マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成

要約

ここでは、マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームを用いて、3次元の簡易および未分化皮膚モデルを生成するプロトコルを提示する。平行流アプローチは上の上の上皮細胞の播種のための真皮のコンパートメントの その場の 堆積を可能にし、すべてシリンジポンプによって制御される。

要約

この研究は、複雑な多層組織を生成する可能性を持つ新しい、費用対効果の高い、信頼性の高いマイクロ流体プラットフォームを提示します。概念実証として、真皮(間質)および表皮(上皮)コンパートメントを含む、簡素で未分化のヒト皮膚がモデル化されている。これを達成するために、2つのチャンバーに分かれた汎用性と堅牢なビニール系デバイスが開発され、高価で特殊な機器の使用や、小型の疎水性分子およびタンパク質の吸収など、生物医学の用途に適したポリジメチルシロキサン(PDMS)に基づくマイクロ流体デバイスに存在する欠点の一部を克服しました。さらに、平行流に基づく新しい方法が開発され、真皮および表皮コンパートメントの両方の イン・ザ・ポジション 堆積が可能となる。皮膚構築物は、ヒト原発性線維芽細胞を含むフィブリンマトリックスと、上に播種された不死化角化ケラチノサイトの単層から構成され、その後、動的培養条件下で維持される。この新しいマイクロ流体プラットフォームは、ヒトの皮膚疾患をモデル化し、他の複雑な組織を生成する方法を推定する可能性を開きます。

概要

近年、化粧品および医薬品1の毒性分析のためのヒト皮膚モデルの開発・生産に向けた^進歩が見られている。医薬品およびスキンケア産業の研究者は、動物を使用してきました, マウスは最も一般的です, 自社製品をテストするために^2,3,4,5.しかし、動物の試験製品は、ヒトにおける反応を予測するとは限らず、しばしばヒトにおける薬物不全または副作用を引き起こし、その結果経済的損失^5,6に至る。英国は、1998年に化粧品検査のための動物の使用を禁止した最初の国でした。その後、2013年に、EUは動物の化粧品の試験と承認を禁止しました (EU化粧品規則第1223/2009)⁷.

この禁止は、米国の「人道的化粧品法」など他の国々でも検討されています^。倫理的な懸念に加えて、動物と人間の皮膚の解剖学的な違いは、動物のテストに時間がかかり、高価で、しばしば効果がありません。さらに、世界 のインビトロ 毒物学の検査市場規模は、2025⁹年までに269億8000万米ドルに達すると予想されています。これらの理由から、動物を使用せずに化粧品や薬物の安全性と毒性効果のテストを可能にする、バイオエンジニアリングされたヒト皮膚モデルなどの インビトロ 研究のための新しい方法と代替案を開発する必要があります。

市販の2種類、インビトロ、ヒトの皮膚モデルがあります。第1のタイプは、異なる材料に播種された分化角化細胞の複数の層を含む層状表皮等価物で構成される。そのうちのいくつかは経済協力開発機構(OECD)によって承認され、エピダームやSkinEthic^10、11、12などの皮膚腐食および刺激試験のための(欧州代替方法検証センター(ECVAM)によって検証されています。第2のタイプは、T-SkinやEpiDerm-FTなどの線維芽細胞を含む3次元(3D)足場に播種されたヒトケラチノサイトの層を持つフルスキン同等物である。しかし、これらのモデルは静的な条件下で培養されるため、ヒトの生理学的状態を正確に表すことができません。

最近の関心は、動的灌流13、14、15、16、17、18、19の細胞培養挿入(CCI)フォーマットでin vitro 3Dスキンモデルを生成することに焦点^を当てています。しかし、これらのシステムは、現場での古典的な定義に従って、マイクロ流体スキンオンチップとして厳密な感覚とは考えられません。Ingberの臓器オンチップの定義は、器官がマイクロ流体チャネルの中に配置されなければならないと述^{べています}。スキンオンチップは、これまでのところ、多孔質膜^22、23によって分離された単一細胞層および/または真皮細胞層として、ほとんどが単純な上皮をモデル化してきた。マイクロ流体系^16,24では皮膚をモデル化する進歩がいくつかあったが、現在のところ、Ingberの定義に合った臓器オンチップシステムを示す文献はなく、その場で多層皮膚を産生することができ、上皮成分と間質成分の両方を含む。

