JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המתוארת כאן היא שיטה מבוססת כדי לקבוע את מידת ההגבלה של HIV-1 על ידי חלבון מעכב תאים SAMHD1. שושלת מיאלואידית אנושית של תאי U937 מתמרים עם וקטור ביטוי SAMHD1 המבטא במשותף YFP, מתמיינים ואז מאותגרים עם HIV-RFP. רמת ההגבלה נקבעת על ידי ניתוח ציטומטריה של זרימה.

Abstract

חלבון סטרילי בעל מוטיב α/היסטידין-אספרטט המכיל חלבון 1 (SAMHD1) מעכב שכפול של HIV-1 בתאים מיאלואידים שקטים. תאי U937 נמצאים בשימוש נרחב כמערכת תאים נוחה לניתוח פעילות SAMHD1 עקב רמה נמוכה של ביטוי RNA SAMHD1, מה שמוביל לביטוי חלבון אנדוגני שאינו ניתן לגילוי. בהתבסס על מבחנים דומים שפותחו במעבדת Stoye כדי לאפיין גורמי הגבלה רטרו-ויראליים אחרים, מעבדת בישופ פיתחה מבחן הגבלה בשני צבעים לניתוח SAMHD1 בתאי U937. מורין לוקמיה חלקיקים דמויי וירוס המבטאים SAMHD1, לצד YFP המתבטא מ-IRES, משמשים להמתרת תאי U937. לאחר מכן מטפלים בתאים ב-phorbol myristate אצטט כדי לגרום להתמיין לפנוטיפ שקט. לאחר ההתמיינות, התאים נגועים בחלקיקים דמויי נגיף HIV-1 המבטאים כתב פלואורסצנטי. לאחר 48 שעות, תאים נקצרים ומנותחים על ידי ציטומטריה של זרימה. שיעור התאים הנגועים ב- HIV באוכלוסייה המבטאת SAMHD1 מושווה לזה שבתאי בקרה פנימיים חסרי SAMHD1. השוואה זו מגלה יחס הגבלה. ביטוי SAMHD1 מוביל להפחתה של פי חמישה בהידבקות ב- HIV, המתאים ליחס הגבלה של 0.2. ההחלפה האחרונה שלנו של RFP עבור GFP המקורי כגן המדווח להידבקות ב- HIV הקלה על ניתוח ציטומטריה של זרימה.

בדיקה זו שימשה בהצלחה לאפיון ההשפעה של תחליפי חומצות אמינו על הגבלת SAMHD1 על ידי התמרה עם וירוסים המקודדים חלבוני SAMHD1 שהשתנו, שמקורם במוטגנזה מכוונת אתר של וקטור הביטוי. לדוגמה, החלפות האתר הקטליטי HD206-7AA מראות פנוטיפ הגבלה של 1, המציין אובדן פעילות הגבלה. באותה מידה, ניתן לקבוע את הרגישות של וירוסים בודקים שונים. ניתן להתאים את הבדיקה עוד יותר כדי לשלב את ההשפעה של מצב ההתמיינות, מצב חילוף החומרים ומשנים של SAMHD1 כדי להבין טוב יותר את הקשר בין SAMHD1, מצב חילוף החומרים של התא והגבלה נגיפית.

Introduction

חלבון סטרילי בעל מוטיב α/היסטידין-אספרטט המכיל תחום 1 (SAMHD1) מעכב שכפול של נגיף הכשל החיסוני האנושי מסוג 1 (HIV-1) בתאים שקטים של השושלת המיאלואידית. SAMHD1 חוסם את השכפול באמצעות פעילותו האנזימטית כטריפו-הידרולאז dNTP, מה שגורם לירידה ברמות של dNTPs תוך-תאיים. כתוצאה מכך, HIV-1 אינו יכול לבצע את תהליך השעתוק ההפוך ביעילות. התקדמות רבה הושגה בשנים הספורות שחלפו מאז תצפית ראשונית זו, במיוחד בנוגע לתרומתם של תחומים ספציפיים וחומצות אמינו לפעילות האנטי-ויראלית של SAMHD1. תובנות אלה נעשו באמצעות מבחנים ביוכימיים, כמו גם מערכות תאים המחקות את הסביבה המיאלואידית הרלוונטית מבחינה פיזיולוגית. תאי U9371 נמצאים בשימוש נרחב כמערכת תאים מיאלואידית נוחה לניתוח פעילות SAMHD1. הסיבה לכך היא מחסור בביטוי SAMHD1 אנדוגני, שנחשב לתוצאה של רמות RNA נמוכות בהשוואה לתאים המבטאים SAMHD1 (תחום מחקר מתמשך). כאן, הפרוטוקול מתאר את ההתמרה החולפת של תאי U937 עם חלקיקים דמויי וירוס המבטאים יחד SAMHD1 וכתב חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) כדי לבחון את המנגנון של הגבלת SAMHD1 של HIV-1. מבחני ציטומטריה של זרימה דו-צבעית חולפת כזו לבחינת הגבלות רטרו-ויראליות פותחו לראשונה במעבדת Stoye2 ומאז הותאמו כדי לחקור גורמי הגבלה אחרים, כולל חלבוני המוטיב המשולש (TRIM)3. בהשראת מבחנים אלה, מעבדת בישופ פיתחה בדיקה בשני צבעים לניתוח הגבלת SAMHD1 בתאי U937.

זרימת העבודה של הניסוי מוצגת באיור 1. חלקיקים דמויי נגיף לוקמיה מורין (MLV) המכילים מסר דו-ציסטרוני המקודד SAMHD1 לצד YFP המבוטא מ-IRES משמשים להמרת תאי U937. לאחר מכן מטפלים בתאים ב-phorbol myristate acetate (PMA) כדי לגרום להתמיין לפנוטיפ שקט. התאים נגועים לאחר מכן בחלקיקים דמויי נגיף HIV-1 המבטאים חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP). לאחר 48 שעות, התאים נקטפים ומנותחים על ידי ציטומטריה של זרימה בשני צבעים. בדיקה זו משמשת גם עם YFP וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), הדורשים שילובי מסננים פחות סטנדרטיים לניתוח ציטומטריה של זרימה. השימוש ב- HIV-RFP מאפשר פיצוי פשוט יותר ולכן הבדיקה נגישה יותר למשתמשי ציטומטריית זרימה פחות מנוסים, וניתנת להשגה עם רוב הציטומטרים.

