הערכה פונקציונלית של מחסום צומת הדוק מעיים וחדירות יון ברקמה המקומית על ידי טכניקת הקאמרית של ברית המועצות

Summary

אפיתל מעיים מעניק לא רק ספיגה תזונתיים אלא הגנה מפני חומרים מזיקים. הצומת הבין-תאי האפיתל ביותר אפיתל, כלומר, הצומת ההדוק, מווסת חדירה פרה-תאית וחדירות יונים. כאן מתואר פרוטוקול להכנת יריעות הרירית והערכה של הסלקטיביות היונית של צמתים הדוקים באמצעות טכניקת תא ברית המועצות.

Abstract

טכניקת הקאמרית של ברית המועצות הומצאה לראשונה על ידי המדען הדני הנס אוסינג בשנת 1951 כדי לחקור את ההובלה הטרנס-תאית של נתרן על פני עור צפרדע. מאז, טכניקה זו הוחלה על רקמות רבות ושונות כדי ללמוד את הפרמטרים הפיזיולוגיים של תחבורה על פני ממברנות. שיטת תא ברית המועצות עדיפה על שיטות אחרות מכיוון שניתן להשתמש ברקמה מקומית, מה שהופך אותה ליישום יותר למה שקורה ב- vivo. עם זאת, מכיוון שנעשה שימוש ברקמה מקומית, התפוקה נמוכה, הזמן מוגבל, והכנת רקמות דורשת מיומנות והכשרה. תאים אלה שימשו לחקר חלבוני טרנספורטר ספציפיים ברקמות שונות, להבין פתופיזיולוגיה של מחלות כגון סיסטיק פיברוזיס, ללמוד הובלת תרופות וספיגה, ובעיקר תרמו להבנת התחבורה התזונתית במעי. בהתחשב בכל תהליך ההובלה האפיתל של רקמה, לא רק מסלולים transepithelial, אלא גם מסלולים paracellular חשובים. צמתים הדוקים הם דטרמיננט מרכזי של חדירות פרה-תאית ספציפית לרקמה על פני המעי. במאמר זה, טכניקת תא ברית המועצות תשמש להערכת permselectivity paracellular של יונים על ידי מדידת מוליכות transepithelial ופוטנציאל דילול.

Introduction

שיטת ברית המועצות פותחה לראשונה על ידי המדען הדני הנס Ussing. ברית המועצות השתמשה בו לראשונה כדי למדוד את זרם המעגל הקצר של הובלת נתרן על פני עור צפרדע לאחר שנצפה כי NaCl יכול להיות מועבר על פני העור נגד שיפוע ריכוז ^תלול1. המערכת שלו כללה את עור הצפרדע שהורכב בין שני תאים עם גישה לשני צדי העור. כל תא הכיל את הפתרון של רינגר שהופץ ואוורר. שני גשרי אגר צלצול צרים הממוקמים ליד העור ומחוברים לאלקטרודות KCl-calomel רוויות מדדו את ההבדל הפוטנציאלי כפי שנקרא על ידי potentiator. זוג שני של גשרי אגר צלצול היו ממוקמים בקצה הנגדי של כל תא מחובר כוסות עם KCl רווי עם AgCl רווי עם AgCl ליישם כוח אלקטרומוטיב המסופק על ידי סוללה. חוצץ פוטנציאלי שימש כדי להתאים את המתח כך ההבדל הפוטנציאלי על פני העור נשאר אפס, ובכך ליצור תנאי קצר. מד מיקרואמפר חובר גם כדי לקרוא את הזרם העובר דרך העור (ראה את הדמות ב ref.1 לעיצוב החדר המקורי).

במהלך 70 השנים האחרונות, טכניקה זו הוחלה על רקמות רבות ושונות, במיוחד רקמת מעיים, כדי ללמוד תחבורה תזונתית ויונים. לדוגמה, המנגנון של שלשולים הנגרמים כולרה נחקר על ידי הרכבה איילום ארנב בתאים אלה, ונמצא כי שלשולים הנגרמים על ידי כולרה רעלן מתווך על ידי ^cAMP2. בנוסף, תאים אלה שימשו גם כדי ללמוד את המנגנון שבבסיס הובלת גלוקוז באמצעות Na ⁺-גלוקוז cotransporter 1 (SGLT1)³. המעבדה שלנו מתמקדת בהובלה תאית ופראלילית בתאי אפיתל מעיים. באמצעות שיטת תא ברית המועצות, הובלת פפטיד הוערך בעכברים נוקאאוט קלודין 15, אשר פגעו בהובלת נתרן paracellular, באמצעות תאי ברית המועצות כדי למדוד את ספיגת דיפסטיד גליצילסרקוסין שאינו הידרוליזה. נמצא כי הומאוסטזיס Luminal Na⁺ חשוב להובלת פפטידים בזוג ^{פרוטונים4}. בנוסף, תאים אלה שימשו גם כדי לחקור הפרשת אניון ב cecum מורין בתגובה להפעלה תתmucosal של קולטן פעיל proteinase 1 על ידי סרין פרוטאז ^{טריפסין5}.

