Doğal Dokuda İntestinal Sıkı Bileşke Bariyeri ve İyon Geçirgenliğinin Ussing Oda Tekniği ile Fonksiyonel Olarak Değerlendirilmesi

Özet

Bağırsak epiteli sadece besin emilimini değil, aynı zamanda zararlı maddelere karşı koruma sağlar. Apikal-en epitelyal hücreler arası bileşke, yani sıkı bileşke, parasellüler çözünen ve iyon geçirgenliğini düzenler. Burada, mukozal tabakaların hazırlanması ve Ussing oda tekniği kullanılarak sıkı bağlantıların iyon seçiciliğinin değerlendirilmesi için bir protokol açıklanmaktadır.

Özet

Ussing oda tekniği ilk olarak 1951 yılında Danimarkalı bilim adamı Hans Ussing tarafından sodyumun kurbağa derisi boyunca hücre ötesi taşınmasını incelemek için icat edildi. O zamandan beri, bu teknik, membranlar arasında taşımanın fizyolojik parametrelerini incelemek için birçok farklı dokuya uygulanmıştır. Ussing odası yöntemi diğer yöntemlere göre tercih edilir, çünkü doğal doku kullanılabilir, bu da onu in vivo olanlara daha uygulanabilir hale getirir. Bununla birlikte, doğal doku kullanıldığından, verim düşüktür, zaman sınırlıdır ve doku hazırlığı beceri ve eğitim gerektirir. Bu odalar, çeşitli dokulardaki spesifik taşıyıcı proteinleri incelemek, Kistik Fibrozis gibi hastalık patofizyolojisini anlamak, ilaç taşınmasını ve alımını incelemek ve özellikle bağırsakta besin taşınmasının anlaşılmasına katkıda bulunmak için kullanılmıştır. Bir dokunun tüm epitel taşıma süreci göz önüne alındığında, sadece transepitelyal yollar değil, aynı zamanda parasellüler yollar da önemlidir. Sıkı kavşaklar, bağırsak boyunca dokuya özgü parasellüler geçirgenliğin önemli bir belirleyicisidir. Bu makalede, transepitelyal iletkenlik ve seyreltme potansiyellerini ölçerek iyonların parasellüler geçirgenliğini değerlendirmek için Ussing odası tekniği kullanılacaktır.

Giriş

Ussing odası yöntemi ilk olarak Danimarkalı bilim adamı Hans Ussing tarafından geliştirilmiştir. Ussing, NaCl'nin dik bir konsantrasyon gradyanına karşı cilt boyunca taşınabileceği gözlemlendikten sonra kurbağa derisi boyunca sodyum taşınmasının kısa devre akımını ölçmek için ilk kez ^kullandı1. Sistemi, cildin her iki tarafına erişimi olan iki oda arasına monte edilmiş kurbağa derisinden oluşuyordu. Her oda, dolaşıma sokulan ve havalandırılan Ringer çözeltisini içeriyordu. Cildin yakınında bulunan ve doymuş KCl-calomel elektrotlarına bağlı iki dar agar zil köprüsü, bir potansiyelleştirici tarafından okunduğu gibi potansiyel farkı ölçtü. İkinci bir çift agar zil köprüsü, bir batarya tarafından sağlanan bir elektromotor kuvveti uygulamak için AgCl ile doymuş KCl'ye sahip beherlere bağlı her odanın karşı ucuna yerleştirildi. Voltajı ayarlamak için potansiyel bir bölücü kullanıldı, böylece cilt boyunca potansiyel fark sıfır kaldı ve böylece kısa devre koşulları yaratıldı. Deriden geçen akımı okumak için bir mikroamper metre de bağlandı (orijinal oda tasarımı için ^ref.1'deki şekle bakın).

Son 70 yılda, bu teknik, besin ve iyon taşınımını incelemek için birçok farklı dokuya, özellikle bağırsak dokusuna uygulanmıştır. Örneğin, kolera kaynaklı ishalin mekanizması bu odalara tavşan ileum monte edilerek incelenmiş ve kolera toksinine bağlı ishale ^cAMP2 aracılık ettiği bulunmuştur. Ek olarak, bu odalar ayrıca Na ⁺-Glikoz kotransporter 1 (SGLT1) ³ aracılığıyla glikoz taşınmasının altında yatan mekanizmayı incelemek için de kullanılmıştır. Laboratuvarımız intestinal epitel hücrelerinde transsellüler ve parasellüler transporta odaklanmaktadır. Ussing odası yöntemi kullanılarak, hidrolize edilemeyen dipeptid glisilsarkozinin emilimini ölçmek için Ussing odaları kullanılarak, parasellüler sodyum taşınımını bozan Claudin 15 nakavt farelerinde peptid taşınması değerlendirildi. Luminal Na⁺ homeostazının proton kuplajlı peptid transportu için önemli olduğu ^{bulunmuştur4}. Ek olarak, bu odalar ayrıca serin proteaz ^tripsin5 tarafından proteinaz aktive edilmiş reseptör 1'in submukozal aktivasyonuna yanıt olarak murin çekumdaki anyon sekresyonunu araştırmak için de kullanılmıştır.