במהלך הניתוח, משווים את שיעור התאים הנגועים ב-HIV בין תאים המבטאים SAMHD1 לבין תאים חסרי SAMHD1 בתוך אותה באר של תאים. זה מאפשר בקרה פנימית בצינור ציטומטריה של באר/זרימה, שהיא תכונה מרכזית. השוואת רמות ההדבקה בתאים מותמרים ולא מותמרים מגלה יחס הגבלה. יחס של 1.0 מציין כי לגורם המתמר אין השפעה על ההדבקה. ביטוי SAMHD1 מסוג פראי מוביל להפחתה של פי חמישה בהידבקות ב- HIV בבדיקה זו, המתאימה ליחס הגבלה של 0.2. בעוד שאפקט זה צנוע בהשוואה לגורמי הגבלה קלאסיים יותר כגון TRIM5, ההשפעה בכל זאת ניתנת לשחזור ומאפשרת סיווג של מבטאי SAMHD1 שעברו שינוי לאלה המגבילים באופן שווה לחלבון מסוג בר, אלה שאינם מצליחים להגביל, ואלה עם פנוטיפ ביניים.

בדיקה זו שימשה בהצלחה כדי לאפיין את תחום SAMHD1 ואת פנוטיפים להגבלת המוטנטים של חומצות אמינו על ידי התמרה עם וירוסים המקודדים רצפי SAMHD1 מוטנטיים. לדוגמה, החלפות האתר הקטליטי HD206-7AA אינן מצליחות להגביל בבדיקה זו. באותה מידה, ניתן לקבוע את הרגישות של וירוסים בודקים שונים. לדוגמה, מוטנטים של HIV-1 מסוג טרנסקריפטאז הפוך רגישים יותר להגבלה בתיווך SAMHD1 (לדוגמה, 151V4). פרוטוקול זה מתאר את הפרטים של ייצור חלקיקים דמויי וירוס (VLP), התמרה של U937 עם וקטורים ביטוי SAMHD1, זיהום ב- HIV הנושא כתב פלואורסצנטי והניתוח שלאחר מכן על ידי ציטומטריה של זרימה. מאמר זה דן באילו נתונים לצפות וכיצד להימנע מתוצאות לא אופטימליות. לבסוף, מתוארים שימושים חלופיים לבדיקה, בנוסף לבחינת גרסאות שונות של SAMHD1 כדי להבין את יחסי הגומלין בין רמות SAMHD1, dNTP וזיהום ויראלי בצורה יסודית יותר. בהתחשב בתפקיד של SAMHD1 במרכז חילוף החומרים של התאים, עם קישורים נוספים לסרטן, זה ממשיך להיות תחום של עניין אינטנסיבי.

Protocol

פרוטוקול זה אינו מכיל מחקרים כלשהם המערבים בעלי חיים או משתתפים אנושיים שבוצעו על ידי מי מהמחברים. כל השלבים של פרוטוקול זה בוצעו בהתאם להנחיות ולקודים של המוסדות שבהם הם בוצעו.

1. טרנספקציה של 293T תאים לייצור VLP (הן וקטורים של ביטוי SAMHD1 והן חלקיקי HIV בוחן)

הערה: התורמים המשמעותיים ביותר לייצור מוצלח של חלקיקי נגיף הם בריאותם של תאי 293T של היצרן, המפגש בעת ההעברה וזמן הקציר. למעבדות יהיו בדרך כלל ריאגנטים מועדפים על טרנספקציה ופרוטוקול לייצור חלקיקים רטרו-ויראליים. הפרוטוקול הבא מניב חלקיקים זיהומיים באיכות טובה, אך פרוטוקולים מקבילים יתאימו גם ליישום זה. כדי לשמור על תאים באיכות טובה 293T, לעבור לפחות שלוש פעמים בשבוע כדי לשמור על קצב צמיחה קבוע. יש לזרוע תאים בשלב הלוג של הצמיחה לצורך העברה יעילה.

  1. יום 1: זרעו את המספר הנדרש של מנות בקוטר 10 ס"מ עם פיצול של 1/4 מצלחת כמעט משולבת של 293T כדי להניב כ-60% מפגש ביום שלמחרת (כ-5 x 10 תאיםלמ "ל). ייתכן שיהיה צורך לזרוע מספר צפיפויות כדי להשיג צפיפות מתאימה להעברה ביום שלמחרת כאשר עובדים עם מלאי תאים חדש.
  2. יום 2 (בוקר): בדוק כ-60% מפגש באמצעות מיקרוסקופיה והחלף בעדינות את המדיה על התאים ב-10 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו טרי.
  3. יום 2 (אחר הצהריים, לפחות 4 שעות לאחר שינוי המדיה): Transfect לייצור VLP.
    1. הרכיבו את תערובת דילול הדנ"א המכילה 3 מיקרוגרם כל אחד של פלסמיד מבטא gag-pol , פלסמיד מדווח בעל מסוף ארוך (LTR) וחלבון פלסמיד של וירוס סטומטיטיס שלפוחית (VSV-G) פלסמיד אקספרסור (סה"כ 9 מיקרוגרם, ראו הערה) ב-600 μL של DMEM ללא סרום. מערבולת וצנטריפוגה לזמן קצר (15 שניות, >500 x גרם).
    2. הוסיפו 20 μL של ריאגנט טרנספקציה (ראו טבלת חומרים), מערבולת (אל תעשו צנטריפוגה) ודגרה בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך 15-20 דקות. מוסיפים את תערובת הטרנספקציה לצלחת, מערבלים בעדינות כדי לערבב ומחזירים לאינקובטור.
      הערה: עבור MLV VLP המבטא SAMHD1 השתמש ב- KB4 5,6 (פלסמיד מבטא gag-pol), pLGatewaySAMHD1IeYFP1 (פלסמיד כתב מונחה LTR) ו- pczVSV-G7. עבור HIV-RFP VLP, השתמש בעמ' 8.91 8,9 (פלסמיד מבטא gag-pol), SCRPSY10 (פלסמיד מדווח מונחה LTR) ו- pczVSV-G. חלופות נדונות בטבלת החומרים. ייתכן שיהיה צורך למטב את יחסי הפלסמיד עבור מערכות פלסמיד/טרנספקציה שונות.
  4. יום 3 (שעות הבוקר המאוחרות): יש להסיר את המדיה בזהירות מהתאים על ידי פיפטינג, לשטוף ב-5 מ"ל של DMEM טרי ולהחליף ב-5 מ"ל של DMEM טרי.
  5. יום 4 (בוקר): קצור את הנגיף על ידי איסוף הסופרנטנט מהתאים והחלף ב-5 מ"ל של DMEM טרי. העבר את הסופרנטנט המכיל VLP דרך מסנן 0.45 ננומטר, aliquot והעברה ל- -70 °C לאחסון. ודא שהאליקוטים הם בגודל המתאים לניסויים מתוכננים (250 μL כהצעה) מכיוון שמחזורי הפשרה חוזרים ונשנים של הקפאה יגרמו לאובדן של טיטר ויראלי.
  6. יום 5 (בוקר): קציר הנגיף כמו ב 1.5 אבל להשליך את הצלחות לאחר איסוף supernatant.

2. טיטרינג VLP חדש לפני השימוש

  1. יום 1: זרע 293T ב 2 x 105 תאים לכל באר של צלחת 24 באר - 4 בארות לכל וירוס להיות titrated, כולל וירוס של זיהום ידוע עבור כל עמוד השדרה. מטב את צפיפות הזריעה עבור מלאי תאים נתון.
  2. יום 2: התבונן בצלחת כדי לבדוק את המפגש (באופן אידיאלי ~ 70%). הפשירו את הגורם המכיל-הנגיף משלבים 1.5 ו-1.6. הוסף 0, 10, 25 או 100 μL לכל באר.
  3. יום 4 (בוקר): קציר התאים לניתוח על ידי ציטומטריה של זרימה.
    1. הסר את המדיה על ידי צנרת זהירה או שאיפה. שטפו את התאים בעדינות עם 250 μL של מלח חצוב פוספט (PBS). הסר את התאים מהצלחת על ידי צינורות למעלה ולמטה עם 250 μL PBS, ולהעביר לצינור microcentrifuge. הוסף 250 μL של 4% paraformaldehyde (לוקח ריכוז סופי ל 2%).
      אזהרה: פרפורמלדהיד הוא רעיל. אין לערבב אותו עם חומרי חיטוי על בסיס כלור.
    2. גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant ו resuse את גלולת התא ב 200 μL של PBS או חיץ ציטומטריה זרימה חלופית. נתח עבור RFP או YFP לפי הצורך על ידי ציטומטריה של זרימה. לנרמל את ההדבקה של מלאי וירוס נתון כנגד ערכים עבור מלאי של הדבקה ידועה.
      הערה: ניתן לנרמל VLP גם על ידי בדיקת חיסון הקשורה לאנזים p24 (ELISA); עם זאת, זה לא בהכרח אינדיקטור טוב של זיהום VLP, במיוחד כאשר מניות VLP מוכנים transfections שונים. שיטות זיהומיות של תרבית רקמה חציונית שפורסמה או ריבוי זיהומים (TCID50/MOI)11 יכולות גם הן לספק כמות יחסית, אם כי אלה אינן מבוססות היטב עבור MLV. פלואורסצנציה יחסית מספקת חלופה חסכונית לשיטות ELISA מסחריות של טרנסקריפטאז הפוך.

3. התמרה של U937 עם VLP המבטא SAMHD1 ו- YFP

הערה: שלבים 3-6 מהווים את ניסוי ההגבלה. הימים ממוספרים כדי להקל על התכנון.

  1. יום 1 (אחר הצהריים): הפשרה VLP עבור התמרה כולל MLV-Wild-סוג SAMHD1-YFP (בקרה חיובית), MLV-SAMHD1 (HD206-7AA)-YFP (בקרה שלילית) וריאנט MLV-SAMHD1-YFP (דגימות ניסיוניות). דלל את ה-VLP המנורמל לנפח סופי של 500 μL עם מדיה 1640 של מכון הזיכרון של רוזוול פארק (RPMI) בצינור מיקרופוגה, הוסף 0.5 μL של פוליברן (10 מ"ג/מ"ל) וערבב על ידי הבהוב.
    1. אם לא ניתן להגדיר VLP מראש, השתמש ב- 100 μL במקרה הראשון. השתמש ביחס מרבי של 1:1 בין VLP ל-RPMI כדי להגביל את הרעילות הנגרמת על-ידי VLP. יש לשאוף לכ-30% התמרת.
  2. Aliquot 5 x 105 U937 תאים לתוך צינור microfuge סטרילי עבור כל תנאי התמרת. גלולה על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, ולהסיר את supernatant (לכלול שני צינורות נוספים כמו פקדים untransduced עבור ציטומטריה זרימה). יש להשעות את גלולת התא ב-500 μL של VLP מדולל (או RPMI עבור פקדים לא מותמרים) ולהעביר לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות.
  3. סובב בצנטריפוגה שולחנית ב 800 x גרם במשך 90 דקות ב 20 מעלות צלזיוס. הוסף 1 מ"ל של 37 °C RPMI לבאר ולאפשר להתאושש באינקובטור 37 מעלות צלזיוס במשך 3 ימים.