תאי ברית המועצות שימשו גם לאחרונה להערכת המסלולים הפארא-תאיים ברקמת האפיתל. מסלולים Paracellular מוסדר על ידי צמתים הדוקים, שהם קומפלקסים של חלבונים הנוצרים בנקודה שבה שני תאים או יותר ^{נפגשים6}. פונקציית המחסום וסלקטיביות היונים (בין אם אניונים או ציטוטים מסוגלים באופן סלקטיבי לעבור דרך הצומת ההדוק) נקבעת על ידי נוכחות של חלבונים ממשפחת קלודין; חלקם משמשים מחסומים (קלודין 3 ו -7), נקבוביות אניון (קלודין 10a), או נקבוביות קטיון (קלודין 2, 10b, ו 15)⁷. שיטות אחרות שימשו כדי להעריך את המסלול paracellular, כגון gavage אוראלי של FITC מלווה ריכוז FITC פלזמת ^דם8, או EDTA-Cr9; עם זאת, טכניקות אלה הן ברזולוציה נמוכה יותר ואינן יכולות להעריך סלקטיביות יונים או קטע מסוים של החלקים של מערכת העיכול. עם זאת, ניתן להשתמש בתאי ברית המועצות כדי להעריך את פוטנציאל הדילול של יוני המטרה, ולכן לקבוע את הסלקטיביות היונית של הצמתים ההדוקים. לדוגמה, עם NaCl, הסלקטיביות של הצמתים ההדוקים עבור Na ⁺ ו^{- Cl -} ניתן לחשב על ידי דילול צד אחד של הממברנה (בדרך כלל הצד הרירי) ומדידת השינוי בהבדל הפוטנציאלי הטרנס-אפיטלי. ניתן להעריך את החדירות היחסית של Na⁺ ו^{- Cl-} על ידי משוואת גולדמן-הודג'קין-כץ10 ואת הסלקטיביות של הצומת ההדוקה ניתן להעריך באמצעות משוואת קימישוקה-קוקטסו11. תאים אלה, אם כן, יש את היתרון של מדידת הפרמטרים האלקטרופיזיולוגיים של הרקמה וכתוצאה מכך לספק מידע רב יותר על המעבר של יונים דרך צמתים הדוקים מאשר שיטות ברזולוציה נמוכה יותר אחרות.

שיטת תא ברית המועצות אינה מוגבלת רק למערכת העיכול, אם כי היא נמצאת בשימוש נרחב במחקרים הנוגעים למעי, יש לה גם יישומים רבים אחרים. לדוגמה, תאים אלה שימשו כדי ללמוד סיסטיק פיברוזיס, ובמיוחד את ערוץ כלוריד סיסטיק פיברוזיס טרנסממברן רגולטור מוליכות (CFTR)¹². סיסטיק פיברוזיס נגרמת על ידי מוטציה ב- ^CFTR13, אשר גורמת הפרשת כלוריד לקויה והובלת נוזלים על ידי תאי אפיתל נשימתיים, וכתוצאה מכך עבה יותר, ריריות יבשות ^{יותר 14}. מחקר של CFTR אפיתל דרכי הנשימה בוצע עם תאים אלה לא רק כדי להבין את המחלה, אבל כדי לגלות דרכים לטפל במחלה. לדוגמה, בחולים עם מוטציות נדירות הגורמות לסיסטיק פיברוזיס, ניתוח של תאי אפיתל נשימתיים של המטופל שימש לבדיקת טיפולים כגון Orkambi וטיפול משותף ^מגבר15.

חדרי ברית המועצות שימשו גם לחקר מסלולים של אספקת תרופות, כגון עם רקמת ביופסיה אנושית לחקר ספיגת תרופות ופרמקוקינטיקה16. ספיגת מעיים היא לא המסלול היחיד של אספקת סמים. תאים אלה שימשו גם לחקר מערכות אספקת תרופות ^לאף17. מחקרי משלוחי סמים עם חדרי ברית המועצות בוצעו גם עבור העין. בקרנית הארנב, חדירות ומחקרי ספיגה נערכו עם Labrasol, תרופה שנועדה להגביר את ספיגת התרופות על פני ^רקמות18. מחקר אחר בחן את ההשפעה של בנזילקוניום כלוריד על משלוח סמים טרנסקלרליים בסקלרה ^ארנבת19.