この研究では、スキンオンチップアプリケーション用の新しい、費用対効果の高い、堅牢な、ビニールベースのマイクロ流体プラットフォームが発表されています。このプラットフォームは、PDMS²⁵の制限の一部を克服し、デバイスのレイアウトにおける柔軟性と汎用性の向上と同様に、製造プロセスにおいてよりシンプルさを提供するマイクロ加工によって製造された。シリンジポンプで制御された平行流を通して簡単な皮膚構造を導入する方法も設計されました。平行流は非常に異なった粘着性を持つ2つの液体(この場合は緩衝液およびフィブリンプレゲル)が互いに混合されることなくチャネルを通して浸透することを可能にする。概念実証として、真皮を模したフィブリンマトリックスに埋め込まれた線維芽細胞を含む真皮構造をデバイスに導入し、その上にケラチノサイトの単層をロードして未分化表皮をエミュレートした。真皮コンパートメントの高さは流量を変更することによって変調することができる。この研究の主な目新しさは、前に説明したモデル22、26、27、28、29と比較して、マイクロ流体によるマイクロチャンバー内の3D構造の開発である。この記事では、未分化肌を単純化したものの、長期目標は、完全に差別化された皮膚構造を生成し、特徴付け、薬物および化粧品検査目的の生存率と機能性を実証することです。

プロトコル

1. チップ設計とマイクロマシニングパラメータ

1. FreeCADオープンソース設計ソフトウェアを使用してマイクロ流体チップ層を設計します。チャネルの寸法については 、表 1 を参照してください。設計に直径2.54mmの穴を4つ含めて、正しいレイヤーの重ね合わせにカスタムメイドのアライナを使用します。

	長さ(μm)	幅 (μm)
下室	28,400	800
上院	31,000	800

表1:デバイスの上下チャネルの寸法

2. 厚さ95μm、粘着、透明なビニールシートを30cm x 30cmの正方形に切り、プロッタに適切に収めます。
3. 30 cm x 30 cm のワークスペースを作成し、チップの異なるレイヤー用に設計されたパターンで埋めるには、ブラザー CanvasWorkspace ソフトウェアを使用します (図 1A)。.svg ファイルに格納します。
4. エッジプロッタで30cm x 30cmビニルシートをカットします(図1B-D)。
   1. ビニールシートを低タック粘着マットに貼り付け、必要に応じてすべての気泡を除去します。
   2. プロッタに.svgファイルをアップロードし、切削パラメータを設定します: 切断刃: レベル 3;切削圧: レベル 0;切断速度:レベル1。ビニールを入れ、粘着マットをプロッタに入れ、切削処理を開始します。
5. 前の手順に従って、厚さ12μmの両面テープビニールのトップチャンネルパターンをカットします。

図1: チップ設計とマイクロマシニングプロセス. (A) チップ用に設計された上下のパターンで埋まった作業スペースを示すソフトウェアレイアウト。(B) 切断プロセス中のエッジ プロッタ;切削刃、ビニールシート全体、粘着マットが示されています。(C)パターン化されたビニールがカットシートから切り離されている。(D)トップチャネル設計でパターン化された接着ビニル層のサンプル。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

2. PDMS層の製作

1. PDMSと硬化剤を10:1(v/v)の比率で混合し、15分間真空下に置いて気泡を除去します。^55cm2 四角い培養皿に55mLの混合物を注ぎ、2mm厚層を得る。針で泡を取り除きます。
2. 混合物(ステップ2.1)を80°Cで1時間オーブンで硬化させる。 PDMS をアンモールドし、チップ寸法の長方形にカットします。18 Gの注射針でチューブ用の穴を作ります。

3. チップアセンブリ

注: 理解を深めるには、 図 2を参照してください。

1. アライナを使用してデバイス全体を組み立てて、チャンネル、入口、アウトレットを適切に調整します。下のチャンネルを組み立てるために4つのビニール層(対応するボトムマイクロパターン)を積み重ね、アライナーに付着しないように底層のカバーテープを保持します。
2. ポリカーボネート(PC)多孔質膜を下側のチャネルの上に切って置き、上の溝から分離します。下チャンネルの入口を覆わないように注意してください。
3. 上部の部屋の設計と10のビニール層を追加します。上部にトップチャンネルパターンを持つ両面テープビニール層を貼り付けます。チップをアライナーから取り外し、ガラススライドに貼り付けます。
4. 2 mm 厚の PDMS シートを両面テープビニール層の上に置き、チューブに適切なアンカーを提供し、漏れを防ぎます。チップが完全に水密であることを確認するために、チップの上に一晩重量を残します。70%v/vエタノールを5分間洗浄し、蒸留した_H2Oで洗浄してチップを殺菌します。

図2:マイクロ流体チップアセンブリ (A) デバイスのアセンブリの一般的なスキーム。下側および上部のチャンバーは、それぞれ4枚と11枚の重ね合わせビニルシートで構成されています。(B)マイクロ流体チップの上部および横のビュー。トップチャンネルとボトムチャンネルはそれぞれピンクとブルーで表されます。(C) カスタムアライナを使用したチップアセンブリのイメージ。(D)完全なアセンブリ後のチップイメージ。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

4. ポンプ接続

注: ポンプ接続のグラフィカルな表現を図 3に示します。

1. ポンプ1を上室入口1(UCi1)に接続します。
2. ポンプ2を上部チャンバーインレット2(UCi2)に接続します。
3. ポンプ3を下室入口(LCi)に接続します。
4. アッパーチャンバーアウトレット(UCo)と下室アウトレット(LCo)を廃棄物管に接続します。
5. ポリテトラフルオロエチレン(PTFE)チューブと18 Gステンレス鋼コネクタを使用して、各インレットに注射器を接続します。

図3:ポンプ接続とインレット/出口位置を 示す図(A)それぞれの入り口への3つの異なるポンプの接続を示す図。アウトレットは、廃棄物容器に接続します。(B)チップ画像に、入口とアウトレットのラベルが付いています。略語: LCi = 下チャンバー入口;LCo =下チャンバー出口;UCi1 = 上部チャンバー入口 1;UCi2 = 上部チャンバー入口 2;UCo = 上部チャンバー出口。 この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

5. 細胞培養

注意:HaCaT細胞株は商業的起源を有する。ヒト原発性線維芽細胞は健康なドナーから来ており、「レジストロ・ナシオナル・デ・バイオバンコス・パラ・インスベスティガシオン・ビオメディカ・デル・インスティトゥート・デ・サルド・カルロス3世」に登録されたヒト起源の生物学的サンプルのコレクションから得られた。

1. 細胞培養フードで働き、以前は紫外線で殺菌し、エタノールで拭いた。
2. H2B-GFP-HaCaT細胞(ヒト不死化皮膚ケラチノサイト、hKCs)およびGFPヒト原発性線維芽細胞(hFP)を37°Cで解凍し、2mLの培養培地を添加し、250×gで20°Cで7分間遠心分離機を加 える。
   注:H2B-GFP-HaCaT細胞は、ヒトの不死化角化ケラチノサイトを改変して、H2B-緑色蛍光タンパク質(GFP)のハイブリッドを発現させ、その核に緑色蛍光を与えます。GFP-hFBsは、細胞質の緑色蛍光を発現するベクターpLZRS-IRES-EGFPで形質転換されたヒト原発性線維芽細胞である。これらのセルは、以前に公開されたプロトコル³⁰、^{31 に}従って変更されました。
3. 1x DMEMのhKCとhHBの両方を10%の胎児ウシ血清と抗生物質/抗抗欠薬溶液の1%で補った。使用前に37°Cで培養液を予温する。
4. 細胞を1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)で洗浄し、トリプシン/エチレンセアミンテトラ酢酸(EDTA)を2mL加え、37°Cで10分間インキュベートします。
5. 4 mLの培養培地を添加したトリプシンを不活性化する。細胞を再懸濁し、15mLチューブに移します。10 μL を取り出して、ノイバウアーチャンバー上の細胞を数え、適切な濃度を決定します。
6. 250×gで20°Cで7分間15mLチューブを遠心分離します。 上清を取り除き、所望の濃度でペレットを再懸濁します:50,000細胞/mLのhFBと5·×10⁶細胞/mLのhCC。

6. フィブリノーゲンプレゲル製剤

1. 1mLのCaCl 2(NaClで1%w/v)をバイアルに加えてトロンビンを活性化します。
2. フィブリンの最終濃度3.5 mg/mLでフィブリンヒドロゲルの1mLを得るために次の成分を加える:59 μLの活性化トロンビン(10 NIH単位/mL)、トラネキサム酸59 μL(材料表、100 mg/mL)、培地764 μLの培地に50,000hF/mLを含む培地の764 μL フィブリノーゲンの118 μL(NaClで20 mg/mL(0.9%w/v))。
   注:フィブリノゲンは、最後の瞬間に追加する必要があります。

7. 並列フロープロトコル

1. 全体のプロセスの間に50 μL/minでLCiを通してポンプ3と1x PBSをポンプ。
2. 100 μL/min で UCi2 を通してポンプ 2 を使用して、犠牲液 (1x PBS) をポンプします。
3. プレゲルでシリンジをロードし、ポンプ1に素早く入れ、200 μL/minで動かします(図4A)。
4. プレゲルがUCoを終了したら、ポンプ1と2を停止します。
5. 37°Cでチューブを取り外さずに、少なくとも10分間、ゲル化を可能にします。
6. ポンプ3からUCi2を通して一晩で50 μL/hでポンプ培養培地。
7. キャップ付きのブロック UCi1.