4. הבחנה של U937 מתמר

  1. יום 4 (בוקר): השהה מחדש את התאים על ידי ניתור עדין והעברה של 350 μL לכל אחת מ-4 בארות של צלחת בת 12 בארות. הוסף 700 μL של 37 °C RPMI המכיל 150 nM PMA לכל באר נותן ריכוז סופי של 100 nM ולאפשר להבדיל במשך 3 ימים.
    הערה: PMA נקנה כאבקה ויש להחיות אותו ל-1 מ"מ ב-DMSO ולאחסן אותו בחושך. מלאי עבודה של 100 μM צריך להיות מוכן על ידי דילול 1/10 מן המלאי 1 mM עם DMSO.

5. זיהום של U937 מובחן, SAMHD1 המבטא עם HIV-RFP

  1. יום 7: התבונן בתאים על ידי מיקרוסקופיה. ודא שהתאים דבקים. שאפו את המדיה מכל הבארות, הוסיפו 1 מ"ל של RPMI לבאר 1 מכל סט של 4 ואפשרו שליטה לא מתמרת ולא נגועה, כמו גם פקדי צבע בודדים. הוסף בחזרה 0.5 מ"ל של RPMI המכיל בערך 10 μL של HIV-1-RFP (בערך 10 ng p24 כמדריך) לכל הבארות האחרות. יש לשאוף לכ-50% הדבקה.
  2. יום 8 (בוקר): הוסף 0.5 מ"ל של RPMI לכל אחת מהבארות הנגועות.

6. ניתוח ציטומטריה של זרימה

הערה: מומלץ לכלול כתם חי-מת בצינורות ציטומטריה של זרימה. עם זאת, אם תאי U937 הם באיכות טובה, צעד זה יכול להיות מושמט ללא השלכות שליליות על ניתוח במורד הזרם. צנרת עדינה של תאים טריפסינים אמורה לגרום בקלות להשעיה של תא בודד.

  1. יום 10 (בוקר): שאפו את התקשורת מהבארות ושטפו פעם אחת עם PBS. יש להוסיף 300 μL של אנזים דיסוציאציה של התא (או טריפסין) למשך 5-10 דקות. הוסיפו עוד 300 מיקרון של PBS, השעו היטב את ההקפדה על כך שכל התאים ירדו מהצלחת, והעבירו לצינורות ציטומטריה זורמים.
  2. הוסף 300 μL של 4% paraformaldehyde (לוקח ריכוז סופי ל 2%). גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם במשך 5 דקות, להשליך את supernatant ו resuse את גלולת התא ב 200 μL של PBS או חיץ ציטומטריה זרימה חלופית. ניתוח על ידי ציטומטריה של זרימה.
    הערה: השלבים שלהלן הם עבור מנתח Fortessa, אך ניתן להשיג ניתוח שווה ערך באמצעות כל מנתח המסוגל לקרוא פלואורסצנציה RFP ו- YFP. התייעץ עם תמיכה בציטומטריה של זרימה מקומית או עם חוקר מנוסה אחר לפני שתגדיר ניתוח ציטומטריה של זרימה. כאשר דגימות רבות צריכות לעבור סינון בו-זמנית, דוגם בעל תפוקה גבוהה עשוי להיות מתאים. במקרה זה, מומלץ מספר תא גדול יותר ונפח.

7. ניתוח ציטומטריה של זרימה

  1. הפעל את הציטומטר 10 דקות לפני שהוא נדרש והפעל את המחשב. בדקו שהפסולת ריקה ושמיכל הנדן מלא.
  2. היכנס למכונה ופתח את תוכנת הניתוח.
  3. הזז את הזרוע הצידה, הורד את צינור המים, הגדר את קצב הזרימה לגבוה ולחץ על Prime. חכו שהאור יכבה וחזרו על הפעולה שלוש פעמים נוספות.
  4. החזירו את המים לפעולה ורצו גבוה למשך 3 דקות ואז עברו ל-Low ולחצו על Standby עד להמשך הרכישה.
  5. בינתיים הגדר את הניסוי בתוך התוכנה:
    1. בחר ניסוי / ניסוי חדש (שם בהתאם להנחיות המקומיות). במפקח, מחק את הפלואורוכרומים הלא נדרשים, והשאיר לייזר כחול 530/30 ולייזר צהוב 610/20 או את שילובי הלייזר והמסנן המומלצים עבור YFP ו- RFP עבור המכונה.
    2. לחץ לחיצה ימנית על הניסוי ובחר הגדרות ציטומטר / הגדרות יישום / צור גליון עבודה. בגליון העבודה, צור כתם נקודה של אזור פיזור קדימה (FSC-A)/אזור פיזור צדדי (FSC-A) והיסטוגרמה של YFP, היסטוגרמה של RFP וכתם נקודות GFP/YFP על-ידי לחיצה על הסמל המתאים ושינוי הצירים על-ידי לחיצה על תווית הציר.
    3. לחץ לחיצה ימנית שוב על ניסוי והוסף דגימה חדשה. שנה את השם בהתאם לצורך. פתח את הדגימה על ידי לחיצה על סימן הפלוס כדי לחשוף צינור חדש.
  6. פתח את לוח המחוונים של הרכישה מתוך תצוגה, טען את הפקד הלא נגוע והלא מתומר ולחץ על רכוש. התאם את מתחי ה-FSC וה-SSC בלוח המחוונים כדי למקם תאים ברביע השמאלי התחתון (ללא תאים בצירים ). שער סביב אוכלוסייה זו P1. לחץ לחיצה ימנית על מגרשים אחרים ובחר הצג P1 כדי להסיר פסולת מהניתוח הבא.
  7. טען את פקד הצבע היחיד עבור YFP (SAMHD1 מסוג פראי בלבד) ורכוש. התאם את מתח ה-YFP בלוח המחוונים כך שהתאים הפלואורסצנטיים ביותר יהיו בטווח הגלאי (לא בקצה הציר). חזור על הפעולה לקבלת בקרת RFP בצבע יחיד.
  8. הפעל פיצוי אוטומטי באמצעות הפקדים הלא מותמרים, הלא נגועים והצבע היחיד.
    1. בחר ניסוי > הגדרת פיצוי > צור פקדי פיצוי מהתפריט כדי לעבור לגליון עבודה רגיל. בחר גליון עבודה רגיל לא מוכתם, לחץ על הפעל ורכוש עבור הפקד הלא מוכתם.
    2. צייר שער סביב התאים השלמים (P1) והקליט. הסר את הצינור והנח את המכונה במצב המתנה. לחץ לחיצה ימנית על P1, לחץ על החל על כל בקרות הפיצוי.
    3. עבור לגליון העבודה הרגיל של RFP והקש על הפעל. הקלט את פקד ה-RFP בצבע יחיד והעבר את ההתקן למצב המתנה. התוכנה צריכה לבחור באופן אוטומטי את האוכלוסייה החיובית.
    4. חזור על הפעולה לבקרת צבע יחידה של YFP. בחר ניסוי > הגדרת פיצוי > חשב פיצוי > קישור ושמירה.
  9. עבור לגליון העבודה הכללי. רכשו את התאים המותמרים בסוג פראי SAMHD1, נגועים ב- HIV-RFP ובדקו כי ניתן לראות ארבע אוכלוסיות שונות בפינות הרבעים המיושרות אנכית ואופקית עבור YFP ו- RFP, בהתאמה. הסר את הצינור ולחץ על המתנה.
  10. טען מחדש את הדגימה הלא מתומרת והלא נגועה, לחץ על הפעל והקלט 30,000 אירועים עם P1 כשער העצירה. חזור על הפעולה עבור הדגימות הנותרות (כולל פקדים אחרים). שנה את שמות הדוגמאות תוך כדי ריצה או לאחר הוק. לאחר הייצוא, לא ניתן לשנות את שמות הקבצים.
  11. ייצא את הנתונים כקבצי .fcs ונקה את הנוזלים בהתאם להוראות המקומיות.

