크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석

요약

세균성 소포는 병인에 중요한 역할을 하고 유망한 생명 공학 응용 프로그램이 있습니다. 소포의 이질성은 분석과 사용을 복잡하게 합니다. 따라서 다양한 크기의 소포를 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 여기에서, 우리는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 이기종 소포를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 보여줍니다.

초록

그람 음성 박테리아의 세포벽은 얇은 펩티도글리칸 층으로 분리된 내부(세포질) 및 외부 막(OM)으로 구성됩니다. 성장을 통해 외부 멤브레인은 구형 외부 막 소포 (OMV)를 형성하기 위해 출혈 할 수 있습니다. 이러한 OmV는 호스트 세포에 화물 전달 및 세균 세포와의 통신을 포함한 수많은 세포 기능에 관여합니다. 최근, OMV의 치료 잠재력은 백신 및 약물 전달 차량으로 의 사용을 포함하여 탐구되기 시작했습니다. OMV는 OM에서 파생되지만 OMV의 지질 및 단백질 화물은 OM과 크게 다르다는 것을 오랫동안 인식해 왔습니다. 최근에는 박테리아가 여러 유형의 OMV를 방출할 수 있다는 증거가 발견되었으며, 크기가 숙주 세포에 의한 섭취 메커니즘에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 존재합니다. 그러나, 이 지역에 있는 연구는 이질적으로 크기의 OMV를 효율적으로 분리하는 어려움에 의해 제한됩니다. 밀도 그라데이션 원심분리(DGC)는 전통적으로 이러한 목적을 위해 사용되어 왔습니다. 그러나 이 기술은 시간이 많이 걸리고 확장하기가 어렵습니다. 반면 에 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 덜 번거롭고 OMV의 치료 사용을 위해 필요한 미래 확장에 빌려준다. 여기서는 150nm 미만에서 350nm 이상까지 직경범위의 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 테스트 케이스, OmV를 사용하여 이질적으로 크기의 소포를 재현 할 수있는 분리를 가능하게하는 SEC 접근 방식을 설명합니다. 동적 조명 산란(DLS)으로 검증된 "대형"(350nm) OMV 및 "스몰"(<150 nm) OMV의 분리를 시연합니다. 사용 편의성, 재현성(사용자 간 포함) 및 확장 가능성으로 인해 DGC 기반 기법을 통해 이질적으로 크기의 소포를 분리하는 것이 좋습니다.

서문

그람 음성 박테리아는 성장을 통해 그들의 외부 막, 소위 외부 막 소포 (OMV)에서 파생 된 소포를 방출합니다. 이러한 OmV는 DNA/RNA, 단백질, 지질 및 펩티도글리칸^1,2를포함한 다수의 중요한 생체 분자를 운반함으로써 박테리아와 숙주 뿐만 아니라 세균 세포 간 세포 간 통신에서 중요한 역할을 한다. 특히, 세균발생에 있는 OMV의 역할은 특정 독성 인자 및독소^{3,4,5,6,7,8,9,10,11에}있는 그들의 풍부하게 때문에 광범위하게 연구되고^있다.

OMV는 부모 박테리아와 성장 단계에 따라 20~450nm의 크기로 보고되었으며, 여러 종류의 박테리아가 이질적으로 크기의 OMV^{8,12,13,14를}방출하며, 이는 또한 숙주 세포^{항목(12)의}단백질 조성 및 메커니즘과 차이가 있다. H. 파일로리는 직경 이 20~450nm에 이르는 OMV를 출시했으며, 더 작은 OmV는 더 큰 OmV보다 더 균일한 단백질 성분을 함유하고 있습니다. 중요한 것은, OMV의 두 집단은 상이한^{메커니즘(12)을}통해 숙주 세포에 의해 내면화되는 것으로 관찰되었다. 또한, 아그레가티박터 액티노미세템코미티안은 소형(<150nm) OMV의 인구와 함께 대형(>350 nm) OMV의 인구를 방출하고, 옴카는 상당한 양의 분비 단백질 독소, 류코톡신(LtxA)^15를함유하고 있음을 입증했다. 세포 프로세스에서 OMV 이질성의 역할은 분명히 중요하지만, 소포의 뚜렷한 인구를 분리하고 분석하는 기술적 어려움은 이러한 연구를 제한했습니다.

세균성 병인증의 중요성 외에도, OMV는 백신 및 약물 전달^{차량(16,17, 18,19,20)을}포함한 다수의 생명공학 적 응용 분야에서 사용하기 위해 제안되었습니다. 이러한 접근 방식에서 번역을 사용하려면 소포의 깨끗하고 단분산 된 준비가 필요합니다. 따라서 효과적이고 효율적인 분리 방법이 필요합니다.

가장 일반적으로, 밀도 그라데이션 원심분리(DGC)는 이질적으로 크기의 소포 집단을 기색 및 분비^{단백질(21)을}포함한 세포 이물질로부터 분리하는 데 사용된다. 이 방법은 또한 이질적으로 크기의 OMV하위^{집단(12,13,14)을}분리하는 접근법으로 보고되었다. 그러나 DGC는 시간이 많이 걸리고 비효율적이며 매우 가변적인 사용자 대^{사용자(22)이므로} 확장에 적합하지 않습니다. 대조적으로,크기 배제 크로마토그래피(SEC)는 OMV^21,23,24를정화하는 확장가능하고 효율적이며 일관된 접근 방식을 나타낸다. 우리는 긴 (50cm), 중력 흐름, SEC 열, 젤 여과 매체로 채워진 효율적으로 정화하고 OMV의 하위 집단을 분리하기에 충분하다는 것을 발견했습니다. 특히, 우리는 A. actinomycetemcomitans OMV를 "큰" 및 "작은" 하위 인구로 분리하고 단백질과 DNA 오염을 제거하기 위하여 이 접근법을 이용했습니다. 정화는 4시간 미만으로 완료되었고, OMV 하위 인구의 완전한 분리와 이물질의 제거가 이루어졌습니다.

프로토콜

1. 버퍼 준비

1. ELISA 세척 버퍼를 준비하려면 3.94g 트라이스 베이스, 8.77 g NaCl, 1 g 소 세럼 알부민(BSA)을 1L의 디온화(DI) 물에 넣습니다. 500 μL 폴리소르바테-20을 추가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
2. 블로킹 버퍼를 준비하려면 트라이베이스 3.94g, NaCl 8.77g, BSA 10g을 추가합니다. 500 μL 폴리소르바테-20 ~1L의 DI 물을 추가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
3. 용출 버퍼 (PBS)를 준비하려면, 8.01 g NaCl, 2.7 g KCl, 1.42 g Na₂HPO₄및 0.24 g KH₂PO₄ ~ 1 L DI 물을 추가하십시오. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
   참고: 이 버퍼의 10배 용액을 필요에 따라 DI 물로 만들고 희석할 수 있습니다.

2. OMV 샘플 준비

1. A. actinomycetemcomitans 세포를 후기 기하급수적 단계로 성장시다(0.7의 600nm에서 광학 밀도). 10 분 동안 4 °C에서 10,000 x g에서 두 번 원심 분리하여 세포를 펠렛. 0.45 μm 필터를 통해 상체를 필터링합니다.
2. 50 kDa-분자량 컷오프 필터를 사용하여 박테리아가 없는 상체를 농축합니다. 4°C에서 105,000 x g의 농축 용액을 30분 동안 초원심분리기.
3. PBS 및 초원심분리기에서 펠릿을 다시 일시 중지합니다(30분 동안 4°C에서 105,000 x g). PBS의 2 mL에서 펠릿을 다시 중단합니다.

3. S-1000 열 포장

1. 젤 여과 매체의 스톡 병을 유리 교반 봉과 섞어 컬럼을 채우는 데 필요한 부피와 약 50% 초과(약 135mL)를 유리 병에 붓습니다. 이 구슬이 정착될 때까지 앉게 한 다음 여분의 액체를 제거합니다. 용출 버퍼에서 구슬을 다시 중단하여 최종 용액이 약 70 %(부피별) 젤, 30 % 버퍼되도록합니다. 진공 상태에서 용액을 탈가스로 탈가스합니다.
2. 링 스탠드를 사용하여 유리 기둥을 수직으로 마운트하고 용출 버퍼로 채워 기둥의 벽을 적시다. 열에 약 1cm의 버퍼만 남을 때까지 버퍼를 빼내십시오.
3. 거품을 만들지 않고 조심스럽게 열에 구슬을 피펫하여 열을 맨 위로 채웁니다. 이 프로세스 전반에 걸쳐 초과 버퍼를 계속 배출합니다. 컬럼 상단에 구슬을 추가하기 전에 구슬이 완전히 정착하지 않도록 하십시오. 기둥은 기둥 저장소 의 아래 약 2cm 높이로 포장되어야 합니다.

4. 시료를 적재하고 분수를 수집

1. 용출 버퍼를 진공 상태에서 탈가스로 방출합니다. 용출 버퍼의 두 개의 열 볼륨 (180 mL)으로 열을 세척합니다.
2. 나머지 버퍼가 열을 완전히 입력하도록 허용합니다. 버퍼가 젤 층의 상단에 도달하면, 신중하게 오마이비가 포함 되는 2 mL 샘플 (약 100 - 200 nmol/L의 지질 농도에서) 구슬의 표면에, 열의 상단에 있는 구슬중 어느 구슬을 방해 하지 않도록 주의. 샘플이 젤층 위에 액체가 남아 있지 않을 때, 즉 젤에 완전히 입력되도록 합니다.
3. 젤 컬럼 위에 용출 버퍼를 신중하게 천천히 추가합니다. 이 샘플 희석을 일으킬 것입니다으로, 젤의 상단 층을 방해하지 마십시오.
4. 기둥 아래에 50mL 튜브 를 하나 배치하고 열을 엽니다. 용출의 처음 20mL를 수집합니다. 열이 건조하지 않도록 필요에 따라 열 상단에 용해 버퍼를 추가합니다.
5. 열 아래에 1.5mL 튜브를 배치합니다. 컬럼을 시작하고 각 튜브에서 일련의 1mL 샘플을 수집합니다. 샘플이 수집될 때 필요에 따라 열 상단에 용출 버퍼를 계속 추가합니다. 96개의 분수가 수집될 때까지 반복합니다. 열을 중지합니다.
   참고: 샘플은 장기 저장을 위해 -20°C 또는 추가 분석전까지 단기 저장을 위해 4°C로 저장되어야 합니다.
6. 열을 정리하려면 열을 통해 0.1 M NaOH의 하나의 열 볼륨(90 mL)을 실행합니다. 열을 통해 용출 버퍼의 두 개의 열 볼륨(180mL)을 실행합니다.

5. 샘플 분석

1. 각 분획에서 지질 농도를 측정하기 위해 각 분획의 파이펫 50 μL을 96웰 플레이트의 단일 웰로 넣습니다. 각 우물에, 지방 성 염료의 2.5 μL을 추가합니다. 15s에 대한 인큐베이션. 515 nm의 난회 파장과 640 nm의 방출 파장을 사용하여 플레이트 판독기의 형광 강도를 측정합니다. 각 샘플의 모든 지질의 분획을 계산하려면 모든 방출 강도를 합산하고 각 개별 강도를 총으로 나눕니다.
2. 특정 단백질의 농도를 측정하기 위해 각 분획의 파이펫 100 μL을 ELISA 면역 플레이트의 단일 웰로 배피합니다. 3 시간 동안 25 °C에서 배양하십시오.
   1. 샘플을 데산합니다. 각 웰과 데낸에 200 μL의 ELISA 세척 버퍼를 추가합니다. 총 5개의 세시즈를 위해 네 번 반복합니다.
   2. 각 우물에 200 μL의 블로킹 버퍼를 추가하고 25 °C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 데반트.
   3. 100 μL 차단 버퍼플러스 1차 항체(정제항체의 경우 1:10,000, 정제되지 않은 항체의 경우 1:10)를 4°C에서 하룻밤 사이에 배양한다. 데반트.
   4. 각 웰과 데낸에 200 μL의 ELISA 세척 버퍼를 추가합니다. 총 5개의 세시즈를 위해 네 번 반복합니다.
   5. ELISA 세척 버퍼 100 μL과 이차 항체(1:30,000)를 각 웰에 추가합니다. 25°C에서 1h의 인큐베이션을 사용할 수 있습니다.
   6. 각 웰과 데낸에 200 μL의 ELISA 세척 버퍼를 추가합니다. 총 5개의 세시즈를 위해 네 번 반복합니다.
   7. 3,3',5'-테트라메틸벤지딘(TMB)의 100μL을 추가하고 15-30분 동안 또는 파란색이 발달할 때까지 인큐베이션을 제공합니다. 정지 용액의 50 μL로 TMB 반응을 중지합니다.
   8. 플레이트 판독기에서 450 nm의 파장에서 각 우물의 흡광도를 읽으십시오.
3. 총 단백질 농도를 측정하려면 UV-vis 분광광계를 사용하여 각 분획의_{280nm(A 280)의}파장에서 흡광도를 기록합니다.

프로토콜의 회로도는 그림 1에표시됩니다.

그림 1: SEC 절차의 회로도. 기둥은 거품과 불연속을 피하기 위해 조심스럽게 탈가스 젤 여과 매체로 포장된 다음 두 개의 열 볼륨의 용출 버퍼로 세척됩니다. 다음으로, 샘플은 젤 포장을 방해하지 않고 젤 의 상단에 조심스럽게 파이프를 넣습니다. 컬럼이 열리고 샘플이 젤에 완전히 들어갈 때까지 실행됩니다. 이 시점에서 버퍼는 열 의 상단에 배치되고 용출의 첫 번째 20 mL이 수집됩니다. 다음으로 일련의 1mL 분획이 수집됩니다. 이러한 분획은 지질 및 단백질 함량분석을 위해 96웰 플레이트 또는 96웰 면역 플레이트에 배치됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

결과

그림 2에서는 이 메서드의 대표적인 결과를 보여 주어 있습니다. A. actinomycetemcomitans 균주 JP2에 의해 생성된 OMV는 초원심분리기를 사용하여 문화 상류체로부터 먼저 정제되었다^15. 우리는 이전에이 균주가 약 300 nm의 직경과 약 100 nm^15의직경을 가진 하나, OMV의 두 인구를 생산하는 것을 발견했다. 이러한 OMV 인구를 분리하기 위해 위에?...

토론

여기에서, 우리는 세균성 OMV 하위 인구의 간단하고 빠르며 재현 가능한 분리를 위한 프로토콜을 제공했습니다. 이 기술은 비교적 직선적이지만 열에서 효율적인 분리가 발생하는지 확인하기 위해 매우 신중하게 수행해야 하는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 기포를 피하기 위해 젤을 조심스럽게 천천히 컬럼에 적재하는 것이 필수적입니다. 우리는 열을적재하기 전에 몇 시간 동안 실온에서 젤을...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028
Amicon 50 kDa filters	Millipore Sigma	UFC905024
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9704-100
ELISA Immuno Plates	Thermo Scientific	442404
FM 4-64	Thermo Scientific	T13320	1.5 x 50 cm
Glass Econo-Column	BioRad	7371552
Infinite 200 Pro Plate Reader	Tecan
Potassium Chloride (KCl)	Amresco (VWR)	0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)	Amresco (VWR)	0781-500G
Sephacryl S-1000 Superfine	GE Healthcare	17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Chemical	S271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Amresco (VWR)	0404-500G
Tris Base	VWR	0497-1KG
Tween(R) 20	Acros Organics	23336-2500