Größenausschlusschromatographie zur Analyse der Heterogenität bakterieller äußerer Membranvesikel

Zusammenfassung

Bakterielle Vesikel spielen eine wichtige Rolle bei der Pathogenese und haben vielversprechende biotechnologische Anwendungen. Die Heterogenität der Vesikel erschwert die Analyse und Verwendung; Daher ist eine einfache, reproduzierbare Methode zur Trennung unterschiedlicher Größen von Vesikeln erforderlich. Hier demonstrieren wir die Verwendung der Größenausschlusschromatographie zur Trennung heterogener Vesikel, die von Aggregatibacter actinomycetemcomitansproduziert werden.

Zusammenfassung

Die Zellwand gramnegativer Bakterien besteht aus einer inneren (zytoplasmatischen) und äußeren Membran (OM), die durch eine dünne Peptidoglykanschicht getrennt sind. Während des gesamten Wachstums kann die äußere Membran kugelförmige äußere Membranvesikel (OMVs) bilden. Diese OMVs sind an zahlreichen zellulären Funktionen beteiligt, einschließlich der Frachtabgabe an Wirtszellen und der Kommunikation mit Bakterienzellen. In jüngster Zeit wurde das therapeutische Potenzial von OMVs untersucht, einschließlich ihrer Verwendung als Impfstoffe und Arzneimittelverabreichungsvehikel. Obwohl OMVs vom OM abgeleitet sind, wird seit langem geschätzt, dass sich die Lipid- und Proteinladung der OMV oft deutlich von der der OM unterscheidet. In jüngerer Zeit wurden Beweise dafür entdeckt, dass Bakterien mehrere Arten von OMVs freisetzen können, und es gibt Hinweise darauf, dass die Größe den Mechanismus ihrer Aufnahme durch Wirtszellen beeinflussen kann. Studien in diesem Bereich sind jedoch durch Schwierigkeiten bei der effizienten Trennung der heterogen dimensionierten OMVs begrenzt. Zu diesem Zweck wurde traditionell die Dichtegradientenzentrifugation (DGC) verwendet; Diese Technik ist jedoch zeitaufwendig und schwer zu skalieren. Die Größenausschlusschromatographie (SEC) hingegen ist weniger umständlich und eignet sich für das notwendige zukünftige Scale-up für den therapeutischen Einsatz von OMVs. Hier beschreiben wir einen SEC-Ansatz, der eine reproduzierbare Trennung von heterogen großen Vesikeln ermöglicht, wobei als Testfall OMVs von Aggregatibacter actinomycetemcomitanenverwendet werden, deren Durchmesser von weniger als 150 nm bis über 350 nm reicht. Wir demonstrieren die Trennung von "großen" (350 nm) OMVs und "kleinen" (<150 nm) OMVs, verifiziert durch dynamische Lichtstreuung (DLS). Wir empfehlen SEC-basierte Techniken gegenüber DGC-basierten Techniken zur Trennung von heterogen großen Vesikeln aufgrund ihrer Benutzerfreundlichkeit, Reproduzierbarkeit (einschließlich Benutzer-zu-Benutzer) und der Möglichkeit des Scale-ups.

Einleitung

Gramnegative Bakterien setzen während des gesamten Wachstums Vesikel frei, die von ihrer äußeren Membran abgeleitet sind, sogenannte äußere Membranvesikel (OMVs). Diese OMVs spielen eine wichtige Rolle in der Zell-zu-Zell-Kommunikation, sowohl zwischen Bakterien und Wirt als auch zwischen Bakterienzellen, indem sie eine Reihe wichtiger Biomoleküle tragen, darunter DNA / RNA, Proteine, Lipide und Peptidoglykane^1,2. Insbesondere wurde die Rolle von OMVs bei der bakteriellen Pathogenese aufgrund ihrer Anreicherung in bestimmten Virulenzfaktoren und Toxinen^3,4 ,^{5,6,7,8,9,10,11}umfassend untersucht.

Es wurde berichtet, dass OMVs in der Größe von 20 bis 450 nm reichen, abhängig von den Elternbakterien und dem Wachstumsstadium, wobei mehrere Arten von Bakterien heterogene OMVs^{freisetzen 8,}12^,13,14, die sich auch in ihrer Proteinzusammensetzung und ihrem Mechanismus des Wirtszelleintritts^{unterscheiden 12}. H. pylori gab OMVs mit einem Durchmesser von 20 bis 450 nm frei, wobei die kleineren OMVs eine homogenere Proteinzusammensetzung enthielten als die größeren OMVs. Wichtig ist, dass die beiden Populationen von OMVs von Wirtszellen über verschiedene Mechanismen internalisiert wurden¹². Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass Aggregatibacter actinomycetemcomitans eine Population kleiner (<150 nm) OMVs zusammen mit einer Population großer (>350 nm) OMVs freisetzt, wobei die OMVs eine signifikante Menge eines sezernierten Proteintoxins, Leukotoxin (LtxA)^{15 enthalten.} Während die Rolle der OMV-Heterogenität in zellulären Prozessen eindeutig wichtig ist, haben technische Schwierigkeiten bei der Trennung und Analyse verschiedener Populationen von Vesikeln diese Studien eingeschränkt.

Zusätzlich zu ihrer Bedeutung für die bakterielle Pathogenese wurden OMVs für den Einsatz in einer Reihe von biotechnologischen Anwendungen vorgeschlagen, darunter als Impfstoffe und Arzneimittelverabreichungsvehikel^{16,17,18,19,20}. Für ihre translationale Verwendung in solchen Ansätzen ist eine saubere und monodisperse Herstellung von Vesikeln erforderlich. Daher sind effektive und effiziente Trennmethoden notwendig.

Am häufigsten wird die Dichtegradientenzentrifugation (DGC) verwendet, um heterogene Vesikelpopulationen von Zelltrümmern, einschließlich Flagellen und sezernierten Proteinen, zu trennen²¹; Die Methode wurde auch als Ansatz zur Trennung heterogen großer OMV-Subpopulationen^12,13,14berichtet. DGC ist jedoch zeitaufwändig, ineffizient und sehr variabel von Benutzer zu Benutzer²² und daher nicht ideal für das Scale-up. Im Gegensatz dazu stellt die Größenausschlusschromatographie (SEC) einen skalierbaren, effizienten und konsistenten Ansatz zur Reinigung von OMVs^{21,23,24 dar.} Wir haben festgestellt, dass eine lange (50 cm), Gravity-Flow, SEC-Säule, gefüllt mit Gelfiltrationsmedium, ausreicht, um Subpopulationen von OMVs effizient zu reinigen und zu trennen. Konkret haben wir diesen Ansatz verwendet, um A. actinomycetemcomitans OMVs in "große" und "kleine" Subpopulationen zu unterteilen sowie Protein- und DNA-Kontaminationen zu entfernen. Die Reinigung wurde in weniger als 4 Stunden abgeschlossen und die vollständige Trennung der OMV-Subpopulationen und die Entfernung von Trümmern wurde erreicht.

Protokoll

1. Vorbereitung von Puffern

1. Um den ELISA-Waschpuffer vorzubereiten, fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 1 g Rinderserumalbumin (BSA) zu 1 L entionisiertem (DI) Wasser hinzu. Fügen Sie 500 μL Polysorbat-20 hinzu. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein.
2. Um den Blockierungspuffer vorzubereiten, fügen Sie 3,94 g Tris-Base, 8,77 g NaCl und 10 g BSA hinzu. 500 μL Polysorbat-20 bis 1 L DI-Wasser hinzufügen. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,2 ein.
3. Zur Herstellung des Elutionspuffers (PBS) werden 8,01 g NaCl, 2,7 g KCl, 1,42 g_Na2HPO4und 0,24 g_KH2PO₄ zu 1 L DI Wasser hinzugefügt. Stellen Sie den pH-Wert mit HCl oder NaOH auf 7,4 ein.
   HINWEIS: Eine 10-fache Lösung dieses Puffers kann hergestellt und bei Bedarf mit DI-Wasser verdünnt werden.

2. Vorbereitung der OMV-Probe

1. Züchten Sie A. actinomycetemcomitans-Zellen bis zur späten exponentiellen Phase (optische Dichte bei 600 nm von 0,7). Pelletieren Sie die Zellen durch zweimalige Zentrifugieren bei 10.000 x g bei 4 °C für 10 min. Filtern Sie den Überstand durch einen 0,45 μm-Filter.
2. Konzentrieren Sie den bakterienfreien Überstand mit 50 kDa-Molekulargewichts-Cut-off-Filtern. Ultrazentrifuge die konzentrierte Lösung bei 105.000 x g bei 4 °C für 30 min.
3. Pellet in PBS und Ultrazentrifuge erneut schleudern (105.000 x g bei 4 °C für 30 Min.) Das Pellet in 2 ml PBS wieder auffüllen.

3. Verpacken der S-1000-Säule

1. Mischen Sie die Vorratsflasche mit Gelfiltermedium mit einem Glasrührstab und gießen Sie in eine Glasflasche das Volumen, das zum Füllen der Säule erforderlich ist, plus ca. 50% Überschuss (ca. 135 ml). Lassen Sie diese Perlen sitzen, bis sie sich abgesetzt haben, und dekantieren Sie dann die überschüssige Flüssigkeit ab. Die Perlen in Elutionspuffer resuspendieren, so dass die endgültige Lösung etwa 70% (nach Volumen) Gel, 30% Puffer ist. Entgasen Sie die Lösung unter Vakuum.
2. Montieren Sie die Glassäule vertikal mit einem Ringständer und füllen Sie sie mit einem Elutionspuffer, um die Wände der Säule zu benetzen. Entleeren Sie den Puffer, bis nur noch etwa 1 cm Puffer in der Säule verbleibt.
3. Ohne Blasen zu erzeugen, pipetieren Sie die Perlen vorsichtig in die Säule und füllen Sie die Säule nach oben. Fahren Sie fort, überschüssigen Puffer während dieses Prozesses abzuleiten. Stellen Sie sicher, dass sich die Perlen nicht vollständig absetzen, bevor Sie zusätzliche Perlen an der Oberseite der Säule hinzufügen. Die Säule sollte bis zu einer Höhe von ca. 2 cm unter dem Boden des Säulenbehälters verpackt werden.

4. Beladen der Probe und Sammeln von Fraktionen

1. Entgasen Sie den Elutionspuffer unter Vakuum. Waschen Sie die Säule mit zwei Säulenvolumina (180 ml) Elutionspuffer.
2. Lassen Sie den verbleibenden Puffer vollständig in die Spalte gelangen. Sobald der Puffer die Oberseite der Gelschicht erreicht hat, pipettieren Sie vorsichtig eine 2-ml-Probe, die OMVs enthält (bei einer Lipidkonzentration von etwa 100 - 200 nmol / L), auf die Oberfläche der Perlen, wobei Sie darauf achten, keine der Perlen an der Oberseite der Säule zu stören. Lassen Sie die Probe vollständig in das Gel eindringen, dh wenn keine Flüssigkeit über der Gelschicht verbleibt.
3. Fügen Sie vorsichtig und langsam einen Elutionspuffer auf die Gelsäule hinzu. Stören Sie nicht die oberste Schicht des Gels, da dies zu einer Verdünnung der Probe führt.
4. Legen Sie ein einzelnes 50-ml-Rohr unter die Säule und öffnen Sie die Säule. Sammeln Sie die ersten 20 ml des Eluenten. Fügen Sie bei Bedarf vorsichtig einen zusätzlichen Elutionspuffer an der Oberseite der Säule hinzu, um sicherzustellen, dass die Säule niemals trocken ist.
5. Legen Sie eine Reihe von 1,5-ml-Röhrchen unter die Säule. Starten Sie die Säule und sammeln Sie eine Reihe von 1-ml-Proben in jedem Röhrchen. Während die Proben gesammelt werden, fügen Sie bei Bedarf weiterhin einen Elutionspuffer oben in der Spalte hinzu. Wiederholen Sie, bis 96 Fraktionen gesammelt wurden. Stoppen Sie die Spalte.
   HINWEIS: Die Proben sollten bei -20 °C für die Langzeitlagerung oder 4 °C für die kurzfristige Lagerung bis zur weiteren Analyse gelagert werden.
6. Um die Säule zu reinigen, führen Sie ein Spaltenvolumen (90 ml) von 0,1 M NaOH durch die Säule. Führen Sie zwei Spaltenvolumina (180 ml) Elutionspuffer durch die Säule.

5. Probenanalyse

1. Um die Lipidkonzentration in jeder Fraktion zu messen, pipettieren Sie 50 μL jeder Fraktion in eine einzige Vertiefung einer 96-Well-Platte. Zu jeder Vertiefung werden 2,5 μL lipophiler Farbstoff hinzugefügt. Inkubieren für 15 s. Messen Sie die Fluoreszenzintensität an einem Plattenleser mit einer Anregungswellenlänge von 515 nm und einer Emissionswellenlänge von 640 nm. Um den Anteil aller Lipide in jeder Probe zu berechnen, summieren Sie alle Emissionsintensitäten und dividieren Sie jede einzelne Intensität durch die Summe.
2. Um die Konzentration eines bestimmten Proteins zu messen, pipetten Sie 100 μL jeder Fraktion in eine einzelne Vertiefung einer ELISA-Immunplatte. Bei 25 °C für 3 h inkubieren.
   1. Dekantieren Sie die Samples. Fügen Sie 200 μL ELISA-Waschpuffer zu jeder Vertiefung hinzu und dekantieren Sie. Wiederholen Sie viermal für insgesamt fünf Wäschen.
   2. Fügen Sie 200 μL Blockierpuffer zu jeder Vertiefung hinzu und inkubieren Sie für 1 h bei 25 °C. Umfüllen.
   3. Inkubationsplatten mit 100 μL Sperrpuffer plus primärem Antikörper (1:10.000 für gereinigte Antikörper; 1:10 für ungereinigte Antikörper) über Nacht bei 4 °C. Umfüllen.
   4. Fügen Sie 200 μL ELISA-Waschpuffer zu jeder Vertiefung hinzu und dekantieren Sie. Wiederholen Sie viermal für insgesamt fünf Wäschen.
   5. Fügen Sie 100 μL ELISA-Waschpuffer plus sekundären Antikörper (1:30.000) zu jeder Vertiefung hinzu. 1 h bei 25 °C inkubieren.
   6. Fügen Sie 200 μL ELISA-Waschpuffer zu jeder Vertiefung hinzu und dekantieren Sie. Wiederholen Sie viermal für insgesamt fünf Wäschen.
   7. Fügen Sie 100 μL der 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB) einstufigen Lösung hinzu und inkubieren Sie sie für 15-30 min oder bis sich eine blaue Farbe entwickelt. Stoppen Sie die TMB-Reaktion mit 50 μL der Stopplösung.
   8. Lesen Sie auf einem Plattenleser die Absorption jeder Vertiefung bei einer Wellenlänge von 450 nm ab.
3. Um die Gesamtproteinkonzentration zu messen, zeichnen Sie die Absorption bei einer Wellenlänge von 280 nm (A₂₈₀₎jeder Fraktion mit einem UV-Vis-Spektralphotometer auf.

Ein Schema des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.

Abbildung 1: Schematische Darstellung des SEC-Verfahrens. Die Säule wird sorgfältig mit entgastem Gelfiltrationsmedium verpackt, um Blasen und Diskontinuitäten zu vermeiden, und dann mit zwei Säulenvolumina Elutionspuffer gewaschen. Als nächstes wird die Probe vorsichtig auf die Oberseite des Gels pipettiert, ohne die Gelverpackung zu stören. Die Säule wird geöffnet und läuft, bis die Probe vollständig in das Gel gelangt. An diesem Punkt wird der Puffer auf die Oberseite der Säule gelegt und die ersten 20 ml Eluat werden gesammelt. Als nächstes wird eine Reihe von 1-ml-Fraktionen gesammelt. Diese Fraktionen werden dann in eine 96-Well-Platte oder eine 96-Well-Immuno-Platte zur Analyse des Lipid- und Proteingehalts gelegt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergebnisse

Abbildung 2 zeigt repräsentative Ergebnisse dieser Methode. OMVs, die von A. actinomycetemcomitans Stamm JP2 produziert wurden, wurden zuerst aus dem Kulturüberstand mittels Ultrazentrifugation¹⁵gereinigt. Wir haben zuvor festgestellt, dass dieser Stamm zwei Populationen von OMVs produziert, eine mit Durchmessern von etwa 300 nm und eine mit Durchmessern von etwa 100 nm¹⁵. Um diese OMV-Populationen zu trennen, haben wir die Probe mit...

Diskussion

Hier haben wir ein Protokoll für die einfache, schnelle und reproduzierbare Trennung bakterieller OMV-Subpopulationen bereitgestellt. Obwohl die Technik relativ einfach ist, gibt es einige Schritte, die äußerst sorgfältig durchgeführt werden müssen, um sicherzustellen, dass eine effiziente Trennung in der Säule erfolgt. Zunächst ist es wichtig, dass das Gel vorsichtig und langsam in die Säule geladen wird, um Luftblasen zu vermeiden. Wir haben beobachtet, dass das Gel vor dem Laden der Säule mehrere Stunden bei...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028
Amicon 50 kDa filters	Millipore Sigma	UFC905024
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9704-100
ELISA Immuno Plates	Thermo Scientific	442404
FM 4-64	Thermo Scientific	T13320	1.5 x 50 cm
Glass Econo-Column	BioRad	7371552
Infinite 200 Pro Plate Reader	Tecan
Potassium Chloride (KCl)	Amresco (VWR)	0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)	Amresco (VWR)	0781-500G
Sephacryl S-1000 Superfine	GE Healthcare	17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Chemical	S271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Amresco (VWR)	0404-500G
Tris Base	VWR	0497-1KG
Tween(R) 20	Acros Organics	23336-2500