8. ניתוח נתונים

הערה: השלבים הבאים תואמים לניתוח ב- FlowJo v10; עם זאת, ניתן לבצע בקלות שלבים מקבילים בתוכנות ניתוח אחרות.

  1. פתח את התוכנה וגרור את כל קבצי ה- .fcs ללוח המחוונים. בחרו בפקדי הפיצוי וגררו אותם לתיקיית המשנה 'פיצוי'. פתח את הקובץ עבור הצינור הלא מתומר, הלא נגוע על ידי לחיצה כפולה, אשר יעלה את העלילה FSC-A/SSC-A.
  2. בחרו בכלי המצולע ובשער על אוכלוסיית התאים השלמים, למעט לכלוך בפינה השמאלית התחתונה. תן שם לתאים אלה. גרור שער זה על כל אוכלוסיית הצינורות בסרגל כל הדגימות . גלול בין כל דגימה בנפרד באמצעות לחצני החצים האופקיים כדי לוודא שהחיתוך מתאים לכל צינור.
  3. לחץ פעמיים על אוכלוסיית התאים עבור הדגימה הלא מותמרת והלא נגועה והתאם את הצירים לגובה FSC (H) לעומת אזור FSC (A). בחר את האוכלוסייה הגדולה היחידה באמצעות שער מלבני כדי לא לכלול כפילים. התוכנה תציע באופן אוטומטי לתת שם לתאים בודדים אלה.
  4. גרור שער זה אל כל אוכלוסיות התאים ושוב, בדוק שה- gating מתאים לכל הדגימות. בחר את אוכלוסיית התאים הבודדים עבור הדגימה הלא נגועה והלא מותמרת, שנה את הצירים ללייזר כחול מפוצה (y , YFP) לעומת לייזר צהוב מפוצה (x, RFP). לחץ על T על הציר ובחר קנה מידה דו-אקספוננציאלי עבור x ו- y.
  5. בחר בכלי Gating מרובע ולחץ בקצה הימני העליון של אוכלוסיית התאים השליליים. החל חלוקה ראשונית זו על כל אוכלוסיות התאים הבודדים על-ידי גרירה לסרגל ' כל הדגימות' . כאשר שערי הרבעים אינם מפרידים בין האוכלוסיות באופן משביע רצון, ייתכן שיהיה צורך לשער רבעים בודדים באמצעות כלי המצולע, כמו באיור 2.
  6. גלול אל הדוגמה של SAMHD1 מסוג פראי בלבד (YFP בלבד) ובדוק שההבחנה בין הלא-טרנספונד (YFP שלילי) לחיובית של YFP נכונה. זה עשוי לעזור לעבור לתצוגת קווי מתאר כדי להבחין בין שלילי לתאי YFP עמומים. אם תאי YFP +ve העליונים ביותר מפוזרים באופן נרחב, התאם את השער האנכי העליון ימינה.
  7. גלול בין כל הדוגמאות ובדוק את ה- gating ביחס לחיוביות של YFP. השתמש בחלוקה הטובה ביותר בין YFP שלילי לחיובי שתקף לכל הדגימות.
    הערה: הפיצוי יחושב על בסיס רמת הביטוי SAMHD1 YFP מהסוג הפראי. אם רמות הזיהום שונות מאוד בין תאים מתמרים שונים של SAMHD1-YFP, ייתכן שיהיה צורך להתאים את הפיצוי. לכן עדיף כי YFP VLP מנורמל לפני השימוש.
  8. גלול אל הצינור הנגוע ב- HIV-RFP שאינו מותמר ובדוק אם ההבחנה בין RFP שלילי לא נגוע לחיובי RFP נגוע נכונה. התאם בהתאם לצורך, השתמש בתצוגת קווי המתאר במידת הצורך וגלול בין הדוגמאות הנותרות כדי לבדוק שה- gating תקף עבור כל הדגימות.
  9. כל דגימה דורשת שליליות כפולות (Q4: שמאל למטה, לא מותמר, לא נגוע), YFP חיובי (Q1: שמאל למעלה, SAMHD1 מבטא, לא נגוע), חיובי RFP (Q3: ימין למטה, לא מותמר, נגוע ב- HIV), וחיובי כפול (Q2: ימין למעלה, SAMHD1 המבטא נגוע ב- HIV). פתח את עורך הטבלה על ידי לחיצה על הסמל וגרור את ארבעת שערי הרביע ללוח המחוונים. בחר ייצוא Excel ולחץ על צור טבלה. שמור את הגיליון האלקטרוני שנוצר בהתאם למוסכמות מקומיות למתן שמות לקבצים.
  10. כדי לייצא ייצוגים של מגרשים ואסטרטגיות גימור, לחץ על הסמל עורך פריסה . בחר כל אוכלוסייה וגרור לעורך עם הצירים, התוויות והמרווחים הנדרשים.
  11. כדי ליצור פריסה עם אותן התלוויות המוצגות עבור כל הדגימות, בחר עמודה אחת ולחץ על אצווה. הקש על קנה מידה לרוחב ולאחר מכן הימנע ממעברי עמוד. שמור בתבנית הקובץ הנדרשת.
  12. בגיליון האלקטרוני המיוצא, חשב את יחס ההגבלה על-ידי יצירת עמודות של אחוז RFP של YFP-ves (RFP+ve / (שליליות כפולות + RFP+ve)) ואחוז RFP של YFP+ves (חיובי כפול / (חיובי כפול + YFP+ve)) ולאחר מכן עמודה סופית של (%RFP של YFP+ve / %RFP של YFP-ve), ראה איור 1. ממוצע נתוני השכפול עבור כל מבנה SAMHD1 וחישוב אם ערכי ההגבלה עבור גרסאות SAMHD1 שנבדקו שונים באופן משמעותי מסוגים פראיים ו/או 206-7AA באמצעות תוכנת ניתוח נתונים מתאימה.