Ussing odaları son zamanlarda epitel dokusundaki parasellüler yolları değerlendirmek için de kullanılmaktadır. Parasellüler yollar, iki veya daha fazla hücrenin buluştuğu noktada oluşan protein kompleksleri olan sıkı kavşaklarla ^düzenlenir6. Bariyer fonksiyonu ve iyon seçiciliği (anyonların veya katyonların seçici olarak sıkı kavşaktan geçip geçemeyeceği), claudin ailesi proteinlerinin varlığı ile belirlenir; bazıları bariyer görevi görür (claudin 3 ve 7), anyon gözenekleri (claudin 10a) veya katyon gözenekleri (claudin 2, 10b ve 15)⁷. Parasellüler yolu değerlendirmek için, kan plazması FITC ^{konsantrasyonu8} veya EDTA-Cr9 eşliğinde FITC'nin oral gavajı gibi diğer yöntemler kullanılmıştır; Bununla birlikte, bu teknikler daha düşük çözünürlüktedir ve iyon seçiciliğini veya bağırsak sistemi bölümlerinin belirli bir bölümünü değerlendiremez. Bununla birlikte, ussing odaları, hedef iyonların seyreltme potansiyelini değerlendirmek ve bu nedenle sıkı bağlantıların iyon seçiciliğini belirlemek için kullanılabilir. Örneğin, NaCl ile, Na ⁺ ve Cl^- için sıkı bağlantıların seçiciliği, membranın bir tarafının (genellikle mukozal taraf) seyreltilmesi ve transepitelyal potansiyel farkındaki değişimin ölçülmesiyle hesaplanabilir. Na⁺ ve Cl- bağıl geçirgenlikleri Goldman-Hodgkin-Katz denklemi10 ile tahmin edilebilir ve sıkı bağlantının seçiciliği Kimizuka-Koketsu ^denklemi11 kullanılarak tahmin edilebilir. Bu nedenle, bu odalar, dokunun elektrofizyolojik parametrelerini ölçme avantajına sahiptir ve sonuç olarak, iyonların sıkı bağlantılardan geçişi hakkında diğer düşük çözünürlüklü yöntemlerden daha fazla bilgi sağlar.

Ussing odası yöntemi sadece bağırsak sistemi ile sınırlı değildir, bağırsakla ilgili çalışmalarda yaygın olarak kullanılmasına rağmen, başka birçok uygulaması da vardır. Örneğin, bu odalar Kistik Fibrozis'i ve özellikle klorür kanalı kistik fibroz transmembran iletkenlik regülatörünü (CFTR) incelemek için ^{kullanılmıştır12}. Kistik Fibrozis, CFTR13'teki bir mutasyondan kaynaklanır, bu da bozulmuş klorür sekresyonu ve solunum epitel hücreleri tarafından sıvı taşınması ve bunun sonucunda daha kalın, daha kuru bir mukoza tabakası ^{ile sonuçlanır14}. Hava yolu epitelyal CFTR'nin incelenmesi, sadece hastalığı anlamak için değil, aynı zamanda hastalığı tedavi etmenin yollarını keşfetmek için bu odalarla gerçekleştirilmiştir. Örneğin, Kistik Fibrozise neden olan nadir mutasyonları olan hastalarda, Orkambi ve bir amplifikatör ko-terapisi gibi tedavileri test etmek için hasta solunum epitel hücrelerinin analizi ^{kullanılmıştır15}.

Ussing odaları, ilaç alımını ve farmakokinetiği incelemek için insan biyopsi dokusu gibi ilaç dağıtım yollarını incelemek için de ^{kullanılmıştır16}. Bağırsak alımı, ilaç dağıtımının tek yolu değildir. Bu odalar ayrıca nazal ilaç dağıtım sistemlerini incelemek için de ^{kullanılmıştır17}. Göz için Ussing odaları ile ilaç dağıtım çalışmaları da yapılmıştır. Tavşan korneasında, ilaçların dokular arasında emilimini artırmak için tasarlanmış bir ilaç olan Labrasol ile geçirgenlik ve alım çalışmaları ^{yapılmıştır18}. Başka bir çalışmada, benzilalkonyum klorürün tavşan sklerasında transskleral ilaç dağıtımı üzerindeki etkisi ^{incelenmiştir19}.