8. hKCs単層シード

1. hFBsが真皮コンパートメントの生成後24時間広がっていることを顕微鏡で確認してください。
2. UCi2 を通して UCi2 を通して hKCs を導入し、5 ×·10⁶ セル/mL で 40 μL/mL で 1 分間 (図 4B)を導入します。
3. 細胞の取り付けのための湿度飽和インキュベーターで37°Cでチップを一晩残します。
4. 50 μL/min で LCi を通じてのみポンプ 3 で新鮮な培養培地をポンプします (図 4C)。

図4:ダーモ表皮構築物の生成のためのマイクロ流体プロトコル(A)真皮コンパートメントを生成する平行流過程を示す横断面。(B)ケラチノサイト単層播種24時間後に真皮コンパートメント発生後。(C)マイクロ流体装置内部の細胞培養の維持。(D) チップ内の皮膚の断面レクリエーション。この図の大きなバージョンを表示するには、ここをクリックしてください。

9. 細胞生存率アッセイ

注:ライブ/デッドキットは、生きている状態や死んだ状態に応じて、緑色または赤色の蛍光で細胞を染色します。適切な生存率分化のために、非蛍光hKCsおよびhFBをこのステップで使用する必要があります。手順のすべてのステップは、ポンプ2でUCi2を介して行われます。

1. トップチャネルを50 μL/minで5分間1x PBSで洗浄し、培地を除去します。
2. 空気をポンプで送り、50 μL/分で1x PBSを取り除く。
3. Calcein AM/エチジウムホモジマー-1キット(ライブ/デッド)ソリューションをメーカーの指示に従って準備します。
4. 50 μL/minで2分間のポンプライブ/デッドソリューション。
5. 暗闇の中で37°Cで30分インキュベートします。
6. 50 μL/minで1x PBSを2分間ポンピングして、残りの試薬を除去して上チャンネルを洗浄します。
7. コンフォーカル顕微鏡でサンプルを観察します。生細胞と死細胞に対しては、励起波長495/590 nm、発光波長519/617nmをそれぞれ使用します。

結果

設計されたチップは、下のチャンバからの成長促進分子の通過を可能にすることによって細胞の成長を可能にする5μmの細孔サイズPC膜によって分離された2つの流体室から構成される。上のチャンバは組織構築物を保持し、この場合、hFBを含むフィブリンヒドロゲル上のhKCsの単層である。

チャネルの高さは、各チャンネルに追加される粘着シートの数によって決まります...

ディスカッション

この方法を開発する動機は、皮膚疾患をモデル化し、ハイスループットプラットフォームで新しい革新的な治療法の効果を研究したいという願望でした。現在までに、この研究室は、手動で、または3Dバイオプリンティング技術の助けを借りて、繊維芽細胞を含むフィブリンゲルを細胞培養インサートプレートに播種し、その上に角化細胞を播種することによって、これらの皮膚表皮等価物?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amchafibrin	Rottafarm		Tranexamic acid
Antibiotic/antimycotic	Thermo Scientific HyClone
Calcium chloride	Sigma Aldrich
Culture plates	Fisher
DMEM	Invitrogen Life Technologies
Double-sided tape vynil	ATP Adhesive Systems		GM 107CC, 12 µm thick
Edge plotter	Brother		Scanncut CM900
FBS	Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen	Sigma Aldrich		Extracted from human plasma
Glass slide	Thermo Scientific
GFP-Human dermal fibroblasts	-		Primary. Gift from Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT cell line	ATCC		Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García
Live/dead kit	Invitrogen
PBS	Sigma Aldrich
Polycarbonate membrane	Merk TM		5 µm pore size
Polydimethylsiloxane	Dow Corning		Sylgard 184
Sodium chloride	Sigma Aldrich
Syringes	Terumo		5 mL
Thrombin	Sigma Aldrich		10 NIH/vial
Transparent adhesive vinyl	Mactac		JT 8500 CG-RT, 95 µm thick
Trypsin/EDTA	Sigma Aldrich
Tubing	IDEX		Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID