크기 배제 크로마토그래피는 세균 외부 막 소포 이질성을 분석

요약

세균성 소포는 병인에 중요한 역할을 하고 유망한 생명 공학 응용 프로그램이 있습니다. 소포의 이질성은 분석과 사용을 복잡하게 합니다. 따라서 다양한 크기의 소포를 분리하는 간단하고 재현 가능한 방법이 필요합니다. 여기에서, 우리는 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 이기종 소포를 분리하기 위하여 크기 배제 크로마토그래피의 사용을 보여줍니다.

초록

그람 음성 박테리아의 세포벽은 얇은 펩티도글리칸 층으로 분리된 내부(세포질) 및 외부 막(OM)으로 구성됩니다. 성장을 통해 외부 멤브레인은 구형 외부 막 소포 (OMV)를 형성하기 위해 출혈 할 수 있습니다. 이러한 OmV는 호스트 세포에 화물 전달 및 세균 세포와의 통신을 포함한 수많은 세포 기능에 관여합니다. 최근, OMV의 치료 잠재력은 백신 및 약물 전달 차량으로 의 사용을 포함하여 탐구되기 시작했습니다. OMV는 OM에서 파생되지만 OMV의 지질 및 단백질 화물은 OM과 크게 다르다는 것을 오랫동안 인식해 왔습니다. 최근에는 박테리아가 여러 유형의 OMV를 방출할 수 있다는 증거가 발견되었으며, 크기가 숙주 세포에 의한 섭취 메커니즘에 영향을 미칠 수 있다는 증거가 존재합니다. 그러나, 이 지역에 있는 연구는 이질적으로 크기의 OMV를 효율적으로 분리하는 어려움에 의해 제한됩니다. 밀도 그라데이션 원심분리(DGC)는 전통적으로 이러한 목적을 위해 사용되어 왔습니다. 그러나 이 기술은 시간이 많이 걸리고 확장하기가 어렵습니다. 반면 에 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)는 덜 번거롭고 OMV의 치료 사용을 위해 필요한 미래 확장에 빌려준다. 여기서는 150nm 미만에서 350nm 이상까지 직경범위의 Aggregatibacter actinomycetemcomitans에의해 생성된 테스트 케이스, OmV를 사용하여 이질적으로 크기의 소포를 재현 할 수있는 분리를 가능하게하는 SEC 접근 방식을 설명합니다. 동적 조명 산란(DLS)으로 검증된 "대형"(350nm) OMV 및 "스몰"(<150 nm) OMV의 분리를 시연합니다. 사용 편의성, 재현성(사용자 간 포함) 및 확장 가능성으로 인해 DGC 기반 기법을 통해 이질적으로 크기의 소포를 분리하는 것이 좋습니다.

서문

그람 음성 박테리아는 성장을 통해 그들의 외부 막, 소위 외부 막 소포 (OMV)에서 파생 된 소포를 방출합니다. 이러한 OmV는 DNA/RNA, 단백질, 지질 및 펩티도글리칸^1,2를포함한 다수의 중요한 생체 분자를 운반함으로써 박테리아와 숙주 뿐만 아니라 세균 세포 간 세포 간 통신에서 중요한 역할을 한다. 특히, 세균발생에 있는 OMV의 역할은 특정 독성 인자 및독소^{3,4,5,6,7,8,9,10,11에}있는 그들의 풍부하게 때문에 광범위하게 연구되고^있다.

OMV는 부모 박테리아와 성장 단계에 따라 20~....

프로토콜

1. 버퍼 준비

1. ELISA 세척 버퍼를 준비하려면 3.94g 트라이스 베이스, 8.77 g NaCl, 1 g 소 세럼 알부민(BSA)을 1L의 디온화(DI) 물에 넣습니다. 500 μL 폴리소르바테-20을 추가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
2. 블로킹 버퍼를 준비하려면 트라이베이스 3.94g, NaCl 8.77g, BSA 10g을 추가합니다. 500 μL 폴리소르바테-20 ~1L의 DI 물을 추가합니다. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.2로 조정합니다.
3. 용출 버퍼 (PBS)를 준비하려면, 8.01 g NaCl, 2.7 g KCl, 1.42 g Na₂HPO₄및 0.24 g KH₂PO₄ ~ 1 L DI 물을 추가하십시오. HCl 또는 NaOH를 사용하여 pH를 7.4로 조정합니다.
   참고: 이 버퍼의 10배 용액을 필요에 따라 DI 물로 만들고 희석할 수 있습니다.

2. OMV 샘플 준비

1. A. actinomycetemcomitans 세포를 후기 기하급수적 단계로 성장시다(0.7의 600nm에서 광학 밀도). 10 분 동안 4....

결과

그림 2에서는 이 메서드의 대표적인 결과를 보여 주어 있습니다. A. actinomycetemcomitans 균주 JP2에 의해 생성된 OMV는 초원심분리기를 사용하여 문화 상류체로부터 먼저 정제되었다^15. 우리는 이전에이 균주가 약 300 nm의 직경과 약 100 nm^15의직경을 가진 하나, OMV의 두 인구를 생산하는 것을 발견했다. 이러한 OMV 인구를 분리하기 위해 위에?.......

토론

여기에서, 우리는 세균성 OMV 하위 인구의 간단하고 빠르며 재현 가능한 분리를 위한 프로토콜을 제공했습니다. 이 기술은 비교적 직선적이지만 열에서 효율적인 분리가 발생하는지 확인하기 위해 매우 신중하게 수행해야 하는 몇 가지 단계가 있습니다. 첫째, 기포를 피하기 위해 젤을 조심스럽게 천천히 컬럼에 적재하는 것이 필수적입니다. 우리는 열을적재하기 전에 몇 시간 동안 실온에서 젤을.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
1-Step Ultra TMB-ELISA	Thermo Scientific	34028
Amicon 50 kDa filters	Millipore Sigma	UFC905024
Bovine Serum Albumin (BSA)	Fisher Scientific	BP9704-100
ELISA Immuno Plates	Thermo Scientific	442404
FM 4-64	Thermo Scientific	T13320	1.5 x 50 cm
Glass Econo-Column	BioRad	7371552
Infinite 200 Pro Plate Reader	Tecan
Potassium Chloride (KCl)	Amresco (VWR)	0395-500G
Potassium Phosphate Monobasic Anhydrous (KH2PO4)	Amresco (VWR)	0781-500G
Sephacryl S-1000 Superfine	GE Healthcare	17-0476-01
Sodium Chloride (NaCl)	Fisher Chemical	S271-3
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Na2HPO4)	Amresco (VWR)	0404-500G
Tris Base	VWR	0497-1KG
Tween(R) 20	Acros Organics	23336-2500