Ussing odası yöntemi yararlıdır çünkü doğal doku kullanılabilir. Bu nedenle, Caco-2 hücre hatları gibi in vitro modellere göre tercih edilir. Bununla birlikte, teknik numuneleri hazırlamak için beceri ve zaman gerektirir, bu nedenle yüksek verimli uygulamalar için uygun değildir. Hücre monokatmanlarının elektrofizyolojik özellikleri, bu odalardaki hücre kültürü ekleri kullanılarak incelenebilir. Son keşifler, epitel veya endotel kök hücrelerinin toplanmasından kültürde yetiştirilen mini organlar olan organoidlerin kültürüne izin ^vermiştir20. Organoid kültürü, tek katmanlı olarak yetiştirilmek üzere manipüle edilebilir, böylece organoidlerin bir Ussing odasına monte edilmesini mümkün ^kılar21. Çeşitli epitel ve endotel dokularının organoidleri incelenebilir, bu da organoid kültür uzun vadede korunabileceğinden, gerekli hayvan sayısını azaltır. Bu aynı zamanda zaman alıcı ve zahmetli doku diseksiyonu ve hazırlık adımlarına ihtiyaç duyulmayacağından verimi de artıracaktır. Gelecekte, Ussing odası çalışmaları doku naklini incelemek için çok yararlı olmaya devam edecek ve özellikle kişiselleştirilmiş tıp alanında önemli olacaktır.

Aşağıdaki protokol, NaCl'nin seyreltme potansiyelini ölçerek Claudin 15 nakavt (Cldn15^-/-) farelerinin ve vahşi tip (WT) kontrollerin ince bağırsağındaki sıkı bağlantıların geçirgenlik ve bariyer fonksiyonunu değerlendirmek için Ussing odası yönteminin uygulanmasını göstermektedir. Epitel ve endotel dokusunda iki veya daha fazla hücrenin buluştuğu noktada sıkı kavşaklar (TJ) oluşur. İki hücreli sıkı kavşakların (bTJ), özellikle bTJ içinde bulunan claudin ailesi proteinlerinin, ^TJ7'nin bariyer fonksiyonunu ve permselectivity'sini belirlediği düşünülmektedir. Cldn15^-/- fareler mega ince bağırsağa22 sahiptir ve claudin 154,23,24 yoluyla meydana gelen bağırsak Na ⁺ geri dönüşümünün kaybı nedeniyle besin alım kabiliyeti azalır. Cldn15-^/- fareler Na ⁺ homeostazını bozmuştur, bu da onları TJ'nin geçirgenliğini incelemek için ilginç bir model haline getirmektedir. Aşağıdaki protokol, orta ince bağırsaktaki NaCl'nin (PNa / PCl) seyreltme potansiyelini ölçerek _{TJ'nin NaCl'ye} geçirgenliğini değerlendirir. Kısaca, membranın bir tarafının seyreltilmesiyle ortaya çıkan membran potansiyel farkındaki değişim (M tarafı veya S tarafı, her ikisi de aşağıdaki protokolde ölçülmüştür), Na ⁺ (_PNa) ve Cl^- (PCl) geçirgenliğini hesaplamak için kullanılabilir ve seyreltme potansiyeli (_PNa / _PCl), sıkı bağlantının katyonik veya anyonik bir seçiciliğe sahip olup olmadığını gösterecektir.

Bu protokoldeki deneyler, bağırsak preparatının dikey olarak monte edildiği iki yarıdan oluşan özelleştirilmiş bir Ussing odası (Şekil 1A), voltaj kelepçesi amplifikatörü, elektrik kaydedici, elektrotlar, tuz köprüleri, Ringer çözeltisi, HEPES tamponu (150 mM NaCl), seyreltilmiş HEPES tamponu (75 mM NaCl), bağırsak hazırlığı (ekipman hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosuna bakınız) kullanılarak gerçekleştirilmiştir.

Protokol

Bu deneylerde kullanılan tüm hayvanlar Shizuoka Üniversitesi'ndeki hayvan bakım tesisinde tutuldu ve deneyler Shizuoka Üniversitesi tarafından belirlenen hayvan araştırmaları kılavuzlarına göre gerçekleştirildi. Tüm deneyler, Shizuoka Üniversitesi'ndeki Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi'nin onayıyla gerçekleştirildi (İzinler #205272 ve #656-2303).

1. NaCl elektrotlarının hazırlanması

NOT: Bu deneylerde kullanılan elektrotlar konsantre NaCl veya KCl'den oluşur. KCl/calomel elektrotları ticari olarak satın alınmaktadır. Deneye başlamadan önce, tüm elektrotların konsantre NaCl veya KCl çözeltisi ile en üste kadar doldurulduğundan emin olun.

1. Plastik kapaklı küçük cam kavanozlar hazırlayın (hacim 20 mL).
2. Plastik kapaklarda, biri NaCl tuz köprüsü (2,5 mm çaplı), diğeri gümüş tel (1 mm çap; Şekil 1C, NaCl elektrodu).
3. Cam kavanozu doymuş NaCl çözeltisi ile doldurun (dolana kadar yaklaşık 15 mL).
4. Kavanozun içine gümüş tel (0,8 mm çaplı, 7 cm uzunluğunda) yerleştirin, ancak kavanozun dışındaki tel kısmının timsah klipsleri (küçük boyutlu) aracılığıyla amplifikatör sistemine bağlanabildiğinden emin olun.
5. Kullanılmadığında, elektrotları sarın ve kurumayı önlemek için deliklerin parafilm ile kaplandığından emin olun.