תוצאות

תוצאות הניתוח לעיל אמורות להניב יחס הגבלה של 0.25 ומטה עבור הבקרה החיובית SAMHD1 מסוג פראי, ו-1.0 עבור הבקרה השלילית. אם שתי בדיקות בקרת איכות אלה תקפות, שקול את המובהקות הסטטיסטית של התוצאות. גרסאות SAMHD1 שאינן מראות הבדל משמעותי מסוג פראי נושאות לפיכך תחליפים שאינם משפיעים על הגבלת SAMHD1 בהקשר זה. אלה השונים באופן משמעותי מסוג פראי מראים הגבלה לקויה. אם אלה אינם שונים באופן משמעותי מהשליטה השלילית, אז הם חסרים את היכולת להגביל בהקשר זה (איור 4 לוחות שמאליים).

אם ערך ההגבלה של SAMHD1 מסוג פראי גדול מ-0.3, התוצאות עבור וירוסים בודקים עשויות להיות אינדיקטיביות, אך לא ניתן להסתמך עליהן. הגבלה לא יעילה של חלבון מסוג בר עלולה לנבוע משימוש מוקדם מדי בתאי U937 לאחר ההחלמה מחדש (תוך שבועיים), או כאשר הם מבוגרים מדי (>2-3 חודשים). ייתכן שיהיה צורך לקבוע פרמטרים אלה באופן אמפירי עבור מלאי תאים נתון. בדרך כלל, ככל שהמעבר נמוך יותר, כך התאים מתמיינים בצורה אמינה יותר ולכן מספקים את הסביבה המתאימה להגבלת SAMHD1. רמת הדבקה בלתי הולמת עם SAMHD1-YFP או HIV-RFP עלולה גם לגרום לקשיים הן בפיצוי והן בקביעת יחס ההגבלה במורד הזרם. דוגמה לכך מודגמת בלוחות הימניים של איור 4.

אם הבקרה השלילית חורגת מ-1.0 (מחוץ לטווח של 0.9-1.2), הדבר עשוי להצביע על בעיה בניתוח, או ששיעור התאים הנגועים, אסטרטגיית ה-gating או בריאות התאים משפיעים על הבדיקה. עיין בהערות לעיל.

figure-results-1457
איור 1: פרוטוקול מתאר סכמטי. VLP, חלקיקים דמויי וירוס, PMA, phorbol myristate אצטט. השלבים הממוספרים תואמים לשלבים בפרוטוקול. איור שהופק באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-1954
איור 2: סכימה של פלסמידים רטרו-ויראליים . (A) וקטורי אריזה (B) וקטורי העברה (C) מבעבע מעטפת VSV-G. רכיבי קידוד ורגולציה מרכזיים מוצגים. לפרטים ראו את טבלת החומרים. CMV IE: מקדם ציטומגלווירוס מיידי-מוקדם, BGH: הורמון גדילה בקר, pA: polyA, RRE: אלמנט תגובת Rev, CMV-LTR: מקדם CMV-HIV-1 LTR מרוכב, Psi: אות אריזה HIV-1, cPPT / CTS: מערכת פוליפורין מרכזית / רצף סיום מרכזי, SV40: וירוס vacuolating simian 40. איור שהופק באמצעות BioRender.com. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-2798
איור 3: אסטרטגיית גיטינג לניתוח ציטומטריה של זרימה. (A) בקרות פיצוי: הפאנל השמאלי מציג FSC-A/SSC-A על תאים בתוך טקט עבור הבקרה הלא מתמרת והלא נגועה. חלוניות מרכזיות וימניות מציגות צילומי מסך של פקדי פיצוי בצבע יחיד עבור YFP (אמצע) ו- RFP (מימין) עם נתונים ללא פיצוי בשחור ופיצוי בכחול. (ב) מטריצת פיצויים מתאימה ומגרשים לבקרת פיצויים לעיל. (ג) אסטרטגיית גטינג. פסולת מסולקת באמצעות ניתוח של כל התאים על ידי FSC-A/SSC-A (פאנל שמאלי). כפילים אינם נכללים על-ידי סימון בגובה FSC לעומת שטח (לוח מרכזי). הלוח הימני מציג דוגמה להגבלת HIV-1 על ידי SAMHD1 מסוג פראי. הצירים מראים פלואורסצנטיות לייזר כחולה וצהובה מפוצצת המתאימה לתאים חיוביים ל-YFP (SAMHD1) ול-RFP (HIV) בהתאמה. שערים מרובעים משורטטים באמצעות השוואה של פקדים שליליים ובצבע יחיד עבור RFP ו- YFP. המספרים מציינים אחוז מאוכלוסיית ההורים. ערכי הפיצוי עבור YFP עם GFP יהיו גבוהים בהרבה אך ניתן להפלות באמצעות ערכות מסננים מתאימות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

figure-results-4069
איור 4: תוצאות צפויות: נתונים אידיאליים לעומת נתונים לא אופטימליים. (A) חלקות YFP/RFP מייצגות לנתונים אופטימליים (משמאל) ולא אופטימליים (מימין). המספרים מציינים אחוז מאוכלוסיית ההורים. בפאנל הימני, הידבקות ב- HIV נמוכה מדי ויוצרת קשיים עם פיצוי וגאט. יחס ההגבלה גבוה מהצפוי ועומד על 0.5. (B) חלקות של יחס הגבלה עבור גרסאות של SAMHD1 ביחס לסוג פראי (WT, אדום) או הבקרה השלילית (HD206-7AA, שחור) שנוצרה באמצעות תוכנה סטטיסטית. כל נקודה מייצגת ערך משוכפל. ממוצע וסטיית תקן מוצגים. מבחני t זוגיים בין כל קבוצה היו משמעותיים בכל המקרים הצפויים היכן שהוצגו. משמאל: נתונים אידיאליים - WT מראה את ההגבלה הצפויה של כ 0.2, שלילי מראה 1.0. הגרסה R372D (אפורה) שונה משמעותית מ-WT אך לא משמעותית מהשליטה השלילית ולכן איבדה את היכולת להגביל. מימין: נתונים לא אופטימליים. כאן, השלילי מתנהג כצפוי אך בכל ששת המשוכפלים ה- WT מראה רק יחס הגבלה של 0.5, בשל שיעור הדבקה נמוך. השונות הנמוכה בתוך הקבוצות פירושה R143H מראה פנוטיפ ביניים שונה סטטיסטית מ-WT ושלילי, בעוד ש-G209S אינו מגביל; עם זאת, יש לחזור על כך עם תאים טריים מכיוון שהבקרה החיובית לא נתנה את יחס ההגבלה הצפוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.

Discussion

כפי שנדון בהערות לעיל, ההיבטים הקריטיים של הפרוטוקול מתרכזים סביב שמירה על פנוטיפ התא הנכון לייצור VLP וליצירת הסביבה המתאימה לשמירה על הגבלת SAMHD1. ראשית, הניתוח המדויק של הגבלה על ידי ציטומטריה של זרימה בשני צבעים מסתמך על השגת פרופורציות מתאימות של תאים מתמרים ונגועים, כך שיש מספיק תאים בכל אזור של העלילה לניתוח. ככזה, על החוקר לכוון ל-MOI של פחות מ-1 (ראו פרוטוקול). שיעורי התמרה וזיהום גבוהים מדי או נמוכים מדי מובילים לבעיות בניתוח עקב מחסור בתאים לא נגועים או נגועים כפליים. באותה מידה, קצב התמרה דומה עבור וקטורים SAMHD1 שיש להשוות הוא המפתח לאפשר את אותה מטריצת פיצוי ו- gating להיות מיושם על הניסוי כולו, הגדלת הביטחון בניתוח הבא.

שנית, גילם של תאי U937 שבהם נעשה שימוש הוא גורם מפתח בשאלה אם הם מתמיינים בהצלחה. ניתן לעקוב אחר הבחנה מוצלחת באמצעות תצפית על דבקות, החמצה מופחתת של המדיה לאורך זמן בעקבות הבחנה והגבלה נאותה על ידי סוג פראי של שליטה חיובית בבדיקה. בידול של עד 5 ימים היה מוצלח.

אחד היתרונות המרכזיים של בדיקה זו הוא הגמישות שלה. ניתן לבדוק מגוון גרסאות שונות של SAMHD1 (תחומים, חומצות אמינו, רצפי מינים) באמצעות מוטגנזה פשוטה מכוונת אתר של הווקטור או השיבוט. באותה מידה, ניתן לחקור גרסאות של נגיף הבודק. הבדיקה שימשה בעבר כדי להוכיח כי מוטציות של HIV-1 טרנסקריפטאז הפוך עם יכולת מופחתת לקשור dNTP רגישות יותר להגבלת SAMHD1. אותו עיקרון יכול לשמש כדי לבדוק את ההגבלה של וירוסים אחרים על ידי SAMHD1. יתר על כן, ניתן להשתמש בתנאי התמיינות משתנים או במניפולציה מלאכותית של ריכוזי dNTP תוך-תאיים כדי לחקור עוד יותר את האינטראקציה בין תנאים תוך-תאיים לבין פעילות SAMHD1, תחום מחקר פעיל במעבדת בישופ. תוארה גם האינטראקציה של SAMHD1 עם מעכבי נוקלאוזיד הפוך טרנסקריפטאז שונים, וההשפעה של SAMHD1 שהוצגה באמצעות בדיקה זו שונתה לשימוש בתאים ראשוניים12,13,14,15.

התאמת הפרוטוקול לשימוש בתאים ראשוניים מתגברת על המגבלה הנשקפת מבדיקת פנוטיפים מטבוליים בתאים מותמרים. עם זאת, הפורמט הקיים מאפשר פרוטוקול נוח ופחות מאתגר מבחינה טכנית לניתוח תפוקה גבוהה, במיוחד עם שימוש בציטומטר זרימה עם דוגם בעל תפוקה גבוהה. בעת התאמת הפרוטוקול, יש לקחת בחשבון את הרגישות של התאים הפנימיים שאינם מותמרים להשפעות של עוברי אורח (למשל, איתות חיסוני).