שיטת תא ברית המועצות שימושית מכיוון שניתן להשתמש ברקמה מקומית. ככזה, הוא עדיף על מודלים במבחנה כגון קווי תא Caco-2. עם זאת, הטכניקה דורשת מיומנות וזמן להכין דגימות, ולכן זה לא מתאים ליישומי תפוקה גבוהה. התכונות האלקטרופיזיולוגיות של monolayers התא ניתן ללמוד באמצעות תוספות תרבית התא בתאים אלה. תגליות אחרונות אפשרו את התרבות של organoids שהם מיני איברים הגדלים בתרבות מקציר של תאי גזע אפיתל או ^{אנדותל20}. תרבות האורגנויד ניתן לתמרן כדי לגדול ב monolayer, ובכך לאפשר להרכיב organoids בתא ברית ^{המועצות21}. אורגנוידים של רקמות אפיתל ואנדותל שונים ניתן לחקור, הפחתת מספר בעלי החיים הנדרשים, כמו תרבות organoid ניתן לשמור לטווח ארוך. זה גם יגדיל את התפוקה מאז זמן רב וחיתוך רקמות מייגע וצעדי הכנה לא יהיה צורך. בעתיד, לימודי חדר ברית המועצות ימשיכו להיות שימושיים מאוד לחקר הובלת רקמות והם יהיו חשובים במיוחד בתחום הרפואה המותאמת אישית.

הפרוטוקול הבא מדגים את היישום של שיטת תא ברית המועצות כדי להעריך את הסלקטיביות ואת תפקוד המחסום של הצמתים ההדוקים במעי הדק של קלודין 15 נוקאאוט (Cldn15^-/-) עכברים וסוג פראי (WT) פקדים על ידי מדידת פוטנציאל הדילול של NaCl. צמתים הדוקים (TJ) נוצרים בנקודה שבה שני תאים או יותר נפגשים באפיתל ורקמת אנדותל. צמתים הדוקים Bicellular (bTJ), במיוחד חלבוני משפחת קלודין שנמצאו בתוך bTJ, נחשבים כדי לקבוע את תפקוד המחסום ואת הסלקטיביות של ^TJ7. Cldn15^-/- עכברים יש מגה מעי ^דק22 ויכולת ספיגת חומרים מזינים מופחתת עקב אובדן מיחזור Na ⁺ מעיים המתרחשת באמצעות קלודין 154,23,24. Cldn15^-/- עכברים יש לקוי Na ⁺ הומאוסטזיס, מה שהופך אותם מודל מעניין לחקר הסלקטיביות של TJ. הפרוטוקול הבא מעריך את החדירות של TJ ל- NaCl על ידי מדידת פוטנציאל הדילול של NaCl (_PNa / _PCl) במעי הדק האמצעי. בקצרה, השינוי בהבדל הפוטנציאלי של הממברנה המתרחש על ידי דילול צד אחד של הממברנה (צד M או צד S, שניהם נמדדים בפרוטוקול שלהלן) ניתן להשתמש כדי לחשב את החדירות של Na ⁺ (_PNa) ו- Cl^- (_PCl), ואת פוטנציאל הדילול (_PNa / _PCl) יראה אם הצומת הדוק יש סלקטיביות קטנונית או אניונית.

הניסויים בפרוטוקול זה נערכו באמצעות תא ברית המועצות מותאם אישית (איור 1A), המורכב משני חצאים, ביניהם ההכנה במעיים מותקנת אנכית, מגבר מהדק מתח, מקליט חשמלי, אלקטרודות, גשרי מלח, הפתרון של רינגר, חיץ HEPES (150 מ"מ NaCl), חיץ HEPES מדולל (75 מ"מ NaCl), הכנה מעיים (לפרטים על ציוד ראו טבלת החומרים).

Protocol

כל בעלי החיים המשמשים בניסויים אלה נשמרו במתקן לטיפול בבעלי חיים באוניברסיטת Shizuoka והניסויים נערכו על פי ההנחיות לחקר בעלי חיים שנקבעו על ידי אוניברסיטת Shizuoka. כל הניסויים בוצעו באישור הוועדה לטיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטת שיזוקה (היתרים #205272 ו #656-2303).

1. הכנת אלקטרודות NaCl

הערה: האלקטרודות המשמשות בניסויים אלה מורכבות מ- NaCl מרוכז או KCl. האלקטרודות KCl/calomel נרכשות באופן מסחרי. לפני תחילת הניסוי, ודאו שכל האלקטרודות מלאות למעלה בפתרון מרוכז של NaCl או KCl.

1. הכינו צנצנות זכוכית קטנות עם מכסי פלסטיק (נפח 20 מ"ל).
2. לקדוח שני חורים במכסי הפלסטיק, אחד לגשר המלח NaCl (קוטר 2.5 מ"מ), והשני לחוט כסף (קוטר 1 מ"מ; איור 1C, אלקטרודה NaCl).
3. ממלאים את צנצנת הזכוכית בתמיסת NaCl רוויה (כ-15 מ"ל, עד למילוי).
4. הכנס חוט כסף (קוטר 0.8 מ"מ, באורך 7 ס"מ) לצנצנת, אך ודא שניתן לחבר את חלק החוט מחוץ לצנצנת באמצעות קליפסים תנין (בגודל קטן) למערכת המגבר.
5. כאשר לא בשימוש, לעטוף את האלקטרודות ולוודא את החורים מכוסים, עם parafilm כדי למנוע ייבוש.