2. Tuz köprülerinin hazırlanması

NOT: Katılaşmak için yeterli zaman sağlamak üzere deneyden en az bir gün önce tuz köprüleri hazırlayın. Tuz köprüleri tekrar tekrar kullanılabilir ancak 2 ay sonra kullanılması önerilmez.

1. NaCl tuz köprüleri
   1. #7 polietil boru (dış çap 2,3 mm, iç çap 1,3 mm), 19 G iğne ve kilit tipi şırınga, 200 mL 1 M NaCl çözeltisi, 2 g agar, tuz köprüsü depolaması için kapatılabilir plastik kap hazırlayın.
   2. Ussing odası kurulumu için gerekli boyuta kadar boruyu keserek uygun sayıda tuz köprüsü hazırlayın (her oda iki tuz köprüsü gerektirir).
   3. Agar enjeksiyonundan önce, tüplerle bir U şekli yapın ve bunları ılık su kabına yerleştirin (tuz köprüleri kurmak için kolay bir şekil oluşturmak için).
   4. 11.688 g NaCl'yi 200 mL'de deiyonize suda çözerek 200 mL 1 M NaCl yapın.
   5. 1 M NaCl'yi 100 mL'lik porsiyonlara bölün: 1 M NaCl'de 100 mL'lik %2 agar yapın (NaCl'de 2 g agar karıştırın, çözünmesi için mikrodalgada ısıtın).
   6. 19 G'lık bir iğne ve kilitleme şırıngası kullanarak, şırıngayı 1 M NaCl / agar çözeltisi ile doldurun. Çözeltiyi damla damla atmaya yavaşça başlayın ve bunu yaparken iğneyi tüpün bir ucuna yerleştirin ve karışım diğer taraftan çıkana kadar doldurun.
   7. Çözeltiyi ifade ederken iğneyi yavaşça geri çekin ve gerekli tüm tuz köprüleri yapılana kadar tekrarlayın. (Çözelti şırıngada veya iğnede katılaşırsa, çözelti tekrar ifade edilene kadar sıcak suda kısaca ısıtın.)
   8. Kabarcık olmadığından emin olmak için tuz köprülerini kontrol edin ve kalan 1 M NaCl çözeltisini kapatılabilir bir kapta saklayın.
2. KCl tuz köprüleri
   NOT: Tuz köprüsü uçları çözülebildiğinden ve K+ tampona sızabildiğinden, tampondaki K⁺ konsantrasyonunun artmasını önlemek için KCl agar köprüleri için daha ince borular kullanılır.
   1. #3 polietil boru (dış çap 1.0 mm, iç çap 0.5 mm), 23 G iğne ve kilit tipi şırınga, 200 mL 1 M KCl çözeltisi, 2 g agar, tuz köprüsü depolaması için kapatılabilir plastik kap hazırlayın.
   2. Boruyu Ussing odası kurulumu için gerekli boyuta kadar keserek uygun sayıda tuz köprüsü hazırlayın (her oda iki tuz köprüsü gerektirir).
   3. 200 mL deiyonize suda 14.91 g KCl'yi çözerek 200 mL 1 M KCl yapın.
   4. İki 100 mL porsiyona bölün: 1 M KCl'de 100 mL% 2 agar yapın (KCl'de 2 g agar karıştırın, çözünmesi için bir mikrodalgada ısıtın).
   5. 23 G'lik bir iğne ve kilitleme şırıngası kullanarak, NaCl tuz köprülerinde olduğu gibi% 2 agar 1 M KCl karışımı (tüplerin tamamen dolu olduğundan ve kabarcık olmadığından emin olun) ile boru enjekte edin.
   6. Kabarcık olmadığından emin olmak için tuz köprülerini kontrol edin ve kalan 1 M KCl çözeltisinde kapatılabilir bir kapta saklayın.

3. Ringer çözeltisinin ve HEPES tamponunun hazırlanması

NOT: Ussing odasına monte edilen dokuya bağlı olarak, Ringer çözeltisinin bileşenleri farklı olabilir. Burada sunulan tarifler ince ve kalın bağırsaklara özgüdür.

1. Ringer'ın çözeltisini Tablo 1'de açıklandığı gibi deneylerin yapıldığı gün taze yapın.
2. Dokuya O2 ve tamponlama kapasitesi sağlamak için çözeltiyi %95 _O2/%5 _CO2 ile kabarcıklayın.

Ringer çözeltisi (ince Bağırsak)	Ringer çözeltisi (kalın bağırsak)
NaHCO3 – 21,0 mM	NaHCO3 – 21,0 mM
K2HPO4 – 2,4 mM	K2HPO4 – 2,4 mM
KH2PO4 – 0,6 mM	KH2PO4 – 0,6 mM
NaCl – 119.0 mM	NaCl – 119.0 mM
MgCl2 – 1.2 mM	MgCl2 – 1.2 mM
CaCl2 – 1,2 mM	CaCl2 – 1,2 mM
Indometazin – 10 μM (21 mM NaHCO3'te 1 mM stok yapın, 1 L Ringer çözeltisi için 10 mL stok ekleyin)	Indometazin – 10 μM (21 mM NaHCO3'te 1 mM stok yapın, 1 L Ringer çözeltisi için 10 mL stok ekleyin)
1 mM Glutamin (0,146 g/L)	10 mM Glikoz

Tablo 1: Ringer'ın Çözüm Tarifi. Ringer çözeltisini yapmak için, tüm bileşenleri deiyonize su ile karıştırın. Ringer'ın çözümü en iyi deneylerden önce taze yapılır. Kullanana kadar buzdolabında veya buzda saklayın. Kullanmadan önce,% 95 O2 / % 5 _CO2 ile gaz.

3. HEPES tamponunu, deney gününde, Tablo 2'de açıklandığı gibi, bileşenleri deiyonize suda karıştırarak taze yapın.
4. pH ayarından sonraya kadar tamponun son hacmine ayarlamayın.
5. HEPES tamponunu 37 °C'ye ısıtın ve karıştırırken yavaşça 1 M Tris çözeltisi damlaları ekleyerek pH'ı 7,4'e ayarlayın.
6. Uygun miktarda deiyonize su ekleyerek son hacme ayarlayın.

HEPES Tampon	Seyreltme HEPES Tamponu
HEPES – 10 mM	HEPES – 10 mM
Glikoz – 10 mM (Kalın bağırsak)	Glikoz – 10 mM (Kalın bağırsak)
1 mM Glutamin (0.146 g/L) (İnce bağırsak)	1 mM Glutamin (0.146 g/L) (İnce bağırsak)
NaCl – 150 mM	NaCl – 75 mM + 150 mM mannitol (ozmolalite farklılıklarını ayarlamak için)
MgCl2 – 1 mM	MgCl2 – 1 mM
CaCl2 – 2 mM	CaCl2 – 2 mM
Indometazin – 10 μM (21 mM NaHCO3'te 1 mM stok yapın, 1 L Zil Çözeltisi için 10 mL stok ekleyin)	Indometazin – 10 μM (21 mM NaHCO3'te 1 mM stok yapın, 1 L Zil Çözeltisi için 10 mL stok ekleyin)
1 M Tris kullanarak pH 7,40'a (37°C) ayarlayın

Tablo 2: HEPES Tampon Tarifi. HEPES tamponu ve seyreltme HEPES tamponu yapmak için, tüm bileşenleri deiyonize suda çözün. Çözeltiler 1 M Tris çözeltisi ile pH ayarlı olmalıdır, bu nedenle tam miktarda su eklemeyin (örneğin, 1 L yaparken, tüm bileşenleri yaklaşık 800 mL suda çözün). Daha sonra çözeltiyi 37 ° C'ye ısıtın, pH'ı 7.4'e ayarlayın ve ardından son ses seviyesini ayarlayın.

4. Ussing odası kurulumu

NOT: Bu protokolde kullanılan Ussing odaları, özel yapım sürekli perfüzyon odalarıdır. Fare bağırsak bariyeri fonksiyonunu veya besin alımını değerlendirmek için, 4 veya 5 mm çapında bir açıklığa sahip odalar ^önerilir25 (Şekil 1A-C).

1. Kenar ^etkisini26 azaltmak ve haznelerin sızdırmazlığına yardımcı olmak için, kurulumdan önce 4 veya 5 mm delik delikli parafin filmi (yaklaşık 4 ^cm2) takın (Şekil 1B).
2. Seyreltme potansiyeli ölçümü için açık devre koşullarında ayarlayın. Geçerli kelepçe modunda ayarlayın. Çıkışı akım olarak ayarlayın ve akım darbesini ±20 μA olarak ayarlayın.
3. Kısa devre akımı ve transmukozal direncin ölçülmesi için kısa devre koşullarında kurulum yaparken, voltaj kelepçesi modunda ayarlayın. Çıkışı voltaj olarak ayarlayın ve voltaj darbesini ±5 mV'ye ayarlayın.
4. Su ceketinde 37 °C su sirkülasyonu olduğundan emin olun.
5. Her odayı Ringer çözeltisi veya HEPES tamponu ile doldurun (miktar kullanılan sisteme bağlıdır, burada kullanılan odalar her iki taraf için 5 mL gerektirir) ve sızıntı olmadığından emin olun.
6. Tuz köprülerini ve elektrotları bağlayın.
7. Tuz köprülerinin ve elektrotların doğru şekilde ayarlandığından emin olmak için voltajın 0 ve kararlı, darbe akımı olduğundan emin olun.
8. Sistem ve Ringer'ın çözelti sıcaklığının en az 20 dakika boyunca dengelenmesine izin verin.
9. Dengelemeden sonra, KCl elektrotları arasındaki asimetrik voltaj farkını düzeltin ve sıfıra değiştirerek sıvı direncini telafi edin (doğru yolu belirlemek için kullanılan Ussing oda sisteminin kılavuzunu kontrol edin).

5. Bağırsak dokusunun diseksiyonu

NOT: Tüm hayvan deneyleri, ülke ve üniversite tarafından belirlenen düzenlemeler çerçevesinde gerçekleştirilmelidir.

1. Bağırsak dokusunu almadan önce, taze, buz gibi soğuk Ringer çözeltisini hazırlayın ve 15 dakika boyunca% 95 O2 ve% 5 _CO2 ile kabarcık hazırlayın (adım 3).
2. Fareleri, araştırmada hayvanların kullanımını düzenleyen kılavuzlara göre anestezi yapın. Bu deney için, fareler bir anestezi uzmanı tarafından uygulanan% 2-3 izofluran ile uyuşturuldu. Ayak parmaklarını sıkıştırarak ve ağrı yanıtı olmadığından emin olarak uygun anesteziyi kontrol edin.
3. Karında pelvisten diyaframa makasla bir kesi yapın; mideyi bulun ve midenin pilorik ucunu kesin.
4. İnce bağırsağa bağlı mide kısmını forseps ile tutun ve mezenterik ekleri keserken ince bağırsağı yavaşça çekin. Bağırsak dokusunu hiçbir şekilde kesmemeye veya zarar vermemeye dikkat edin.
5. Bağırsağı anüse kadar diseke etmeye devam edin. Kalın bağırsağın tamamen çıkarılması için, kalın bağırsağın distal kısmını ortaya çıkarmak için pelvik kemikleri kesin ve ekleri keserek bağırsağın geri kalanını dikkatlice çıkarın.
6. Bağırsağın uzunluğunu ölçün ve istenen bölümlere bölün. Bu deney için ince bağırsağı üç bölüme ayırın ve orta segmenti kullanın.
7. İstenilen segmentleri buz gibi soğuk, kabarcıklı Ringer çözeltisine yerleştirin; daha sonra, mezenterik ataşmanları keserek her bir segmenti uzunlamasına açın. Yağ ve bağ dokusunu kesin.
8. Segmentleri buz gibi soğuk Ringer çözeltisine geri döndürün ve iyice yıkayın (buz gibi soğuk çözeltide bile, luminal epitelin oksijenlenmesi epitel fonksiyonunu korumak için önemlidir).

6. Kas tabakasının soyulması ve bağırsak tabakasının hazırlanması

NOT: Serosa'nın (kas tabakası) çıkarılması, bağırsak kullanılarak yapılan taşıma çalışmaları için önemlidir. Serosa kalırsa, bağırsak dokusu elektrofizyolojik verileri bozacak rastgele kas kasılmalarına maruz kalabilir ve taşıma engellenebilir. Soyulmamış doku, Ussing odalarına monte edildiğinde hızla bozulur, çünkü seroza substrat ve oksijen için önemli bir difüzyon bariyeridir. Bazı özel durumlarda, kas tabakasını korumak gerekebilir, bu nedenle karar araştırmacıya ve deneysel tasarıma bağlıdır. Bağırsak tabakaları hangi tabakanın çıkarıldığına bağlı olarak iki şekilde hazırlanabilir (Şekil 2). Bu deney için mukoza ve submukozal preparatlar gereklidir (Şekil 2, 2^. panel).

1. Silikon kauçuk, pimler (küçük akupunktur iğneleri), 5 mm delikli filtre kağıdı ve parafilm kareleri (2 cm x 2 cm; diğer sistemler için gerekli olmayabilir) ile kaplı diseksiyon plakaları (10 cm çapında) hazırlayın.
2. Taze, buz gibi soğuk, kabarcıklı Ringer çözeltisini diseksiyon plakasına dökün (dokuyu örtmek için yeterli, yaklaşık 2-3 mL).
3. Bir stereomikroskop altında, bağırsak dokusunun uçlarını sabitleyin (mukozal tarafı aşağı).
4. İnce forseps kullanarak, kas tabakasını altta yatan mukozadan açıkça diseke edin.
5. Dokuya herhangi bir delik açmamaya veya yırtmamaya dikkat edin.
6. Kas tabakası çıkarıldıktan sonra, 5 mm çapında bir açıklık için yeterince büyük bir parça kesin. İnce bağırsağı hazırlarken, serosa-kas tabakasının çıkarılması 10 dakika içinde yapılmalıdır, çünkü bu koşullar altında luminal oksijenasyon zordur.
7. Islak 5 mm delikli filtre kağıdı Ringer çözeltisinde kare ve bağırsak dokusunu mukozal tarafı aşağı doğru olacak şekilde üzerine yerleştirin, çünkü submukozal preparatlar kendiliğinden mukozal tarafı dışarıda olacak şekilde sarılır.
8. Açıklığın bağırsak dokusu tarafından tamamen kaplandığından ve kırışıklık olmadığından emin olun. Açıklığın tamamen örtülü olup olmadığını incelemek için preparatın altında siyah bir tahta kullanın.
9. Gerekli sayıda mukozal preparat için bu prosedürü tekrarlayın (bu deneyde iki preparat gereklidir: bir preparat seyreltme potansiyelini ölçmek için kullanılacak, diğeri ise temel elektriksel parametreleri ölçmek için kullanılacaktır).

7. Ussing odalarına bağırsak preparatlarının monte edilmesi

NOT: Kurulum, Ussing oda sisteminin türüne ve kullanılan kayıt sistemine bağlı olacaktır.

1. Ringer'ın solüsyon/HEPES tamponunu Ussing odasından emiş.
2. Ussing odasını sökün ve filtre kağıdını bağırsak preparat mukozal tarafı ile mukozal yan odaya yerleştirin ve odanın penceresi filtre kağıdının deliği ile aynı hizada olacak şekilde ayarlayın (Şekil 1A, oda penceresinin etrafındaki siyah işaretleme, preparatların hizalanması için yararlıdır).
3. Serosal yan odacığı dikkatlice mukozal yan odaya yerleştirin ve sıkıca kapatın, ancak bağırsak tabakasının bağlantı sırasında hareket etmediğinden emin olun.
4. Her iki odayı da Ringer çözeltisi veya HEPES tamponu ile hızlı bir şekilde doldurun ve köpüren değnekleri yerleştirin (Ringer çözeltisi: %95 O2/%5 _CO2; HEPES tamponu:% 100 _O2) odaların karşı ucunda, membrandan uzakta (preparata çok yakın köpürmenin ölçümler üzerinde bir etkisi olabilir).
5. Tuz köprülerini yeniden bağlayın ve bağlantıların iyi olduğundan emin olmak için voltajın kararlı ve darbe akımı olup olmadığını kontrol edin (Şekil 1C).
6. Her bağırsak preparatı için tekrarlayın.
7. Sistemin yaklaşık 15 dakika boyunca dengelenmesine izin verin. Bir kayıt sistemi kullanıyorsanız, deneylere başlamadan önce iletkenlik ve Issc / membran potansiyel farkının stabilize olmasına izin verin.

8. Seyreltme potansiyeli deneyi (açık devre koşulları)

1. HEPES tamponunu emerek ve her iki tarafa 5 mL taze önceden ısıtılmış HEPES tamponu ekleyerek odanın her iki tarafını da yıkayın.
2. Kayıt sistemini açın. Aralığı 250 mV'ye ayarlayın (burada kullanılan sistem çıkış voltajını 10x yükseltir), işaretleyici konumlarını ayarlayın ve ölçmek için kayıt sistemini ayarlayın.
3. Ussing oda sistemlerini kelepçeleme moduna getirin ve ölçmeye başlayın. Membran potansiyeli stabilize edildikten sonra (~ 15-20 dakika), değerlendirme başlayabilir.
4. HEPES tamponunu mukozal taraftan emme ve hızlı bir şekilde 75 mM NaCl içeren 5 mL ısıtılmış seyreltme HEPES tamponu ile değiştirin.
5. Membran potansiyeli zirveye ulaştığında (5-10 dakika), seyreltme tamponunu "Mukozal" taraftan çıkarın ve HEPES tamponu ile değiştirin.
6. Gerekirse, Serosal taraf için adım 3'ü tekrarlayın ve Serosal tarafa seyreltme HEPES tamponu ekleyin.
7. Dokunun canlı olmasını sağlamak için, adenilat siklaz aktivatörü Forskolin'i (son konsantrasyon 10 μM) Serosal tarafa ekleyin.
8. Membran potansiyel farkı zirveye ulaştığında ve azalmaya başladığında, deney sona erer.

9. Transepitelyal elektriksel iletkenliğin ve temel _Isc'nin ölçülmesi (kısa devre koşulları)

1. Zil çözeltisini emerek ve her iki tarafa 5 mL taze kabarcıklı Ringer çözeltisi ekleyerek odanın her iki tarafını da yıkayın.
2. Kayıt sistemini açın. Aralığı 2,5 V'a ayarlayın (burada kullanılan sistem çıkış voltajını 10x yükseltir), işaretleyici konumlarını ayarlayın ve ölçmek için kayıt sistemini ayarlayın.
3. Ussing oda sistemlerini kelepçe moduna getirin ve ölçmeye başlayın; Isc ve iletkenlik stabilize edildikten sonra (~ 15-20 dakika), taban çizgisi ölçümleri elde edilebilir.
4. Dokunun canlı olmasını sağlamak için, adenilat siklaz aktivatörü Forskolin'i (son konsantrasyon 10 μM) Serosal tarafa ekleyin.
5. Membran potansiyel farkı zirveye ulaştığında ve azalmaya başladığında, deney yapılır.

10. Sonuçların analiz edilmesi

1. Açık devre koşulları altında, Ohm yasasına göre akım darbelerine yanıt olarak voltaj değişiminden transmukozal iletkenliği hesaplayın. Ohm yasasını uygulayarak transmukozal voltaj ve iletkenlikten eşdeğer kısa devre akımını (_Isc) belirleyin.
2. Goldman-Hodgkin-Katz ^denklemi10 ile göreceli iyonik seçiciliği (_PNa/PCl) hesaplamak için _NaCl'nin seyreltme potansiyelini kullanın.
3. Kimizuka-Koketsu denklemini kullanarak her iyon için sıkı bağlantının mutlak seçiciliğini tahmin ^edin11.
4. Seyreltme potansiyellerinden Goldman-Hodgkin-Katz denklemini kullanarak PNa / _PCl'yi hesaplayın ve Yu ve ark.10 tarafından açıklandığı gibi Kimizuka-Koketsu denkleminden mutlak geçirgenlikler _PNa ve _PCl'yi belirleyin:
   
   
   
   
   burada, V: Seyreltme potansiyeli (mV); α: Aktivite oranı. NaCl'nin HEPES tamponundaki hesaplanan aktivitesi, seyreltme HEPES tamponundaki hesaplanan NaCl aktivitesine bölünür (Bu deney için 1.8966 olarak hesaplanmıştır); e: Matematiksel sabit, 2.71828; GM: Transmukozal iletkenlik (mS/^cm2); F: Faraday sabiti (96.485,3329 C/mol); R: Gaz sabiti (8,314 J/mol K); T: Sıcaklık (310.15 K)

Sonuçlar

Bu makalede gösterilen sonuçlar, tamamlanmış daha büyük bir projenin parçası olan sonuçlardır (bkz. ref.4,23,24).

Cldn15^-/- farelerde ince bağırsağın transepitelyal elektriksel iletkenliği azalır .
Cldn15^-/- farelerde orta ince bağırsak segmentinin temel transmukozal iletke...

Tartışmalar

Bu deneyde, Cldn15-^/- ve WT farelerinin ince bağırsağında NaCl'nin temel elektriksel parametrelerini ve seyreltme potansiyelini ölçmek için Ussing odaları kullanıldı. Ussing odası deneyleri yaparken, deneylerde kullanılan membran preparatının uygulanabilir olduğunu doğrulamak çok önemlidir. Bu genellikle glikoz veya adenilat siklaz aktivatörü forskolin eklenerek ve _Isc'de uygun bir artış olup olmadığını görerek yapılır (farelerde 100-300 μA / ^cm2<...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm
#7 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm
10 mL locking syringe	Terumo	SS-10LZ	Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling
19 g needle	Terumo	NN-1938R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
23 g needle	Terumo	NN-2332R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
5 mm punch	NA	NA	Use to punch holes in filter paper and parafilm
acupuncture needles	Seirin	NS	Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate
Agar	Fujifilm Wako	010-15815
Alligator clips	NA	NA	Connects the electrode to the amplifier
CaCl2	Fujifilm Wako	038-00445
D(-)-Mannitol	Fujifilm Wako	133-00845	This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer
D(+)-Glucose	Fujifilm Wako	049-31165
Dissection kit			You will need, scissors and curved forceps
Dissection plates			We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber
DMSO	Sigma	472301-500ML	For making forskolin stock
Electrical recorder	TOA Electronics	PRR-5041	Other equivalent electrical recorders are available commercially
Epithelial voltage clamp amplifier	Nihon Kohden	CEZ9100	Other equivalent amplifiers are available commerically
filter paper, cut into squares	NA	NA	Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation
fine forceps	Fast Gene	FG-B50476	For blunt dissection of the muscle layer
Forskolin	Alomone Labs	F-500	Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM
HEPES	Sigma	H4034-1KG
Indomethacin	Sigma	I7338-5G	Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM
K2HPO4	Fujifilm Wako	164-04295
KCl	Fujifilm Wako	163-03545
KCl/calomel electrode	Asch Japan Co.	SCE-100
KH2PO4	Kanto chemical	32379-00
L(+)-Glutamine	Fujifilm Wako	074-00522
MgCl2	Fujifilm Wako	135-00165
Mixed Gas (95% O2/5% CO2)	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution
NaCl	Fujifilm Wako	191-01665
NaCl electrode	NA	NA	Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire
NaHCO3	Fujifilm Wako	191-01305
O2 Gas	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling chambers when using HEPES buffer
parafilm	Bemis	PM-996	Used to help seal Ussing chambers
pH meter	DKK-TOA Corp	HM-305	HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C
pH meter electrode	DKK-TOA Corp	GST-5311C
silicone rubber	Shinetsu Chemical	KE-12	Used to fill dissection plates
silver wire			Used for making NaCl electrodes
Small jars w/ plastic lids	NA	NA	Use for NaCl electrodes
stereomicroscope	Zeiss	Stemi 305	A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily
Tris (Trizma base)	Sigma	T1503-1KG	Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers
Ussing chambers	Sanki Kagaku Kougei		These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm
Water pump and heating system	Tokyo Rikakikai Co. Ltd.	NTT-110