כמו בהיבטים רבים של ביולוגיה של התא, חיוני שמבחנים כאלה ישמשו כחלק מגישה הוליסטית להבנת תופעה נתונה. השימוש המקביל במבחנים ביוכימיים לפעילות SAMHD116, כימות מאגרי dNTP תוך-תאיים, ותצפית על פנוטיפים מוטנטיים של SAMHD1 בבני אדם, ex vivo ובמודלים של בעלי חיים (המבוצעים על ידי מעבדות ברחבי העולם, חלקן מתוארות בגיליון זה) הם המפתח להבנה המתפתחת של חלבון מורכב זה.

Disclosures

לצורך גישה פתוחה, המחברים החילו רישיון זכויות יוצרים ציבורי CC BY על כל גרסה של כתב יד מקובל של המחבר הנובעת מהגשה זו. הדעות המובעות הן של המחבר(ים) ולאו דווקא של NIHR או של מחלקת הבריאות והטיפול הסוציאלי.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי מכון פרנסיס קריק, המקבל את מימון הליבה שלו מ- Cancer Research UK (FC001042 ו- FC001162), המועצה הבריטית למחקר רפואי (FC001042 ו- FC001162), וקרן Wellcome (FC001042 ו- FC001162) ועל ידי פרס חוקר האמון של Wellcome ל- JPS (108012 / Z / 15 / Z). העבודה באוניברסיטת קיימברידג' מומנה במשותף על ידי מרכז המחקר הביו-רפואי NIHR בקיימברידג', קרן אוולין (16/21), קרן רוזטריס (M590) והמועצה הבריטית למחקר רפואי (MR/S009752/1). הפרס האחרון במימון בריטניה הוא חלק מתוכנית EDCTP2 הנתמכת על ידי האיחוד האירופי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
293T cellsATCCCRL-3216
0.45 µm syringe filtersSartoriusFCT122
10 cm dishesCorning430167virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance
12 well platesGreiner665180
24 well platesGreiner662160
BD LSRFortessa cell analyzerBD Bioscience649225alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence
DMEMSigmaD6429ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate. 
DMSOFisherBP-231-100
fetal bovine serumGibco10500064
FlowjoBD Bioscience-alternative analysis software can be used
light microscope--Any bright field light microscope
p8.91--HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)
paraformaldehyde (4 % in PBS)Alfa AesarJ61889
PBSSigmaD8537
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)ThermoFisher15140122
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)SigmaP8139
polybreneSigmaTR-1003
pKB4--Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)
pLGatewaySAMHD1eYFP--MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY
FP		--As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues
PrismGraphpad-https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable
pVSV-G--VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)
RPMIThermoFisher21875034
screw-cap tubesStarLabE1415-2231
SCRPSY--HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/
stripettes 10 mLCorning10084450
stripettes 5 mLCorning10420201
TrypLE expressGibco12604021Trypsin will also be suitable
TurbofectThermoFisherR0531alternative transfection reagents will also work well
U937 cellsATCCCRL-1593.2

References

  1. Sundström, C., Nilsson, K. Establishment and characterization of a human histiocytic lymphoma cell line (U-937). International Journal of Cancer. 17 (5), 565-577 (1976).
  2. Bock, M., Bishop, K. N., Towers, G., Stoye, J. P. Use of a transient assay for studying the genetic determinants of Fv1 restriction. Journal of Virology. 74 (16), 7422-7430 (2000).
  3. Yap, M. W., Nisole, S., Lynch, C., Stoye, J. P. Trim5alpha protein restricts both HIV-1 and murine leukemia virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (29), 10786-10791 (2004).
  4. Arnold, L. H., et al. Phospho-dependent regulation of SAMHD1 oligomerisation couples catalysis and restriction. PLoS Pathogens. 11 (10), 1005194 (2015).
  5. Groom, H. C. T., et al. Absence of xenotropic murine leukaemia virus-related virus in UK patients with chronic fatigue syndrome. Retrovirology. 7, 10 (2010).
  6. Mothes, W., Boerger, A. L., Narayan, S., Cunningham, J. M., Young, J. A. Retroviral entry mediated by receptor priming and low pH triggering of an envelope glycoprotein. Cell. 103 (4), 679-689 (2000).
  7. Pietschmann, T., et al. Foamy virus capsids require the cognate envelope protein for particle export. Journal of Virology. 73 (4), 2613-2621 (1999).
  8. Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272 (5259), 263-267 (1996).
  9. Bainbridge, J. W., et al. In vivo gene transfer to the mouse eye using an HIV-based lentiviral vector; efficient long-term transduction of corneal endothelium and retinal pigment epithelium. Gene Therapy. 8 (21), 1665-1668 (2001).
  10. Kane, M., et al. Identification of interferon-stimulated genes with antiretroviral activity. Cell Host and Microbe. 20 (3), 392-405 (2016).
  11. Gao, Y., et al. Calculating HIV-1 infectious titre using a virtual TCID50 method. Methods in Molecular Biology. 485, 27-35 (2009).
  12. Ordonez, P., et al. SAMHD1 enhances nucleoside-analogue efficacy against HIV-1 in myeloid cells. Scientific Reports. 7, 42824 (2017).
  13. Ballana, E., et al. SAMHD1 specifically affects the antiviral potency of thymidine analog HIV reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4804-4813 (2014).
  14. Huber, A. D., et al. SAMHD1 has differential impact on the efficacies of HIV nucleoside reverse transcriptase inhibitors. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 58 (8), 4915-4919 (2014).
  15. Amie, S. M., et al. Anti-HIV host factor SAMHD1 regulates viral sensitivity to nucleoside reverse transcriptase inhibitors via modulation of cellular deoxyribonucleoside triphosphate (dNTP) levels. The Journal of Biological Chemistry. 288 (28), 20683-20691 (2013).
  16. Arnold, L. H., Kunzelmann, S., Webb, M. R., Taylor, I. A. A continuous enzyme-coupled assay for triphosphohydrolase activity of HIV-1 restriction factor SAMHD1. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 59 (1), 186-192 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

1721 HIV 1SAMHD1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved