Doğal Dokuda İntestinal Sıkı Bileşke Bariyeri ve İyon Geçirgenliğinin Ussing Oda Tekniği ile Fonksiyonel Olarak Değerlendirilmesi

Özet

Bağırsak epiteli sadece besin emilimini değil, aynı zamanda zararlı maddelere karşı koruma sağlar. Apikal-en epitelyal hücreler arası bileşke, yani sıkı bileşke, parasellüler çözünen ve iyon geçirgenliğini düzenler. Burada, mukozal tabakaların hazırlanması ve Ussing oda tekniği kullanılarak sıkı bağlantıların iyon seçiciliğinin değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

Ussing oda tekniği ilk olarak 1951 yılında Danimarkalı bilim adamı Hans Ussing tarafından sodyumun kurbağa derisi boyunca hücre ötesi taşınmasını incelemek için icat edildi. O zamandan beri, bu teknik, membranlar arasında taşımanın fizyolojik parametrelerini incelemek için birçok farklı dokuya uygulanmıştır. Ussing odası yöntemi diğer yöntemlere göre tercih edilir, çünkü doğal doku kullanılabilir, bu da onu in vivo olanlara daha uygulanabilir hale getirir. Bununla birlikte, doğal doku kullanıldığından, verim düşüktür, zaman sınırlıdır ve doku hazırlığı beceri ve eğitim gerektirir. Bu odalar, çeşitli dokulardaki spesifik taşıyıcı proteinleri incelemek, Kistik Fibrozis gibi hastalık patofizyolojisini anlamak, ilaç taşınmasını ve alımını incelemek ve özellikle bağırsakta besin taşınmasının anlaşılmasına katkıda bulunmak için kullanılmıştır. Bir dokunun tüm epitel taşıma süreci göz önüne alındığında, sadece transepitelyal yollar değil, aynı zamanda parasellüler yollar da önemlidir. Sıkı kavşaklar, bağırsak boyunca dokuya özgü parasellüler geçirgenliğin önemli bir belirleyicisidir. Bu makalede, transepitelyal iletkenlik ve seyreltme potansiyellerini ölçerek iyonların parasellüler geçirgenliğini değerlendirmek için Ussing odası tekniği kullanılacaktır.

Giriş

Ussing odası yöntemi ilk olarak Danimarkalı bilim adamı Hans Ussing tarafından geliştirilmiştir. Ussing, NaCl'nin dik bir konsantrasyon gradyanına karşı cilt boyunca taşınabileceği gözlemlendikten sonra kurbağa derisi boyunca sodyum taşınmasının kısa devre akımını ölçmek için ilk kez ^kullandı1. Sistemi, cildin her iki tarafına erişimi olan iki oda arasına monte edilmiş kurbağa derisinden oluşuyordu. Her oda, dolaşıma sokulan ve havalandırılan Ringer çözeltisini içeriyordu. Cildin yakınında bulunan ve doymuş KCl-calomel elektrotlarına bağlı iki dar agar zil köprüsü, bir potansiyelleştirici tarafından okunduğu gibi potansiyel farkı ölçtü. İkinci ....

Protokol

Bu deneylerde kullanılan tüm hayvanlar Shizuoka Üniversitesi'ndeki hayvan bakım tesisinde tutuldu ve deneyler Shizuoka Üniversitesi tarafından belirlenen hayvan araştırmaları kılavuzlarına göre gerçekleştirildi. Tüm deneyler, Shizuoka Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayıyla gerçekleştirildi (İzinler #205272 ve #656-2303).

1. NaCl elektrotlarının hazırlanması

NOT: Bu deneylerde kullanılan elektrotlar konsantre NaCl veya KCl'den oluşur. KCl/calomel elektrotları ticari olarak satın alınmaktadır. Deneye başlamadan önce, tüm elektrotların konsantre NaCl veya KCl çözeltisi ile en üste kadar dold....

Sonuçlar

Bu makalede gösterilen sonuçlar, tamamlanmış daha büyük bir projenin parçası olan sonuçlardır (bkz. ref.4,23,24).

Cldn15^-/- farelerde ince bağırsağın transepitelyal elektriksel iletkenliği azalır .
Cldn15^-/- farelerde orta ince bağırsak segmentinin temel transmukozal iletke.......

Tartışmalar

Bu deneyde, Cldn15-^/- ve WT farelerinin ince bağırsağında NaCl'nin temel elektriksel parametrelerini ve seyreltme potansiyelini ölçmek için Ussing odaları kullanıldı. Ussing odası deneyleri yaparken, deneylerde kullanılan membran preparatının uygulanabilir olduğunu doğrulamak çok önemlidir. Bu genellikle glikoz veya adenilat siklaz aktivatörü forskolin eklenerek ve _Isc'de uygun bir artış olup olmadığını görerek yapılır (farelerde 100-300 μA / ^cm2<.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm
#7 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm
10 mL locking syringe	Terumo	SS-10LZ	Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling
19 g needle	Terumo	NN-1938R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
23 g needle	Terumo	NN-2332R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
5 mm punch	NA	NA	Use to punch holes in filter paper and parafilm
acupuncture needles	Seirin	NS	Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate
Agar	Fujifilm Wako	010-15815
Alligator clips	NA	NA	Connects the electrode to the amplifier
CaCl2	Fujifilm Wako	038-00445
D(-)-Mannitol	Fujifilm Wako	133-00845	This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer
D(+)-Glucose	Fujifilm Wako	049-31165
Dissection kit			You will need, scissors and curved forceps
Dissection plates			We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber
DMSO	Sigma	472301-500ML	For making forskolin stock
Electrical recorder	TOA Electronics	PRR-5041	Other equivalent electrical recorders are available commercially
Epithelial voltage clamp amplifier	Nihon Kohden	CEZ9100	Other equivalent amplifiers are available commerically
filter paper, cut into squares	NA	NA	Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation
fine forceps	Fast Gene	FG-B50476	For blunt dissection of the muscle layer
Forskolin	Alomone Labs	F-500	Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM
HEPES	Sigma	H4034-1KG
Indomethacin	Sigma	I7338-5G	Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM
K2HPO4	Fujifilm Wako	164-04295
KCl	Fujifilm Wako	163-03545
KCl/calomel electrode	Asch Japan Co.	SCE-100
KH2PO4	Kanto chemical	32379-00
L(+)-Glutamine	Fujifilm Wako	074-00522
MgCl2	Fujifilm Wako	135-00165
Mixed Gas (95% O2/5% CO2)	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution
NaCl	Fujifilm Wako	191-01665
NaCl electrode	NA	NA	Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire
NaHCO3	Fujifilm Wako	191-01305
O2 Gas	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling chambers when using HEPES buffer
parafilm	Bemis	PM-996	Used to help seal Ussing chambers
pH meter	DKK-TOA Corp	HM-305	HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C
pH meter electrode	DKK-TOA Corp	GST-5311C
silicone rubber	Shinetsu Chemical	KE-12	Used to fill dissection plates
silver wire			Used for making NaCl electrodes
Small jars w/ plastic lids	NA	NA	Use for NaCl electrodes
stereomicroscope	Zeiss	Stemi 305	A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily
Tris (Trizma base)	Sigma	T1503-1KG	Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers
Ussing chambers	Sanki Kagaku Kougei		These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm
Water pump and heating system	Tokyo Rikakikai Co. Ltd.	NTT-110