2. הכנת גשרי מלח

הערה: הכינו גשרי מלח לפחות יום לפני הניסוי כדי לספק מספיק זמן להתמצק. גשרי מלח ניתן להשתמש שוב ושוב אבל להשתמש לאחר 2 חודשים אינו מומלץ.

1. גשרי מלח NaCl
   1. הכינו צינורות פוליאתיל מס' 7 (קוטר חיצוני 2.3 מ"מ, קוטר פנימי 1.3 מ"מ), מחט 19 גרם ומזרק מסוג מנעול, 200 מ"ל של פתרון NaCl 1 M, 2 גרם אגר, מיכל פלסטיק לאטום לאחסון גשר מלח.
   2. הכן מספר מתאים של גשרי מלח על ידי חיתוך צינורות לגודל הדרוש להקמת תא ברית המועצות (כל תא דורש שני גשרי מלח).
   3. לפני הזרקת אגר, לעשות צורת U עם הצינורות ומניחים אותם בכוס של מים חמים (כדי ליצור צורה קלה להקמת גשרי מלח).
   4. הפוך 200 מ"ל של 1 M NaCl על ידי המסת 11.688 גרם של NaCl ב 200 מ"ל במים deionized.
   5. לפצל 1 M NaCl לתוך 100 מ"ל חלקים: להפוך 100 מ"ל של 2% אגר ב 1 M NaCl (לערבב 2 גרם אגר ב NaCl, חום במיקרוגל להתמוסס).
   6. בעזרת מחט 19 גר' ומזרק נעילה, מלאו את המזרק בתמיסת 1 M NaCl/agar. בעדינות להתחיל לגרש פתרון טיפה אחר טיפה ותוך כדי כך להכניס את המחט לקצה אחד של הצינור ולמלא עד התערובת יוצאת מהצד השני.
   7. לאט למשוך את המחט תוך ביטוי הפתרון ולחזור על הפעולה עד כל גשרי המלח הנדרשים נעשו. (אם הפתרון מתמצק במזרק או במחט, לחמם אותו לזמן קצר במים חמים עד שניתן יהיה לבטא שוב את הפתרון.)
   8. בדוק גשרי מלח כדי לוודא שאין בועות ולאחסן בתמיסת 1 M NaCl הנותרת במיכל אטום.
2. גשרי מלח KCl
   הערה: צינורות דקים יותר משמשים לגשרי אגר KCl כדי למנוע את ההפרש הקבוע של ריכוז K⁺ במאגר, שכן קצות גשר המלח יכולים להתמוסס ו^{- K+} יכול לדלוף לתוך המאגר.
   1. הכן צינורות פוליאתיל #3 (קוטר חיצוני 1.0 מ"מ, קוטר פנימי 0.5 מ"מ), 23 G מחט ומזרק סוג מנעול, 200 מ"ל של פתרון KCl 1 M, 2 גרם אגר, מיכל פלסטיק לאטום לאחסון גשר מלח.
   2. הכן מספר מתאים של גשרי מלח על ידי חיתוך הצינורות לגודל הדרוש עבור תא ברית המועצות להגדיר (כל תא דורש שני גשרי מלח).
   3. הפוך 200 מ"ל של 1 M KCl על ידי המסת 14.91 גרם של KCl ב 200 מ"ל של מים deionized.
   4. מפוצלים לשתי מנות של 100 מ"ל: מייצרים 100 מ"ל של 2% אגר ב-1 M KCl (מערבבים 2 גרם אגר ב-KCl, מחממים במיקרוגל כדי להתמוסס).
   5. באמצעות מחט 23 גרם ומזרק נעילה, להזריק צינורות עם 2% אגר 1 M KCl תערובת (להבטיח כי הצינורות מלאים לחלוטין ואין בועות) באותו אופן כמו עם גשרי מלח NaCl.
   6. בדוק גשרי מלח כדי לוודא שאין בועות ולאחסן בתמיסת KCl 1 M הנותרת במיכל אטום.

3. הכנת הפתרון של רינגר וחיץ HEPES

הערה: בהתאם לרקמה המותקנת בחדר ברית המועצות, מרכיבי הפתרון של רינגר עשויים להיות שונים. המתכונים המוצגים כאן הם ספציפיים עבור המעי הדק והמעי הגס.

1. הפוך את הפתרון של רינגר לרענן ביום הניסויים כמתואר בטבלה 1.
2. בועה הפתרון עם 95% _O2/5% _CO2 כדי לספק _O2 לרקמה וקיבולת אגירה.

הפתרון של רינגר (המעי הדק)	הפתרון של רינגר (מעי גס)
NaHCO3 – 21.0 mM	NaHCO3 – 21.0 mM
K2HPO4 – 2.4 מ"ר	K2HPO4 – 2.4 מ"ר
KH2PO4 – 0.6 מ"מ	KH2PO4 – 0.6 מ"מ
NaCl – 119.0 mM	NaCl – 119.0 mM
MgCl2 – 1.2 מ"מ	MgCl2 – 1.2 מ"מ
CaCl2 – 1.2 מ"ר	CaCl2 – 1.2 מ"ר
Indomethacin – 10 מיקרומטר (הפוך 1 mM מניות ב 21 mM NaHCO3, להוסיף 10 מ"ל של מלאי עבור 1 L של הפתרון של רינגר)	Indomethacin – 10 מיקרומטר (הפוך 1 mM מניות ב 21 mM NaHCO3, להוסיף 10 מ"ל של מלאי עבור 1 L של הפתרון של רינגר)
1 מ"מ גלוטמין (0.146 גר'/ל')	10 מ"מ גלוקוז

טבלה 1: מתכון הפתרון של רינגר. כדי ליצור את הפתרון של רינגר, ערבבו את כל הרכיבים יחד עם מים לא מיוננים. הפתרון של רינגר הוא הטוב ביותר עשה טרי לפני ניסויים. שומרים במקרר או על קרח עד לשימוש. לפני השימוש, גז עם 95% _O2/5% _CO2.

3. הפוך את מאגר HEPES טרי ביום הניסוי כמתואר בטבלה 2 על ידי ערבוב מרכיבים במים לא מיוננים.
4. אין לכוונן לאמצעי האחסון הסופי של המאגר עד לאחר התאמת pH.
5. יש לחמם את מאגר HEPES ל-37°C ולהתאים את ה-pH ל-7.4 על-ידי הוספה איטית של טיפות של תמיסת 1 M Tris תוך כדי ערבוב.
6. התאימו את עצמם לעוצמת הקול הסופית על-ידי הוספת הכמות המתאימה של מים שעברו דה-יוניזציה.

חוצץ HEPES	מאגר HEPES דילול
HEPES – 10 מ"ר	HEPES – 10 מ"ר
גלוקוז – 10 מ"ר (מעי גס)	גלוקוז – 10 מ"ר (מעי גס)
1 מ"מ גלוטמין (0.146 גרם/ל') (מעי דק)	1 מ"מ גלוטמין (0.146 גרם/ל') (מעי דק)
NaCl – 150 מ"ר	NaCl – 75 mM + 150 מ"מ מניטול (להתאמה להבדלי osmolality)
MgCl2 – 1 מ"מ	MgCl2 – 1 מ"מ
CaCl2 – 2 mM	CaCl2 – 2 mM
Indomethacin – 10 מיקרומטר (הפוך 1 mM מניות ב 21 mM NaHCO3, להוסיף 10 מ"ל של מלאי עבור 1 L של הפתרון של רינגר)	Indomethacin – 10 מיקרומטר (הפוך 1 mM מניות ב 21 mM NaHCO3, להוסיף 10 מ"ל של מלאי עבור 1 L של הפתרון של רינגר)
התאימו ל-pH 7.40 (37°C) באמצעות 1 M Tris

טבלה 2: מתכון חוצץ HEPES. כדי להפוך את מאגר HEPES ואת דילול HEPES חוצץ, להמיס את כל החומרים במים דה-יונן. פתרונות חייבים להיות מותאמים pH עם פתרון 1 M Tris, אז לא להוסיף נפח מלא של מים (למשל, בעת ביצוע 1 L, להמיס את כל החומרים בכ 800 מ"ל של מים). לאחר מכן לחמם את הפתרון ל 37 °C (65 °F), להתאים את ה- pH ל 7.4 ולאחר מכן להתאים את הנפח הסופי.

4. הגדרת תא ברית המועצות

הערה: תאי ברית המועצות המשמשים בפרוטוקול זה הם תאי זלוף מתמשכים בהתאמה אישית. כדי להעריך את תפקוד מחסום המעי של העכבר או את ספיגת החומרים המזינים, מומלץ להשתמש בתאים עם פתח בקוטר 4 או 5 מ"^{מ (}איור 1A-C).

1. כדי להפחית את אפקט ^הקצה26 ולעזור לאטום את התאים, חבר/י סרט פרפין עם ניקוב של 4 או 5 מ"מ (כ-4 ס"^מ2) לפני ההגדרה (איור 1B).
2. מוגדר בתנאי מעגל פתוח למדידה פוטנציאלית של דילול. מוגדר במצב מהדק נוכחי. הגדר את הפלט כזרם והגדר את הדופק הנוכחי ל- ±20 μA.
3. בעת הגדרה בתנאי קצר למדידת זרם קצר והתנגדות transmucosal, להגדיר במצב מהדק מתח. הגדר את היציאה כמתח והגדר את פולס המתח ל- ±5 mV.
4. ודא 37 °C (50 °F) מים מסתובבים במעיל המים.
5. מלאו כל תא בתמיסה של רינגר או במאגר HEPES (הכמות תלויה במערכת שבה נעשה שימוש, התאים המשמשים כאן דורשים 5 מ"ל לכל צד) וודאו שאין דליפות.
6. חבר גשרי מלח ואלקטרודות.
7. ודא שהמתח הוא 0 ויציב, זרם דופק כדי להבטיח שגשרי מלח ואלקטרודות מוגדרים כראוי.
8. אפשר למערכת וטמפרטורת הפתרון של רינגר להשתוות למשך 20 דקות לפחות.
9. לאחר שיווי משקל, תקן את הפרש המתח האסימטרי בין אלקטרודות KCl ופצה על עמידות בנוזלים על ידי שינויו לאפס (בדוק את המדריך עבור מערכת תאי ברית המועצות המשמשת לקביעת הדרך הנכונה).

