhesive Systems		GM 107CC, 12 µm thick
Edge plotter	Brother		Scanncut CM900
FBS	Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen	Sigma Aldrich		Extracted from human plasma
Glass slide	Thermo Scientific
GFP-Human dermal fibroblasts	-		Primary. Gift from Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT cell line	ATCC		Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García
Live/dead kit	Invitrogen
PBS	Sigma Aldrich
Polycarbonate membrane	Merk TM		5 µm pore size
Polydimethylsiloxane	Dow Corning		Sylgard 184
Sodium chloride	Sigma Aldrich
Syringes	Terumo		5 mL
Thrombin	Sigma Aldrich		10 NIH/vial
Transparent adhesive vinyl	Mactac		JT 8500 CG-RT, 95 µm thick
Trypsin/EDTA	Sigma Aldrich
Tubing	IDEX		Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID