JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שלל חיידקים ממלאים תפקידים חשובים בפתוגנזה ויש להם יישומים ביוטכנולוגיה מבטיחים. ההטרוגניות של שלטי של שלל מסבכת ניתוח ושימוש; לכן, יש צורך בשיטה פשוטה לשחזור כדי להפריד בין גדלים שונים של שלשלות. כאן, אנו מדגימים את השימוש בכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל כדי להפריד שלפוחיות הטרוגניות המיוצרות על ידי Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Abstract

דופן התא של חיידקים גרם שלילי מורכב פנימי (ציטופלסמי) וממברנה חיצונית (OM), מופרד על ידי שכבה פפטידוגליקנית דקה. לאורך הצמיחה, הממברנה החיצונית יכולה bleb כדי ליצור שלל ממברנה החיצונית כדורית (OMVs). OMVs אלה מעורבים פונקציות תאיות רבות כולל משלוח מטען לתאים מארחים ותקשורת עם תאים חיידקיים. לאחרונה, הפוטנציאל הטיפולי של OMVs החל להיחקר, כולל השימוש בהם כחיסונים וכלי רכב להעברת תרופות. למרות OMVs נגזרים OM, זה זמן רב מוערך כי מטען השומנים והחלבון של OMV שונה, לעתים קרובות באופן משמעותי, מזה של OM. לאחרונה, ראיות לכך שחיידקים יכולים לשחרר סוגים רבים של OMVs התגלו, וקיימות ראיות לכך שגודל יכול להשפיע על מנגנון ספיגתם על ידי תאים מארחים. עם זאת, מחקרים בתחום זה מוגבלים על ידי קשיים בהפרדה יעילה של OMVs בגודל הטרוגניים. צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות (DGC) שימשה באופן מסורתי למטרה זו; עם זאת, טכניקה זו גוזלת זמן וקשה להרחבה. כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC), לעומת זאת, פחות מסורבלת ומעניקה את עצמה להרחבה העתידית הדרושה לשימוש טיפולי ב- OMVs. כאן, אנו מתארים גישה SEC המאפשרת הפרדה לשחזור של שלפוחיות בגודל הטרוגניים, באמצעות מקרה בדיקה, OMVs המיוצר על ידי Aggregatibacter actinomycetemcomitans, אשר נע בקוטר של פחות מ 150 ננומטר עד יותר מ 350 ננומטר. אנו מדגימים הפרדה של OMVs "גדולים" (350 ננומטר) ו- OMVs "קטנים" (<150 ננומטר), שאומתו על ידי פיזור אור דינמי (DLS). אנו ממליצים על טכניקות מבוססות SEC על טכניקות מבוססות DGC להפרדה של שלפוחיות בגודל הטרוגני בשל קלות השימוש שלה, רבייה (כולל משתמש למשתמש), ואפשרות להרחבה.

Introduction

חיידקים גרם שלילי לשחרר שלל נגזר הממברנה החיצונית שלהם, מה שנקרא שלל הממברנה החיצונית (OMVs), לאורך הצמיחה. OMVs אלה ממלאים תפקידים חשובים בתקשורת בין תאים לתא, הן בין חיידקים לפונדקאי והן בין תאים חיידקיים, על ידי נשיאת מספר ביומולקולים חשובים, כולל DNA / RNA, חלבונים, שומנים ופפטידוגליקנים1,2. בפרט, התפקיד של OMVs בפתוגנזה חיידקית נחקר בהרחבה בשל העשרתם בגורמי ויראולנס מסוימים ורעלים3,4,5,6,7,8,9,10,11.

OMVs דווחו לנוע בין 20 ל 450 ננומטר, בהתאם לחיידקי האב ואת שלב הצמיחה, עם מספר סוגים של חיידקים משחררים OMVs בגודל הטרוגניים8,12,13,14, אשר גם שונים בהרכב החלבון שלהם ומנגנון של כניסת תא מארח12. H. pylori שוחרר OMVs בקוטר הנע בין 20 ל 450 ננומטר, עם OMVs קטן יותר המכיל הרכב חלבון הומוגני יותר מאשר OMVs גדול יותר. חשוב לציין, שתי האוכלוסיות של OMVs נצפו להיות מופנמים על ידי תאים מארחים באמצעות מנגנונים שונים12. בנוסף, הוכחנו כי Aggregatibacter actinomycetemcomitans משחרר אוכלוסייה של OMVs קטנים (<150 ננומטר) יחד עם אוכלוסייה של OMVs גדול (>350 ננומטר), עם OMVs המכיל כמות משמעותית של רעלן חלבון מופרש, לויקוטוקסין (LtxA)15. בעוד התפקיד של הטרוגניות OMV בתהליכים הסלולר הוא חשוב בבירור, קשיים טכניים בהפרדה וניתוח אוכלוסיות נפרדות של שלל הגבילו את המחקרים האלה.

בנוסף לחשיבותם בפתוגנזה חיידקית, הוצעו OMVs לשימוש במספר יישומים ביוטכנולוגיה, כולל כחיסונים וכלי רכב להעברת תרופות16,17,18,19,20. לשימושם התרגומי בגישות כאלה, נדרשת הכנה נקייה ומונודיספרסית של שלשלות. לכן, שיטות יעילות ויעילות של הפרדה נחוצות.

בדרך כלל, צנטריפוגה הדרגתית צפיפות (DGC) משמשת להפרדת אוכלוסיות ארסיות בגודל הטרוגניים מפסולת הסלולר, כולל flagellae וחלבונים מופרשים21; השיטה דווחה גם כגישה להפריד בין אוכלוסין OMV בגודל הטרוגניים12,13,14. עם זאת, DGC גוזל זמן רב, לא יעיל ומשתנה מאוד משתמש למשתמש22 ולכן הוא, לא אידיאלי עבור קנה מידה למעלה. לעומת זאת, כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (SEC) מייצגת גישה מדרגית, יעילה ועקבית לטיהור OMVs21,23,24. גילינו כי ארוך (50 ס"מ), זרימת כבידה, טור SEC, מלא מדיום סינון ג'ל מספיק לטיהור יעיל והפרדה של אוכלוסין של OMVs. באופן ספציפי, השתמשנו בגישה זו כדי להפריד A. actinomycetemcomitans OMVs לתת אוכלוסין "גדול" ו "קטן", כמו גם כדי להסיר זיהום חלבון ו- DNA. הטיהור הושלם בפחות מ 4 שעות, והפרדה מלאה של תת אוכלוסין OMV והסרת פסולת הושלמה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הכנת מאגרים

  1. כדי להכין את מאגר הכביסה ELISA, הוסף 3.94 גרם בסיס טריס, 8.77 גרם NaCl, ו 1 גרם אלבומין סרום בקר (BSA) ל 1 ליטר של מים deionized (DI). הוסף 500 μL פוליסורבט-20. כוונן את ה- pH ל- 7.2 באמצעות HCl או NaOH.
  2. כדי להכין את מאגר החסימה, הוסף 3.94 גרם בסיס טריס, 8.77 גרם NaCl ו- 10 גרם BSA. הוסף 500 μL פוליסורבט-20 ל 1 ליטר של מים DI. כוונן את ה- pH ל- 7.2 באמצעות HCl או NaOH.
  3. להכנת מאגר ה-ELUTION (PBS), הוסיפו 8.01 גרם NaCl, 2.7 גרם KCl, 1.42 גרם Na2HPO4ו-0.24 גרם KH2PO4 ל-1 ליטר DI מים. כוונן את ה- pH ל- 7.4 באמצעות HCl או NaOH.
    הערה: פתרון פי 10 של מאגר זה יכול להתבצע ונדולל עם מי DI לפי הצורך.

2. הכנת דגימת OMV

  1. לגדל A. actinomycetemcomitans תאים לשלב מעריכי מאוחר (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר של 0.7). גלולה את התאים על ידי centrifuging פעמיים ב 10,000 x גרם ב 4 °C (50 °F) במשך 10 דקות. סנן את supernatant דרך מסנן 0.45 מיקרומטר.
  2. מרכז את סופרנטנט נטול החיידקים באמצעות מסנני ניתוק משקל מולקולריים 50 kDa. אולטרה-צנטריפוגה את הפתרון המרוכז ב 105,000 x g ב 4 °C (50 °F) במשך 30 דקות.
  3. resuspend הכדור PBS ו ultracentrifuge שוב (105,000 x גרם ב 4 °C (30 דקות).) resuspend הכדור ב 2 מ"ל של PBS.

3. אריזת עמודת S-1000

  1. מערבבים את בקבוק המניות של מדיום סינון ג'ל עם מוט ערבוב זכוכית ויוצקים לתוך בקבוק זכוכית את הנפח הדרוש למילוי העמוד, בתוספת כ -50% עודף (כ -135 מ"ל). תן חרוזים אלה לשבת עד שהם התיישבו, ולאחר מכן decant את הנוזל העודף. יש להזרים את החרוזים במאגר אלוטיון, כך שהפתרון הסופי הוא כ-70% (לפי נפח) ג'ל, 30% חוצץ. Degas הפתרון תחת ואקום.
  2. הר את עמוד הזכוכית אנכית באמצעות מעמד טבעת ולמלא עם חוצץ elution כדי להרטיב את הקירות של העמוד. מסננים את המאגר עד שנותרו בעמודה רק כ-1 ס"מ של מאגר.
  3. מבלי ליצור בועות, בזהירות pipette חרוזים לתוך העמודה, מילוי העמודה למעלה. המשך לנקז מאגר עודף לאורך כל תהליך זה. הקפד לא לתת החרוזים להתיישב לחלוטין לפני הוספת חרוזים נוספים לראש העמודה. יש לארוז את העמודה לגובה של כ-2 ס"מ מתחת לתחתית מאגר העמודות.

4. טעינת המדגם ואיסוף שברים

  1. דגה חיץ elution תחת ואקום. לשטוף את העמודה עם שני כרכים עמודה (180 מ"ל) של מאגר elution.
  2. אפשר למאגר הנותר להיכנס באופן מלא לעמודה. לאחר החיץ הגיע לחלק העליון של שכבת הג'ל, בזהירות pipette מדגם 2 מ"ל המכיל OMVs (בריכוז שומנים של כ 100 - 200 נמול / L) על פני השטח של החרוזים, נזהר לא להפריע לאף אחד החרוזים בחלק העליון של העמוד. אפשר לדגימה להיכנס באופן מלא לג'ל, כלומר, כאשר אין נוזל נשאר מעל שכבת הג'ל.
  3. בזהירות ובאיטיות להוסיף חוצץ elution על גבי עמודת הג'ל. אל תפריע לשכבה העליונה של הג'ל, שכן זה יגרום דילול מדגם.
  4. מקם צינור יחיד של 50 מ"ל מתחת לעמודה ופתח את העמודה. לאסוף את 20 מ"ל הראשונים של האלנט. הוסף מאגר אלגנטי נוסף לראש העמודה, בזהירות, לפי הצורך כדי להבטיח שהעמודה לעולם לא תתייבש.
  5. מקם סדרה של צינורות 1.5 מ"ל מתחת לעמוד. התחל את העמודה ואסוף סדרה של דגימות 1-mL בכל צינור. כאשר הדגימות נאספות, המשך להוסיף מאגר אלוטציה לראש העמודה, לפי הצורך. חזור על הפעולה עד שנאספו 96 שברים. עצור את העמודה.
    הערה: הדגימות צריכות להיות מאוחסנות ב -20 °C לאחסון לטווח ארוך או 4 °C לאחסון לטווח קצר עד ניתוח נוסף.
  6. כדי לנקות את העמודה, הפעל אמצעי אחסון של עמודה אחת (90 מ"ל) של 0.1 M NaOH לאורך העמודה. הפעל שני אמצעי אחסון של עמודות (180 מ"ל) של מאגר אלוטיון דרך העמודה.

5. ניתוח מדגם

  1. כדי למדוד את ריכוז השומנים בכל שבר, pipette 50 μL של כל שבר לתוך באר אחת של צלחת 96-well. לכל באר, להוסיף 2.5 μL של צבע ליפופילי. דגירה במשך 15 s. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות על קורא לוחות עם אורך גל עירור של 515 ננומטר ואורך גל פליטה של 640 ננומטר. כדי לחשב את השבר של כל השומנים בכל מדגם, לסכם את כל עוצמות הפליטה ולחלק כל עוצמה בודדת על ידי סך.
  2. כדי למדוד את הריכוז של חלבון מסוים, פיפטה 100 μL של כל שבר לתוך באר אחת של צלחת אימונו ELISA. דגירה ב 25 °C (5 °F) במשך 3 שעות.
    1. דק את הדגימות. הוסף 200 μL של מאגר לשטוף ELISA לכל באר ו decant. יש לחזור על הפעולה ארבע פעמים בסך הכל חמש כביסות.
    2. הוסף 200 μL של חוצץ חסימה לכל באר ודגרה במשך 1 שעות ב 25 °C (70 °F). דקאנט.
    3. לוחות דגירה עם 100 μL חסימת חוצץ בתוספת נוגדן ראשוני (1:10,000 עבור נוגדן מטוהר; 1:10 עבור נוגדן לא מתאים) לילה ב 4 °C (4 °F). דקאנט.
    4. הוסף 200 μL של מאגר לשטוף ELISA לכל באר ו decant. יש לחזור על הפעולה ארבע פעמים בסך הכל חמש כביסות.
    5. הוסף 100 μL של מאגר שטיפת ELISA בתוספת נוגדן משני (1:30,000) לכל באר. דגירה במשך 1 שעות ב 25 °C (5 °F).
    6. הוסף 200 μL של מאגר לשטוף ELISA לכל באר ו decant. יש לחזור על הפעולה ארבע פעמים בסך הכל חמש כביסות.
    7. הוסף 100 μL של 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB) פתרון שלב אחד ודגרה במשך 15-30 דקות או עד צבע כחול מתפתח. עצור את תגובת TMB עם 50 μL של פתרון העצירה.
    8. על קורא לוחות, לקרוא את הספיגה של כל באר אורך גל של 450 ננומטר.
  3. כדי למדוד את ריכוז החלבון הכולל, תיעדו את הספיגה באורך גל של 280 ננומטר (A280)של כל שבר, באמצעות ספקטרופוטומטר UV-vis.

תרשים של הפרוטוקול מוצג באיור 1.

figure-protocol-5198
איור 1: שרטוט של הליך SEC. העמודה עמוסה עם סינון ג'ל מנוטרל בינוני בזהירות כדי למנוע בועות ואי רציפות, ולאחר מכן שטף עם שני כרכים עמודה של מאגר elution. לאחר מכן, המדגם מועבר בזהירות על החלק העליון של הג'ל, מבלי לשבש את אריזת הג'ל. העמודה נפתחת ומופעלת עד שהדגימה נכנסת לחלוטין לג'ל. בשלב זה, חוצץ ממוקם על החלק העליון של העמודה, ואת 20 מ"ל הראשון של eluate נאסף. לאחר מכן, נאספת סדרה של שברי 1 מ"ל. שברים אלה ממוקמים לאחר מכן בצלחת 96-well או 96-צלחת אימונו היטב לניתוח של תוכן שומנים וחלבון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של איור זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 2 מציג תוצאות מייצגות משיטת שירות זו. OMVs המיוצר על ידי A. actinomycetemcomitans זן JP2 טוהרו לראשונה מן התרבות supernatant באמצעות אולטרה צנטריפוגה15. מצאנו בעבר כי זן זה מייצר שתי אוכלוסיות של OMVs, אחד עם קטרים של כ 300 ננומטר ואחד עם קוטר של כ 100 ננומטר15. כדי לה...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

כאן, סיפקנו פרוטוקול להפרדה פשוטה, מהירה וניתן לשחזור של תת-אוכלוסין חיידקי OMV. למרות שהטכניקה היא ישירה יחסית קדימה, ישנם כמה שלבים שיש לבצע בזהירות רבה כדי להבטיח שהפרדה יעילה תתרחש בעמודה. ראשית, חיוני כי הג'ל להיות טעון לתוך הטור בזהירות ובאיטיות כדי למנוע בועות אוויר. ראינו כי השארת הג'?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לדווח.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע (1554417) ומכוני הבריאות הלאומיים (DE027769).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1-Step Ultra TMB-ELISAThermo Scientific34028
Amicon 50 kDa filtersMillipore SigmaUFC905024
Bovine Serum Albumin (BSA)Fisher ScientificBP9704-100
ELISA Immuno PlatesThermo Scientific442404
FM 4-64Thermo ScientificT133201.5 x 50 cm
Glass Econo-ColumnBioRad7371552
Infinite 200 Pro Plate ReaderTecan
Potassium Chloride (KCl)Amresco (VWR)0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)Amresco (VWR)0781-500G
Sephacryl S-1000 SuperfineGE Healthcare17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl)Fisher ChemicalS271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)Amresco (VWR)0404-500G
Tris BaseVWR0497-1KG
Tween(R) 20Acros Organics23336-2500

References

  1. Kuehn, M. J., Kesty, N. C. Bacterial outer membrane vesicles and the host-pathogen interaction. Genes and Development. 19, 2645-2655 (2005).
  2. Kulp, A., Kuehn, M. J. Biological functions and biogenesis of secreted bacterial outer membrane vesicles. Annual Reviews Microbiology. 64, 163-184 (2010).
  3. Kato, S., Kowashi, Y., Demuth, D. R. Outer membrane-like vesicles secreted by Actinobacillus actinomycetemcomitans are enriched in leukotoxin. Microbial Pathogenesis. 32 (1), 1-13 (2002).
  4. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414(2018).
  5. Haurat, M. F., et al. Selective sorting of cargo proteins into bacterial membrane vesicles. Journal of Biological Chemistry. 286 (2), 1269-1276 (2011).
  6. Horstman, A. L., Kuehn, M. J. Enterotoxigenic Escherichia coli secretes active heat-labile enterotoxin via outer membrane vesicles. The Journal of Biological Chemistry. 275 (17), 12489-12496 (2000).
  7. Wai, S. N., et al. Vesicle-mediated export and assembly of pore-forming oligomers of the Enterobacterial ClyA cytotoxin. Cell. 115, 25-35 (2003).
  8. Balsalobre, C., et al. Release of the Type I secreted α-haemolysin via outer membrane vesicles from Escherichia coli. Molecular Microbiology. 59 (1), 99-112 (2006).
  9. Donato, G. M., et al. Delivery of Bordetella pertussis adenylate cyclase toxin to target cells via outer membrane vesicles. FEBS Letters. 586, 459-465 (2012).
  10. Kim, Y. R., et al. Outer membrane vesicles of Vibrio vulnificus deliver cytolysin-hemolysin VvhA into epithelial cells to induce cytotoxicity. Biochemical and Biophysical Research Communications. 399, 607-612 (2010).
  11. Maldonado, R., Wei, R., Kachlany, S. C., Kazi, M., Balashova, N. V. Cytotoxic effects of Kingella kingae outer membrane vesicles on human cells. Microbial Pathogenesis. 51 (1-2), 22-30 (2011).
  12. Turner, L., et al. Helicobacter pylori outer membrane vesicle size determines their mechanisms of host cell entry and protein content. Frontiers in Immunology. 9, 1466(2018).
  13. Zavan, L., Bitto, N. J., Johnston, E. L., Greening, D. W., Kaparakis-Liaskos, M. Helicobacter pylori growth stage determines the size, protein composition, and preferential cargo packaging of outer membrane vesicles. Proteomics. 19 (1-2), 1800209(2019).
  14. Rompikuntal, P. K., et al. Perinuclear localization of internalized outer membrane vesicles carrying active cytolethal distending toxin from Aggregatibacter actinomycetemcomitans. Infections and Immunity. 80 (1), 31-42 (2012).
  15. Nice, J. B., et al. Aggregatibacter actinomycetemcomitans leukotoxin is delivered to host cells in an LFA-1-independent manner when associated with outer membrane vesicles. Toxins. 10 (10), 414(2018).
  16. Stevenson, T. C., et al. Immunization with outer membrane vesicles displaying conserved surface polysaccharide antigen elicits broadly antimicrobial antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (14), 3106-3115 (2018).
  17. Gujrati, V., et al. Bioengineered bacterial outer membrane vesicles as cell-specific drug-delivery vehicles for cancer therapy. ACS Nano. 8 (2), 1525-1537 (2014).
  18. Huang, W., et al. Development of novel nanoantibiotics using an outer membrane vesicle-based drug efflux mechanism. Journal of Controlled Release. 317, 1-22 (2020).
  19. Chen, D. J., et al. Delivery of foreign antigens by engineered outer membrane vesicle vaccines. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (7), 3099-3104 (2010).
  20. Chen, L., et al. Outer membrane vesicles displaying engineered glycotopes elicit protective antibodies. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (26), 3609-3618 (2016).
  21. Singorenko, P. D., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: A technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).
  22. Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
  23. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Science Reports. 7 (1), 15297(2017).
  24. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  25. Lally, E. T., Golub, E. E., Kieba, I. R. Identification and immunological characterization of the domain of Actinobacillus actinomycetemcomitans leukotoxin that determines its specificity for human target cells. Journal of Biological Chemistry. 269 (49), 31289-31295 (1994).
  26. Chang, E. H., Giaquinto, P., Huang, J., Balashova, N. V., Brown, A. C. Epigallocatechin gallate inhibits leukotoxin release by Aggregatibacter actinomycetemcomitans by promoting association with the bacterial membrane. Molecular Oral Microbiology. 35 (1), 29-39 (2020).
  27. Klimentová, J., Stulík, J. Methods of isolation and purification of outer membrane vesicles from gram-negative bacteria. Microbiological Research. 170, 1-9 (2015).
  28. Dauros Singorenko, P., et al. Isolation of membrane vesicles from prokaryotes: a technical and biological comparison reveals heterogeneity. Journal of Extracellular Vesicles. 6 (1), 1324731(2017).
  29. Monguió-Tortajada, M., Gálvez-Montón, C., Bayes-Genis, A., Roura, S., Borràs, F. E. Extracellular vesicle isolation methods: rising impact of size-exclusion chromatography. Cellular and Molecular Life Sciences. 76 (12), 2369-2382 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

169

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved