Évaluation fonctionnelle de la barrière de jonction serrée intestinale et de la perméabilité aux ions dans les tissus natifs par la technique de la chambre d’Ussing

Résumé

L’épithélium intestinal confère non seulement l’absorption des nutriments, mais aussi une protection contre les substances nocives. La jonction intercellulaire épithéliale la plus apicale, c’est-à-dire la jonction serrée, régule le soluté paracellulaire et la perméabilité aux ions. Ici, un protocole pour la préparation des feuilles muqueuses et l’évaluation de la sélectivité ionique des jonctions serrées à l’aide de la technique de la chambre d’Ussing est décrit.

Résumé

La technique de la chambre d’Ussing a été inventée pour la première fois par le scientifique danois Hans Ussing en 1951 pour étudier le transport transcellulaire du sodium à travers la peau de grenouille. Depuis lors, cette technique a été appliquée à de nombreux tissus différents pour étudier les paramètres physiologiques du transport à travers les membranes. La méthode de la chambre d’Ussing est préférable à d’autres méthodes car le tissu natif peut être utilisé, ce qui le rend plus applicable à ce qui se passe in vivo. Cependant, comme le tissu natif est utilisé, le débit est faible, le temps est limité et la préparation des tissus nécessite des compétences et de la formation. Ces chambres ont été utilisées pour étudier des protéines transporteuses spécifiques dans divers tissus, comprendre la physiopathologie des maladies telles que la fibrose kystique, étudier le transport et l’absorption des médicaments, et surtout contribué à la compréhension du transport des nutriments dans l’intestin. Compte tenu de l’ensemble du processus de transport épithélial d’un tissu, non seulement les voies transépithéliales, mais aussi les voies paracellulaires sont importantes. Les jonctions serrées sont un déterminant clé de la perméabilité paracellulaire spécifique des tissus dans l’intestin. Dans cet article, la technique de la chambre d’Ussing sera utilisée pour évaluer la permsélectivité paracellulaire des ions en mesurant la conductance transépithéliale et les potentiels de dilution.

Introduction

La méthode de la chambre d’Ussing a été développée pour la première fois par le scientifique danois Hans Ussing. Ussing l’a utilisé pour la première fois pour mesurer le courant de court-circuit du transport du sodium à travers la peau de grenouille après avoir observé que le NaCl pouvait être transporté à travers la peau contre un gradient de concentration ^élevé1. Son système consistait en la peau de grenouille montée entre deux chambres avec accès de chaque côté de la peau. Chaque chambre contenait la solution de Ringer qui circulait et était aérée. Deux ponts étroits de sonnerie de gélose situés près de la peau et reliés à des électrodes sat....

Protocole

Tous les animaux utilisés dans ces expériences ont été maintenus dans l’établissement de soins aux animaux de l’Université de Shizuoka et les expériences ont été menées conformément aux directives pour la recherche animale établies par l’Université de Shizuoka. Toutes les expériences ont été réalisées avec l’approbation du Comité de soins et d’utilisation des animaux de l’Université de Shizuoka (permis n ° 205272 et n ° 656-2303).

1. Préparation des électrodes NaCl

REMARQUE: Les électrodes utilisées dans ces expériences sont constituées de NaCl concentré ou KCl. Les électrodes KCl/calomel sont achetées dans le comm....

Résultats

Les résultats présentés dans le présent document sont des résultats qui faisaient partie d’un projet plus vaste qui a été achevé (voir réf.4,23,24).

La conductance électrique transépithéliale de l’intestin grêle est diminuée chez les souris Cldn15^-/-.
La conductance transmuqueuse de base (dans.......

Discussion

Dans cette expérience, des chambres d’Ussing ont été utilisées pour mesurer les paramètres électriques de base et le potentiel de dilution du NaCl dans l’intestin grêle de souris Cldn15^-/- et WT. Il est très important lors des expériences en chambre d’Ussing de vérifier que la préparation membranaire utilisée dans les expériences est viable. Cela se fait généralement en ajoutant du glucose ou de l’activateur de l’adénylate cyclase forskoline et en voyant s’il y a une augmen.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
#3 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 1.0 mm; inner diameter 0.5 mm
#7 polyethyl tubing	Hibiki		outer diameter 2.3 mm; inner diameter 1.3 mm
10 mL locking syringe	Terumo	SS-10LZ	Locking syringes are necessary to prevent the needle from dislodging during filling
19 g needle	Terumo	NN-1938R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
23 g needle	Terumo	NN-2332R	Please use caution when working with needles and dispose of in sharps container
5 mm punch	NA	NA	Use to punch holes in filter paper and parafilm
acupuncture needles	Seirin	NS	Used as dissection pins to pin tissue to dissection plate
Agar	Fujifilm Wako	010-15815
Alligator clips	NA	NA	Connects the electrode to the amplifier
CaCl2	Fujifilm Wako	038-00445
D(-)-Mannitol	Fujifilm Wako	133-00845	This is used to correct for the osmolality difference in dilution HEPES buffer
D(+)-Glucose	Fujifilm Wako	049-31165
Dissection kit			You will need, scissors and curved forceps
Dissection plates			We used 10 cm cell culture plates and covered with silicon rubber
DMSO	Sigma	472301-500ML	For making forskolin stock
Electrical recorder	TOA Electronics	PRR-5041	Other equivalent electrical recorders are available commercially
Epithelial voltage clamp amplifier	Nihon Kohden	CEZ9100	Other equivalent amplifiers are available commerically
filter paper, cut into squares	NA	NA	Punched with a 5 mm punch, used to hold intestinal preparation
fine forceps	Fast Gene	FG-B50476	For blunt dissection of the muscle layer
Forskolin	Alomone Labs	F-500	Make 10 mM stock in DMSO, final concentration will be 10 µM
HEPES	Sigma	H4034-1KG
Indomethacin	Sigma	I7338-5G	Make a 1 mM stock in 21 mM NaHCO3, final concentration is 10 µM
K2HPO4	Fujifilm Wako	164-04295
KCl	Fujifilm Wako	163-03545
KCl/calomel electrode	Asch Japan Co.	SCE-100
KH2PO4	Kanto chemical	32379-00
L(+)-Glutamine	Fujifilm Wako	074-00522
MgCl2	Fujifilm Wako	135-00165
Mixed Gas (95% O2/5% CO2)	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling Ringer solution and chambers when using Ringer solution
NaCl	Fujifilm Wako	191-01665
NaCl electrode	NA	NA	Handmade electrodes which require concentrated NaCl and Silver wire
NaHCO3	Fujifilm Wako	191-01305
O2 Gas	Shizuoka Oxygen Company		Used for bubbling chambers when using HEPES buffer
parafilm	Bemis	PM-996	Used to help seal Ussing chambers
pH meter	DKK-TOA Corp	HM-305	HEPES buffer needs to be adjusted to pH 7.4 at 37 °C
pH meter electrode	DKK-TOA Corp	GST-5311C
silicone rubber	Shinetsu Chemical	KE-12	Used to fill dissection plates
silver wire			Used for making NaCl electrodes
Small jars w/ plastic lids	NA	NA	Use for NaCl electrodes
stereomicroscope	Zeiss	Stemi 305	A stereomicroscope allows you to see depth, so you can dissect the tissue more easily
Tris (Trizma base)	Sigma	T1503-1KG	Make a 1M solution to adjust pH of HEPES buffers
Ussing chambers	Sanki Kagaku Kougei		These chambers are custom made continuous perfusion Ussing chambers with a window diameter of 5 mm
Water pump and heating system	Tokyo Rikakikai Co. Ltd.	NTT-110