Génération d’un modèle tridimensionnel simplifié de peau sur puce dans une plate-forme microfluidique micro-usinée

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour générer un modèle de peau tridimensionnel simplifié et indifférencié à l’aide d’une plate-forme microfluidique micro-usinée. Une approche à flux parallèle permet le dépôt in situ d’un compartiment dermique pour l’ensemencement de cellules épithéliales sur le dessus, le tout contrôlé par des pompes à seringues.

Résumé

Ce travail présente une nouvelle plate-forme microfluidique rentable et fiable avec le potentiel de générer des tissus multicouches complexes. Comme preuve de concept, une peau humaine simplifiée et indifférenciée contenant un compartiment dermique (stromale) et un compartiment épidermique (épithélial) a été modélisée. Pour ce faire, un dispositif polyvalent et robuste à base de vinyle divisé en deux chambres a été développé, surmontant certains des inconvénients présents dans les dispositifs microfluidiques à base de polydiméthylsiloxane (PDMS) pour des applications biomédicales, tels que l’utilisation d’équipements coûteux et spécialisés ou l’absorption de petites molécules et protéines hydrophobes. De plus, une nouvelle méthode basée sur l’écoulement parallèle a été développée, permettant le dépôt in situ des compartiments dermique et épidermique. La construction de la peau se compose d’une matrice de fibrine contenant des fibroblastes primaires humains et d’une monocouche de kératinocytes immortalisés ensemencés sur le dessus, qui est ensuite maintenue dans des conditions de culture dynamique. Cette nouvelle plateforme microfluidique ouvre la possibilité de modéliser les maladies de la peau humaine et d’extrapoler la méthode pour générer d’autres tissus complexes.

Introduction

Récemment, des progrès ont été réalisés dans le développement et la production de modèles de peau humaine in vitro pour l’analyse de la toxicité des produits cosmétiques et pharmaceutiques¹. Les chercheurs des industries pharmaceutiques et des soins de la peau ont utilisé des animaux, les souris étant les plus courantes, pour tester leurs produits^2,3,4,5. Cependant, tester des produits sur des animaux n’est pas toujours prédictif de la réponse chez l’homme, ce qui conduit fréquemment à une défaillance du médi....

Protocole

1. Paramètres de conception de la puce et de micro-usinage

1. Concevoir les couches de puces microfluidiques avec le logiciel de conception open source FreeCAD; reportez-vous au tableau 1 pour connaître les dimensions des canaux. Inclure quatre trous de 2,54 mm de diamètre dans la conception pour utiliser un aligneur sur mesure pour une superposition de couche correcte.

	Longueur (μm)	Largeur (μm)
Chambre basse	28,400	800
Chambre haute

Résultats

La puce conçue est composée de deux chambres fluidiques séparées par une membrane PC de 5 μm de taille de pore qui permet la croissance de la cellule en permettant le passage de molécules favorisant la croissance de la chambre inférieure. La chambre supérieure contient la construction tissulaire, dans ce cas, une monocouche de hBC sur un hydrogel de fibrine contenant des hFB.

La hauteur des canaux est déterminée par le nombre de feuilles adhésives ajoutées à chaque canal. La chamb.......

Discussion

La motivation pour développer cette méthode était le désir de modéliser les maladies de la peau et d’étudier les effets de thérapies nouvelles et innovantes dans une plate-forme à haut débit. À ce jour, ce laboratoire produit ces équivalents dermo-épidermiques en coulant - manuellement ou à l’aide de la technologie de bio-impression 3D - le gel de fibrine avec des fibroblastes dans une plaque d’insertion de culture cellulaire et en ensemençant les kératinocytes dessus. Une fois que les kératinocytes.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amchafibrin	Rottafarm		Tranexamic acid
Antibiotic/antimycotic	Thermo Scientific HyClone
Calcium chloride	Sigma Aldrich
Culture plates	Fisher
DMEM	Invitrogen Life Technologies
Double-sided tape vynil	ATP Adhesive Systems		GM 107CC, 12 µm thick
Edge plotter	Brother		Scanncut CM900
FBS	Thermo Scientific HyClone
Fibrinogen	Sigma Aldrich		Extracted from human plasma
Glass slide	Thermo Scientific
GFP-Human dermal fibroblasts	-		Primary. Gift from Dr. Marta García
H2B-GFP-HaCaT cell line	ATCC		Immortalized keratinocytes. Gift from Dr. Marta García
Live/dead kit	Invitrogen
PBS	Sigma Aldrich
Polycarbonate membrane	Merk TM		5 µm pore size
Polydimethylsiloxane	Dow Corning		Sylgard 184
Sodium chloride	Sigma Aldrich
Syringes	Terumo		5 mL
Thrombin	Sigma Aldrich		10 NIH/vial
Transparent adhesive vinyl	Mactac		JT 8500 CG-RT, 95 µm thick
Trypsin/EDTA	Sigma Aldrich
Tubing	IDEX		Teflon, 1/16” OD, 0.020” ID