5. ניתוח של רקמת מעיים

הערה: כל הניסויים בבעלי חיים חייבים להתבצע במסגרת התקנות שנקבעו על ידי המדינה והאוניברסיטה.

1. לפני נטילת רקמת המעי, הכינו את הפתרון והבועה הטריים והקרים כקרח של Ringer עם 95% _O2 ו-5% _CO2 למשך 15 דקות (שלב 3).
2. מרדימים עכברים על פי הנחיות המסדירות את השימוש בבעלי חיים במחקר. לניסוי זה, עכברים היו מורדמים עם 2%-3% איזופלורן מנוהל על ידי מרדים. בדוק את ההרדמה הנכונה על ידי צביטת בהונות ולהבטיח שאין תגובה לכאב.
3. לעשות חתך בבטן עם מספריים מהאגן לסרעפת; לאתר את הבטן ולחתוך את הקצה פילורי של הבטן.
4. אחזה בחלק הקיבה המחובר למעי הדק עם מלקחיים ומשוך בעדינות את המעי הדק תוך חיתוך ההחזקות המזנטריות. היזהר לא לחתוך או לפגוע ברקמת המעי בכל דרך שהיא.
5. תמשיך לנתח את המעי כל הדרך לפי הטבעת. להסרה מלאה של המעי הגס, לחתוך את עצמות האגן כדי לחשוף את החלק הדיסטלי של המעי הגס ולהסיר בזהירות את שאר המעי על ידי חיתוך את ההחזקות.
6. למדוד את אורך המעי ולחלק למקטעים הרצויים. לניסוי זה, חלקו את המעי הדק לשלושה מקטעים והשתמשו בקטע האמצעי.
7. מניחים את המקטעים הרצויים לתוך קר כקרח, בועות הפתרון של רינגר; לאחר מכן, פתח כל קטע לאורך לאורך קבצים מצורפים מזנטריים. לקצץ שומן ורקמת חיבור.
8. החזר את המקטעים לפתרון של רינגר קר כקרח ושטוף ביסודיות (אפילו בתמיסה הקרה כקרח, חמצון האפיתל הזוהר חשוב כדי לשמור על תפקוד האפיתל).

6. הפשטת שכבת השריר והכנת גיליון המעי

הערה: הסרת הסרוזה (שכבת השרירים) חשובה למחקרי תחבורה באמצעות המעי. אם הסרוזה נשארת, רקמת המעי יכולה להיות כפופה להתכווצויות שרירים אקראיות שיעוותו את הנתונים האלקטרופיזיולוגיים, וההובלה עלולה להיות מעוכבת. רקמה לא מתוחה מתדרדרת במהירות כאשר היא מותקנת בתאי ברית המועצות, שכן הסרוזה היא מחסום דיפוזיה משמעותי למצע וחמצן. במקרים מיוחדים מסוימים, ייתכן שיהיה צורך לשמור על שכבת השריר, ולכן ההחלטה היא עד החוקר ואת העיצוב הניסיוני. ניתן להכין את יריעות המעיים בשתי דרכים בהתאם לשכבה שתוסר (איור 2). לניסוי זה נדרשות הכנות רירית ותת-מולקולה (איור 2, פאנל ^שני ).

1. הכינו לוחות חיתוך (קוטר 10 ס"מ) מכוסים בגומי סיליקון, סיכות (מחטי דיקור קטנות), נייר סינון מנוקב 5 מ"מ וריבועי parafilm (2 ס"מ x 2 ס"מ; ייתכן שלא יהיה צורך במערכות אחרות).
2. יוצקים את התמיסה הטרייה, הקרה כקרח והבועות של רינגר לצלחת הניתוח (מספיק כדי לכסות את הרקמה, כ-2-3 מ"ל).
3. תחת סטריאומיקרוסקופ, הצמד את הקצוות של רקמת המעי (צד הרירית כלפי מטה).
4. בעזרת מלקחיים עדינים, מנתחים בבוטות את שכבת השריר מהרירית שמתחת.
5. היזהר לא לקרוע או להכניס חורים לרקמה.
6. לאחר הסרת שכבת השריר, חותכים חתיכה גדולה מספיק לפתיחה בקוטר 5 מ"מ. בעת הכנת המעי הדק, הסרת שכבת שריר serosa צריך להיעשות בתוך 10 דקות, שכן חמצון זוהר קשה בתנאים אלה.
7. רטוב 5 מ"מ ניקוב מסנן נייר מרובע בתמיסה של רינגר ומניחים את רקמת המעי על זה עם הצד הרירית למטה, שכן הכנות תת mucosal באופן ספונטני לעטוף סביב עם הצד הרירית בחוץ.
8. ודא שהפתח מכוסה לחלוטין על ידי רקמת המעי ולא קיימים קמטים. השתמש בלוח שחור מתחת להכנה כדי לבחון אם הפתח מכוסה לחלוטין.
9. חזור על הליך זה עבור המספר הנדרש של תכשירי הרירית (בניסוי זה נדרשות שתי הכנות: הכנה אחת תשמש למדידת פוטנציאל דילול, והשנייה תשמש למדידת פרמטרים חשמליים בסיסיים).

7. תכשירי מעיים גוברים בחדרי ברית המועצות

הערה: ההגדרה תהיה תלויה בסוג של מערכת תא ברית המועצות ומערכת ההקלטה המשמשת.

1. יניקה החוצה הפתרון של רינגר / חוצץ HEPES מתא ברית המועצות.
2. נטרלו את תא ברית המועצות והניחו את נייר הסינון עם הצד הרירי של הכנת המעיים כלפי מטה על תא הצד הרירית והתאמו כך שחלון התא יתיישר עם חור נייר הסינון (איור 1A, סימון שחור סביב חלון התא שימושי ליישור ההכנות).
3. בזהירות למקם את התא בצד Serosal על תא הצד הרירית ולסגור בחוזקה אבל להיות בטוח כי גיליון המעי לא זז במהלך החיבור.
4. מלאו במהירות את שני התאים בתמיסה של רינגר או במאגר HEPES, והניחו שרביטים מבעבעים (הפתרון של רינגר: 95% _O2/5% _CO2; חיץ HEPES: 100% _O2) בקצה הנגדי של התאים, הרחק מן הממברנה (מבעבע קרוב מדי להכנה יכול להשפיע על המדידות).
5. חברו מחדש גשרי מלח ובדקו אם המתח יציב וזרם הדופק כדי לוודא שהחיבורים בסדר (איור 1C).
6. חזור על הפעולה עבור כל הכנה מעיים.
7. תן למערכת להתכווץ במשך כ 15 דקות. אם אתם משתמשים במערכת הקלטה, תנו להולכה ולהבדל הפוטנציאלי של _Isc/membrane להתייצב לפני תחילת הניסויים.

8. ניסוי פוטנציאלי בדילול (תנאי מעגל פתוח)

1. לשטוף את שני הצדדים של התא על ידי שאיבה של מאגר HEPES והוספת 5 מ"ל של חיץ HEPES טרי שחומם מראש לכל צד.
2. הפעל את מערכת ההקלטה. הגדר טווח ל- 250 mV (המערכת המשמשת כאן מגבירה את מתח היציאה פי 10), הגדר מיקומי סמן והגדר את מערכת ההקלטה למדידתה.
3. הפוך מערכות תא ברית המועצות למצב הידוק ולהתחיל למדוד. לאחר פוטנציאל הממברנה התייצב (~ 15-20 דקות), ההערכה יכולה להתחיל.
4. יניקת חיץ HEPES מהצד הרירית ולהחליף במהירות עם 5 מ"ל של דילול מחומם HEPES חוצץ המכיל 75 mM NaCl.
5. לאחר פוטנציאל הממברנה הגיע לשיאו (5-10 דקות), להסיר את מאגר הדילול מהצד "Mucosal" ולהחליף עם מאגר HEPES.
6. במידת הצורך, חזור על שלב 3 עבור הצד הסרוסאלי, הוספת מאגר HEPES דילול לצד Serosal.
7. כדי להבטיח כי הרקמה היא בת קיימא, להוסיף את מפעיל ציקלאז אדנילט Forskolin (ריכוז סופי 10 מיקרומטר) לצד Serosal.
8. ברגע שההבדל הפוטנציאלי של הממברנה הגיע לשיאו והחל לרדת, הניסוי הסתיים.

9. מדידה של מוליכות חשמלית טרנס-אפיתלאלית ו-Isc בסיסי (תנאי קצר חשמלי)

1. לשטוף את שני הצדדים של התא על ידי שאיבה של הפתרון של רינגר והוספת 5 מ"ל של פתרון צלצול בועות טרי לכל צד.
2. הפעל את מערכת ההקלטה. הגדר טווח ל- 2.5 V (המערכת המשמשת כאן מגבירה את מתח היציאה פי 10), הגדר עמדות סמן והגדר את מערכת ההקלטה למדידה.
3. הפוך מערכות תא ברית המועצות למצב הידוק ולהתחיל למדוד; לאחר _Isc ו מוליכות התייצבו (~ 15-20 דקות), מדידות בסיסיות ניתן להשיג.
4. כדי להבטיח את הרקמה היא בת קיימא, להוסיף את מפעיל ציקלאז אדנילט Forskolin (ריכוז סופי 10 μM) לצד Serosal.
5. ברגע שההבדל הפוטנציאלי של הממברנה הגיע לשיאו והחל לרדת, הניסוי נעשה.

10. ניתוח תוצאות

1. בתנאי מעגל פתוח, לחשב מוליכות transmucosal משינוי המתח בתגובה פולסים זרם על פי החוק של Ohm. קבע את זרם המעגל הקצר המקביל (_Isc) ממתח טרנסמוקוסאלי ומוליכות החל על החוק של Ohm.
2. השתמש בפוטנציאל הדילול של NaCl לחישוב הסלקטיביות היונית היחסית (_PNa/_PCl) עם משוואת גולדמן-הודג'קין-כץ10.
3. הערך את הסלקטיביות המוחלטת של הצומת ההדוקה עבור כל יון באמצעות משוואת קימישוקה-קוקטסו11.
4. חשב _PNa / _PCl באמצעות משוואת גולדמן-הודג'קין-כץ מפוטנציאל דילול, וקבע חדירות מוחלטת _PNa ו- _PCl ממשוואת קימישוקה-קוקטסו כמתואר על ידי יו ואח '¹⁰ כדלקמן:
   
   
   
   
   איפה, V: פוטנציאל דילול (mV); α: יחס פעילות. הפעילות המחושבת של NaCl במאגר HEPES חלקי הפעילות המחושבת של NaCl במאגר HEPES הדילול (עבור ניסוי זה הוא חושב כ- 1.8966); ה: קבוע מתמטי, 2.71828; GM: מוליכות טרנסמוקוסאלית (mS/^cm2); F: קבוע פאראדיי (96,485.3329 C/mol); R: קבוע גז (8.314 J / מול K); T: טמפרטורה (310.15 K)

תוצאות

התוצאות המוצגות במאמר זה הן תוצאות שהיו חלק מפרוייקט גדול יותר שהושלם (ראה ref.4,23,24).

מוליכות חשמלית Transepithelial של המעי הדק הוא ירד Cldn15^-/- עכברים.
מוליכות התמרון הבסיסית (בתנאי קצ?...

Discussion

בניסוי זה, חדרי ברית המועצות שימשו למדידת הפרמטרים החשמליים הבסיסיים ואת פוטנציאל הדילול של NaCl במעי הדק של עכברי Cldn15^{-/- ו-} WT. חשוב מאוד בעת ביצוע ניסויים בתא ברית המועצות כדי לוודא כי הכנת הממברנה המשמשת בניסויים היא בת קיימא. זה נעשה בדרך כלל על ידי הוספת גלוקוז או אדנילט ציקלאז ac...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm
#7 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm
10 mL locking syringe	Terumo	SS-10LZ	Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling
19 g needle	Terumo	NN-1938R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
23 g needle	Terumo	NN-2332R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
5 mm punch	NA	NA	Use to punch holes in filter paper and parafilm
acupuncture needles	Seirin	NS	Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate
Agar	Fujifilm Wako	010-15815
Alligator clips	NA	NA	Connects the electrode to the amplifier
CaCl2	Fujifilm Wako	038-00445
D(-)-Mannitol	Fujifilm Wako	133-00845	This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer
D(+)-Glucose	Fujifilm Wako	049-31165
Dissection kit			You will need, scissors and curved forceps
Dissection plates			We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber
DMSO	Sigma	472301-500ML	For making forskolin stock
Electrical recorder	TOA Electronics	PRR-5041	Other equivalent electrical recorders are available commercially
Epithelial voltage clamp amplifier	Nihon Kohden	CEZ9100	Other equivalent amplifiers are available commerically
filter paper, cut into squares	NA	NA	Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation
fine forceps	Fast Gene	FG-B50476	For blunt dissection of the muscle layer
Forskolin	Alomone Labs	F-500	Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM
HEPES	Sigma	H4034-1KG
Indomethacin	Sigma	I7338-5G	Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM
K2HPO4	Fujifilm Wako	164-04295
KCl	Fujifilm Wako	163-03545
KCl/calomel electrode	Asch Japan Co.	SCE-100
KH2PO4	Kanto chemical	32379-00
L(+)-Glutamine	Fujifilm Wako	074-00522
MgCl2	Fujifilm Wako	135-00165
Mixed Gas (95% O2/5% CO2)	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution
NaCl	Fujifilm Wako	191-01665
NaCl electrode	NA	NA	Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire
NaHCO3	Fujifilm Wako	191-01305
O2 Gas	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling chambers when using HEPES buffer
parafilm	Bemis	PM-996	Used to help seal Ussing chambers
pH meter	DKK-TOA Corp	HM-305	HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C
pH meter electrode	DKK-TOA Corp	GST-5311C
silicone rubber	Shinetsu Chemical	KE-12	Used to fill dissection plates
silver wire			Used for making NaCl electrodes
Small jars w/ plastic lids	NA	NA	Use for NaCl electrodes
stereomicroscope	Zeiss	Stemi 305	A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily
Tris (Trizma base)	Sigma	T1503-1KG	Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers
Ussing chambers	Sanki Kagaku Kougei		These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm
Water pump and heating system	Tokyo Rikakikai Co. Ltd.	NTT-110