İnsan Miyeloid U937 Hücrelerinde Akış Sitometrisi ile SAMHD1 Kısıtlamasının Analizi

Özet

Burada açıklanan, hücresel inhibitör protein SAMHD1 tarafından HIV-1 kısıtlamasının derecesini belirlemek için kurulmuş bir yöntemdir. İnsan miyeloid soy U937 hücreleri, YFP'yi birlikte eksprese eden bir SAMHD1 ekspresyon vektörü ile dönüştürülür, farklılaştırılır ve daha sonra HIV-RFP ile zorlanır. Kısıtlama seviyesi akım sitometri analizi ile belirlenir.

Özet

Steril α motifli / histidin-aspartat alan içeren protein 1 (SAMHD1), sessiz miyeloid hücrelerde HIV-1'in replikasyonunu inhibe eder. U937 hücreleri, düşük seviyede SAMHD1 RNA ekspresyonu nedeniyle SAMHD1 aktivitesini analiz etmek için uygun bir hücre sistemi olarak yaygın olarak kullanılır ve bu da tespit edilemeyen endojen protein ekspresyonuna yol açar. Diğer retroviral kısıtlama faktörlerini karakterize etmek için Stoye laboratuvarında geliştirilen benzer testlere dayanarak, Bishop laboratuvarı U937 hücrelerinde SAMHD1'i analiz etmek için iki renkli bir kısıtlama testi geliştirdi. Murin Lösemi SAMHD1'i eksprese eden virüs benzeri parçacıklar, bir IRES'ten ifade edilen YFP'nin yanı sıra, U937 hücrelerini dönüştürmek için kullanılır. Hücreler daha sonra sessiz bir fenotipe farklılaşmayı indüklemek için forbol miristat asetat ile muamele edilir. Farklılaşmayı takiben, hücrelere floresan bir muhabiri ifade eden HIV-1 virüsü benzeri parçacıklar bulaşır. 48 saat sonra, hücreler toplanır ve akış sitometrisi ile analiz edilir. SAMHD1 eksprese eden popülasyondaki HIV ile enfekte hücrelerin oranı, SAMHD1'den yoksun iç kontrol hücrelerindekiyle karşılaştırılmıştır. Bu karşılaştırma bir kısıtlama oranını ortaya koymaktadır. SAMHD1 ekspresyonu, HIV enfeksiyonunda 0.2'lik bir kısıtlama oranına karşılık gelen beş kat azalmaya yol açar. Son zamanlarda HIV enfeksiyonu için muhabir gen olarak orijinal GFP yerine RFP'yi ikame etmemiz, akış sitometri analizini kolaylaştırmıştır.

Bu tahlil, amino asit ikamelerinin SAMHD1 kısıtlaması üzerindeki etkisini, ekspresyon vektörünün bölgeye yönelik mutagenezinden türetilen değiştirilmiş SAMHD1 proteinlerini kodlayan virüslerle dönüştürerek karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Örneğin, HD206-7AA katalitik alan ikameleri, kısıtlama aktivitesinin kaybolduğunu gösteren 1'lik bir kısıtlama fenotipi gösterir. Aynı şekilde, farklı test edici virüslerin duyarlılığı da belirlenebilir. Tahlil, SAMHD1, hücre metabolik durumu ve viral kısıtlama arasındaki ilişkiyi daha iyi anlamak için farklılaşma durumunun, metabolik durumun ve SAMHD1 değiştiricilerin etkisini içerecek şekilde daha da uyarlanabilir.

Giriş

Steril α motifli / histidin-aspartat alan içeren protein 1 (SAMHD1), miyeloid soyunun sessiz hücrelerinde İnsan İmmün Yetmezlik Virüsü tip 1'in (HIV-1) replikasyonunu engeller. SAMHD1, bir dNTP trifosfohidrolaz olarak enzimatik aktivitesi yoluyla replikasyonu bloke eder, bu da hücre içi dNTP seviyelerinin azalmasına neden olur. Sonuç olarak, HIV-1 ters transkripsiyon işlemini verimli bir şekilde gerçekleştiremez. Bu ilk gözlemden bu yana geçen birkaç yıl içinde, özellikle spesifik alanların ve amino asitlerin SAMHD1'in antiviral aktivitesine katkısı konusunda çok ilerleme kaydedilmiştir. Bu içgörüler, biyokimyasal testlerin yanı sıra fizyolojik olarak ilgili sessiz miyeloid ortamını taklit eden hücre sistemleri kullanılarak yapılmıştır. U937 hücreleri¹ , SAMHD1 aktivitesini analiz etmek için uygun bir miyeloid hücre sistemi olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bunun nedeni, SAMHD1 ekspresyonuna kıyasla düşük RNA seviyelerine bağlı olduğu düşünülen endojen SAMHD1 ekspresyonunun eksikliğidir (devam eden bir araştırma alanı). Burada, protokol, SAMHD1'in SAMHD1 kısıtlamasının mekanizmasını incelemek için U937 hücrelerinin SAMHD1'i birlikte eksprese eden virüs benzeri parçacıklarla ve sarı bir floresan protein (YFP) muhabiriyle geçici transdüksiyonunu açıklamaktadır. Retroviral kısıtlamaları incelemek için bu tür geçici iki renkli akış sitometri testleri ilk olarak Stoye laboratuvarı^2'de geliştirildi ve o zamandan beri üçlü motif (TRIM) proteinleri³ de dahil olmak üzere diğer kısıtlama faktörlerini araştırmak için uyarlandı. Bu tahlillerden esinlenen Bishop laboratuvarı, U937 hücrelerinde SAMHD1 kısıtlamasını analiz etmek için iki renkli bir test geliştirdi.

Deneyin iş akışı Şekil 1'de gösterilmiştir. Bir IRES'ten eksprese edilen YFP ile birlikte SAMHD1'i kodlayan bi-sistronik bir mesaj içeren Murin Lösemi Virüsü (MLV) benzeri parçacıklar, U937 hücrelerini dönüştürmek için kullanılır. Hücreler daha sonra sessiz bir fenotipe farklılaşmayı indüklemek için forbol miristat asetat (PMA) ile muamele edilir. Hücreler daha sonra kırmızı floresan proteini (RFP) eksprese eden HIV-1 virüsü benzeri parçacıklarla enfekte olur. 48 saat sonra, hücreler toplanır ve iki renkli akış sitometrisi ile analiz edilir. Bu tahlil aynı zamanda YFP ve yeşil floresan protein (GFP) ile birlikte kullanılır ve akış sitometrisi analizi için daha az standart filtre kombinasyonu gerektirir. HIV-RFP kullanımı daha basit bir telafi sağlar ve böylece tahlil daha az deneyimli akış sitometrisi kullanıcıları için daha kolay erişilebilir ve çoğu sitometre ile elde edilebilir.

Analiz sırasında, HIV ile enfekte olmuş hücrelerin oranı, SAMHD1 eksprese eden hücreler ile aynı hücre kuyucuğunda SAMHD1'den yoksun olanlar arasında karşılaştırılır. Bu, iyi / akış sitometri tüpünde bir iç kontrol sağlar ve bu da önemli bir özelliktir. Transdüktif ve transdüe edilmemiş hücrelerdeki enfeksiyon düzeylerinin karşılaştırılması, bir kısıtlama oranını ortaya koymaktadır. 1.0 oranı, transdüke faktörün bulaşıcılık üzerinde hiçbir etkisi olmadığını gösterir. Vahşi tip SAMHD1 ekspresyonu, bu tahlilde HIV enfeksiyonunda beş kat azalmaya yol açar ve bu da 0.2'lik bir kısıtlama oranına karşılık gelir. Bu etki, TRIM5 gibi daha klasik kısıtlama faktörlerine kıyasla mütevazı olsa da, etki yine de tekrarlanabilir ve modifiye SAMHD1 ekspresyonlarının, vahşi tip proteine eşdeğer bir şekilde kısıtlayanlara, kısıtlamayanlara ve ara fenotipe sahip olanlara sınıflandırılmasına izin verir.

Bu test, mutant SAMHD1 dizilerini kodlayan virüslerle transdüks ederek SAMHD1 etki alanı ve amino asit mutantlarının kısıtlama fenotiplerini karakterize etmek için başarıyla kullanılmıştır. Örneğin, HD206-7AA katalitik alan değişimleri bu tahlilde kısıtlanamaz. Aynı şekilde, farklı test edici virüslerin duyarlılığı da belirlenebilir. Örneğin, HIV-1 ters transkriptaz mutantları SAMHD1 aracılı kısıtlamaya karşı daha hassastır (örneğin, 151V⁴). Bu protokol, virüs benzeri parçacık (VLP) üretiminin, U937'nin SAMHD1 ekspresyon vektörleri ile transdüksiyonunun, floresan bir muhabir taşıyan HIV enfeksiyonunun ve ardından akış sitometrisi ile yapılan analizin ayrıntılarını özetlemektedir. Bu makalede, hangi verilerin bekleneceği ve optimal olmayan sonuçların nasıl önleneceği anlatılmaktadır. Son olarak, SAMHD1, dNTP seviyeleri ve viral enfeksiyon arasındaki etkileşimi daha iyi anlamak için farklı SAMHD1 varyantlarını incelemenin yanı sıra, tahlil için alternatif kullanımlar özetlenmiştir. SAMHD1'in hücre metabolizmasının merkezindeki rolü göz önüne alındığında, kansere ek bağlantılar ile, bu yoğun bir ilgi alanı olmaya devam etmektedir.

Protokol

Bu protokol, yazarlardan herhangi biri tarafından gerçekleştirilen hayvanları veya insan katılımcıları içeren herhangi bir çalışma içermez. Bu protokolün tüm adımları, uygulandıkları kurumların kılavuz ilkeleri ve uygulama kuralları izlenerek gerçekleştirilmiştir.

1. VLP üretimi için 293T hücrelerinin transfeksiyonu (hem SAMHD1-ekspresyon vektörleri hem de test cihazı HIV parçacıkları)

NOT: Virüs parçacıklarının başarılı bir şekilde üretilmesine en önemli katkılar, üretici 293T hücrelerinin sağlığı, transfeksiyonda akıcılık ve hasat zamanıdır. Laboratuvarlar tipik olarak retroviral parçacık üretimi için tercih ettikleri transfeksiyon reaktiflerine ve protokollerine sahip olacaktır. Aşağıdaki protokol kaliteli bulaşıcı parçacıklar verir, ancak eşdeğer protokoller de bu uygulama için uygun olacaktır. Kaliteli 293T hücrelerini korumak için, sabit bir büyüme oranını korumak için haftada en az üç kez geçiş yapın. Verimli transfeksiyon için hücreler büyümenin log fazında tohumlanmalıdır.

1. 1. Gün: Ertesi gün yaklaşık% 60 akıcılık elde etmek için 293T hücreli bir akıcılığa yakın bir çanaktan 1/4 bölünmüş gerekli sayıda 10 cm'lik tabak tohumlayın (yaklaşık 5 x 10⁵ hücre / mL). Ertesi gün yeni bir hücre stoğu ile çalışırken transfeksiyon için uygun bir yoğunluk elde etmek için birkaç yoğunluğun tohumlanması gerekebilir.
2. 2. Gün (sabah): Mikroskopi ile yaklaşık% 60 akıcılık olup olmadığını kontrol edin ve hücrelerdeki medyayı 10 mL taze Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ile nazikçe değiştirin.
3. 2. Gün (öğleden sonra, medya değişikliğinden en az 4 saat sonra): VLP üretimi için transfect.
   1. 600 μL serumsuz DMEM'de her biri 3 μg gag-pol ekspresyon plazmid, Uzun terminal tekrar (LTR) güdümlü muhabir plazmid ve Veziküler Stomatit Virüsü G proteini (VSV-G) ekspresyon plazmidi (toplam 9 μg, NOT'a bakınız) içeren DNA seyreltme karışımını oluşturun. Vorteks ve santrifüj kısaca (15 s, >500 x g).
   2. 20 μL transfeksiyon reaktifi ekleyin ( Malzeme Tablosuna bakınız), vorteks (santrifüj yapmayın) ve 15-20 dakika boyunca 20 ° C'de inkübe edin. Transfeksiyon karışımını plakaya damla damla ekleyin, karıştırmak için hafifçe döndürün ve inkübatöre geri dönün.
      NOT: SAMHD1'i ifade eden MLV VLP için KB4 ^5,6 (gag-pol ekspresör plazmid), pLGatewaySAMHD1IeYFP¹ (LTR güdümlü muhabir plazmid) ve pczVSV-G⁷ kullanın. HIV-RFP VLP için p8.91 ^8,9 (gag-pol ekspresyon plazmid), SCRPSY¹⁰ (LTR güdümlü muhabir plazmid) ve pczVSV-G kullanın. Alternatifler Malzeme Tablosunda tartışılmaktadır. Plazmid oranlarının farklı plazmid/transfeksiyon sistemleri için optimize edilmesi gerekebilir.
4. 3. Gün (sabahın geç saatlerinde): Pipetleme yaparak ortamı hücrelerden dikkatlice çıkarın, 5 mL taze DMEM ile yıkayın ve 5 mL taze DMEM ile değiştirin.
5. 4. Gün (sabah): Süpernatantı hücrelerden toplayarak virüsü toplayın ve 5 mL taze DMEM ile değiştirin. VLP içeren süpernatantı 0,45 nm filtreden, aliquot'tan geçirin ve depolama için -70 ° C'ye aktarın. Alikotların planlanan deneyler için uygun bir boyutta olduğundan emin olun (öneri olarak 250 μL), çünkü tekrarlanan donma-çözülme döngüleri viral titre kaybına neden olacaktır.
6. 5. Gün (sabah): Virüsü 1.5'teki gibi hasat edin, ancak süpernatanı topladıktan sonra plakaları atın.

2. Kullanmadan önce yeni VLP'yi titretme

1. 1. Gün: 24 kuyucuklu bir plakanın kuyusu başına 2 x 10⁵ hücrede 293T tohumu - her omurga için bilinen bulaşıcılığa sahip bir virüs de dahil olmak üzere titredilecek virüs başına 4 kuyucuk. Belirli bir hücre stoğu için tohumlama yoğunluğunu optimize edin.
2. 2. Gün: Akıcılığı kontrol etmek için plakayı gözlemleyin (ideal olarak ~% 70). Virüs içeren süpernatantı 1.5 ve 1.6. adımlardan çözün. Her bir kuyucuğa 0, 10, 25 veya 100 μL ekleyin.
3. 4. Gün (Sabah): Akış sitometrisi ile analiz için hücreleri toplayın.
   1. Dikkatli pipetleme veya aspirasyon ile ortamı çıkarın. Hücreleri 250 μL fosfat tamponlu salin (PBS) ile nazikçe yıkayın. 250 μL PBS ile yukarı ve aşağı pipetleme yaparak hücreleri plakadan çıkarın ve bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. 250 μL% 4 paraformaldehit ekleyin (son konsantrasyonu% 2'ye alarak).
      DİKKAT: Paraformaldehit toksiktir. Klor bazlı dezenfektanlarla karıştırılmamalıdır.
   2. Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleme ile pelet edin, süpernatantı atın ve hücre peletini 200 μL PBS veya alternatif akış sitometri tamponunda yeniden askıya alın. RFP veya YFP'yi akış sitometrisi ile uygun şekilde analiz edin. Belirli bir virüs stoğunun bulaşıcılığını, bilinen bir bulaşıcılık stoğunun değerlerine göre normalleştirin.
      NOT: VLP, p24 enzimine bağlı immünosorbent testi (ELISA) ile de normalleştirilebilir; Bununla birlikte, bu, özellikle VLP stoklarının farklı transfeksiyonlarda hazırlandığı durumlarda, VLP bulaşıcılığının iyi bir göstergesi değildir. Yayınlanmış medyan doku kültürü enfeksiyöz doz veya enfeksiyon çokluğu (TCID50 / MOI) yöntemleri¹¹ , MLV için iyi kurulmamış olsalar da, göreceli kantitasyon da sağlayabilir. Bağıl floresan, ticari ters transkriptaz ELISA yöntemlerine uygun maliyetli bir alternatif sağlar.

3. SAMHD1 ve YFP'yi ifade eden VLP ile U937'nin transdüksiyonu

NOT: Adım 3-6, kısıtlama deneyini oluşturur. Planlama kolaylığı için günler numaralandırılmıştır.

1. 1. Gün (öğleden sonra): MLV-Wild-type SAMHD1-YFP (pozitif kontrol), MLV-SAMHD1 (HD206-7AA)-YFP (negatif kontrol) ve varyant MLV-SAMHD1-YFP (deneysel örnekler) dahil olmak üzere transdüksiyon için VLP'yi çözün. Normalleştirilmiş VLP'yi bir mikrofüj tüpünde Roswell Park Memorial Institute 1640 media (RPMI) ile 500 μL'lik son bir hacme kadar seyreltin, 0,5 μL polibrene (10 mg / mL) ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın.
   1. VLP önceden titre edilemiyorsa, ilk etapta 100 μL kullanın. VLP kaynaklı toksisiteyi sınırlamak için VLP'nin RPMI'ye maksimum 1: 1 oranını kullanın. Yaklaşık %30 transdüksiyonu hedefleyin.
2. Aliquot 5 x 10⁵ U937 hücreleri, her iletim koşulu için steril bir mikrofüj tüpüne dönüşür. 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleme ile pelet ve süpernatantı çıkarın (akış sitometrisi için dönüştürülmemiş kontroller olarak iki ek tüp ekleyin). Hücre peletini 500 μL seyreltilmiş VLP (veya dönüştürülmemiş kontroller için RPMI) içinde yeniden askıya alın ve 24 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
3. 20 °C'de 90 dakika boyunca 800 x g'de bir masa üstü santrifüjde sponokülat. Kuyuya 1 mL 37 °C RPMI ekleyin ve 3 gün boyunca 37 °C'lik bir inkübatörde iyileşmeye izin verin.

4. Dönüştürülmüş U937'nin farklılaşması

1. 4. Gün (sabah): Hücreleri nazikçe pipetleyerek yeniden askıya alın ve 12 delikli bir plakanın 4 kuyucuğunun her birine 350 μL aktarın. Her bir kuyucuğa 150 nM PMA içeren 700 μL 37 °C RPMI ekleyin ve 100 nM'lik bir son konsantrasyon verin ve 3 gün boyunca farklılaşmaya izin verin.
   NOT: PMA toz olarak satın alınır ve DMSO'da 1 mM'ye kadar askıya alınmalı ve karanlıkta saklanmalıdır. DMSO ile 1 mM stoktan 1/10 seyreltilerek 100 μM'lik bir çalışma stoğu hazırlanmalıdır.

5. HIV-RFP ile farklılaşmış, SAMHD1-eksprese eden U937 enfeksiyonu

1. 7. Gün: Hücreleri mikroskopi ile gözlemleyin. Hücrelerin yapışkan olduğundan emin olun. Medyayı tüm kuyulardan aspire edin, dönüştürülmemiş, enfekte olmayan kontrolün yanı sıra tek renk kontrollerine izin veren her 4'lü setin 1'ine 1 mL RPMI ekleyin. Diğer tüm kuyucuklara kabaca 10 μL HIV-1-RFP (kılavuz olarak yaklaşık 10 ng p24) içeren 0,5 mL RPMI'yi geri ekleyin. Enfeksiyonun yaklaşık% 50'sini hedefleyin.
2. 8. Gün (sabah): Enfekte kuyuların her birine 0,5 mL RPMI ekleyin.

6. Akış sitometrisi analizi

NOT: Akış sitometrisi boru hatlarına canlı-ölü bir leke eklemek iyi bir uygulamadır. Bununla birlikte, U937 hücreleri iyi kalitedeyse, bu adım aşağı akış analizi için olumsuz sonuçlar doğurmadan atlanabilir. Tripsinize hücrelerin nazikçe pipetlenmesi kolayca tek bir hücrenin süspansiyonuna neden olmalıdır.

1. 10. Gün (sabah): Ortamı kuyulardan aspire edin ve PBS ile bir kez yıkayın. 5-10 dakika boyunca 300 μL hücre ayrışma enzimi (veya tripsin) ekleyin. Ek olarak 300 μL PBS ekleyin, tüm hücrelerin plakadan çıktığından emin olarak iyice askıya alın ve akış sitometri tüplerine aktarın.
2. 300 μL% 4 paraformaldehit ekleyin (son konsantrasyonu% 2'ye alarak). Hücreleri 5 dakika boyunca 500 x g'de santrifüjleme ile pelet edin, süpernatantı atın ve hücre peletini 200 μL PBS veya alternatif akış sitometri tamponunda yeniden askıya alın. Akış sitometrisi ile analiz edin.
   NOT: Aşağıdaki adımlar bir Fortessa analizörü içindir, ancak RFP ve YFP floresansını okuyabilen herhangi bir analizör kullanılarak eşdeğer analiz gerçekleştirilebilir. Herhangi bir akış sitometrisi analizi yapmadan önce yerel akış sitometri desteğine veya diğer deneyimli araştırmacılara danışın. Birçok numunenin aynı anda taranması gerektiğinde, yüksek verimli bir örnekleyici uygun olabilir. Bu durumda, daha büyük bir hücre numarası ve hacmi önerilir.

7. Akış sitometrisi analizi

1. Sitometreyi gerekli olmadan 10 dakika önce açın ve bilgisayarı açın. Atıkların boş olduğunu ve kılıf tankının dolu olduğunu kontrol edin.
2. Makinede oturum açın ve analiz yazılımını açın.
3. Kolu yana doğru hareket ettirin, su tüpünü çıkarın, akış hızını Yüksek olarak ayarlayın ve Prime'a basın. Işığın sönmesini bekleyin ve üç kez daha tekrarlayın.
4. Suyu tekrar takın ve 3 dakika boyunca yüksekte çalıştırın ve ardından Düşük'e geçin ve edinime devam edene kadar Bekleme düğmesine basın.
5. Bu arada deneyi yazılım içinde kurun:
   1. Deneme/Yeni Deneme'yi seçin (yerel rehberliğe göre adlandırın). Denetçide, Blue Laser 530/30 ve Yellow Laser 610/20'yi veya makine için YFP ve RFP için önerilen lazer ve filtre kombinasyonlarını bırakarak gereksiz florokromları silin.
   2. Deneye sağ tıklayın ve Sitometre Ayarları / Uygulama Ayarları / Çalışma Sayfası Oluştur'u seçin. Çalışma sayfasında, ilgili simgeye tıklayarak ve eksen etiketine tıklayarak eksenleri değiştirerek İleri Dağılım Alanı (FSC-A)/Yan Dağılım Alanı (FSC-A) nokta lekesi ve YFP histogramı, RFP histogramı ve GFP/YFP nokta lekesi oluşturun.
   3. Deneme'ye tekrar sağ tıklayın ve Yeni Örnek ekleyin. Uygun şekilde yeniden adlandırın. Yeni bir tüp ortaya çıkarmak için artı işaretine tıklayarak numuneyi açın.
6. Edinme panosunu View'dan açın, virüs etkilenmemiş, dönüştürülmemiş denetimi yükleyin ve Al'a basın. Sol alt kadrandaki hücreleri konumlandırmak için gösterge tablosundaki FSC ve SSC voltajlarını ayarlayın (eksenlerde hücre yok). Bu popülasyonun etrafındaki kapı P1. Diğer grafiklere sağ tıklayın ve sonraki analizlerden enkazı kaldırmak için P1'i göster'i seçin.
7. YFP için tek renk denetimini yükleyin (yalnızca vahşi tip SAMHD1) ve edinin. Kontrol panelindeki YFP voltajını, en fazla floresan hücresi dedektörün menzili içinde olacak şekilde ayarlayın (eksenin kenarında değil). Tek renkli RFP kontrolü için bu işlemi tekrarlayın.
8. Dönüştürülmemiş, virüs bulaşmamış ve tek renkli denetimleri kullanarak otomatik telafiyi çalıştırın.
   1. Normal bir çalışma sayfasına geçmek için menüden Deneme > Ücret Kurulumu > Ücret Denetimleri Oluştur'u seçin. Lekesiz normal çalışma sayfasını seçin, Çalıştır'a basın ve lekesiz denetim için edinin.
   2. Bozulmamış hücrelerin (P1) etrafına bir kapı çizin ve kaydedin. Tüpü çıkarın ve makineyi bekleme moduna getirin. P1'e sağ tıklayın, Tüm Ücret Kontrollerine Uygula'ya tıklayın.
   3. RFP normal çalışma sayfasına geçin ve Çalıştır'a basın. Tek renkli RFP denetimini kaydedin ve makineyi Bekleme moduna geçirin. Yazılım otomatik olarak pozitif popülasyonu seçmelidir.
   4. YFP tek renk kontrolü için bu işlemi tekrarlayın. Deneme > ücret kurulumu > Ücret hesapla > bağlantı ve kaydet'i seçin.
9. Genel çalışma sayfasına geçin. HIV-RFP ile enfekte olmuş vahşi tip SAMHD1 ile dönüştürülmüş hücreleri edinin ve sırasıyla YFP ve RFP için dikey ve yatay olarak hizalanmış kadranların köşelerinde dört ayrı popülasyonun görülebildiğini kontrol edin. Tüpü çıkarın ve Bekleme düğmesine basın.
10. Dönüştürülmemiş, virüs bulaşmamış örneği yeniden yükleyin, Çalıştır'a basın ve durdurma kapısı olarak P1 ile 30.000 olay kaydedin . Kalan örnekler için tekrarlayın (diğer kontroller dahil). Çalışırken örnekleri yeniden adlandırın veya hoc yayınlayın. Dışa aktarıldıktan sonra dosyalar yeniden adlandırılamaz.
11. Verileri .fcs dosyaları olarak dışa aktarın ve sıvıları yerel talimatlara göre temizleyin.

8. Veri analizi

NOT: Aşağıdaki adımlar FlowJo v10'daki analize karşılık gelir; ancak eşdeğer adımlar diğer analiz yazılımlarında da kolaylıkla gerçekleştirilebilir.

1. Yazılımı açın ve tüm .fcs dosyalarını panoya sürükleyin. Ücret denetimlerini seçin ve bunları ücret alt klasörüne sürükleyin. FSC-A/SSC-A grafiğini açacak olan çift tıklatarak dönüştürülmemiş, virüs bulaşmamış tüpün dosyasını açın.
2. Sol alt köşedeki döküntüler hariç, sağlam hücre popülasyonundaki çokgen aracını ve kapıyı seçin. Bu hücreleri adlandırın. Bu kapıyı Tüm Örnekler çubuğundaki tüm tüp popülasyonuna sürükleyin. Geçişin her tüp için uygun olduğundan emin olmak için yatay ok düğmelerini kullanarak her bir numune arasında gezinin.
3. Dönüştürülmemiş, enfekte olmamış örnek için Hücreler popülasyonuna çift tıklayın ve eksenleri FSC-Yükseklik (H) ve FSC-Alanı (A) olarak ayarlayın. Çiftleri hariç tutmak için dikdörtgen bir kapı kullanarak tek büyük popülasyonu seçin. Yazılım otomatik olarak bu Tek Hücreleri adlandırmayı önerecektir.
4. Bu kapıyı tüm Hücre popülasyonlarına sürükleyin ve tekrar geçitin tüm örnekler için uygun olup olmadığını kontrol edin. Enfekte olmamış, dönüştürülmemiş örnek için Tek Hücre popülasyonunu seçin, eksenleri telafi edilmiş mavi lazer (y , YFP) ve telafi edilmiş sarı lazer (x, RFP) olarak değiştirin. Eksende T tuşuna basın ve x ve y için Biexponential scale'i seçin.
5. Kadran Geçit Aracı'nı seçin ve negatif hücre popülasyonunun sağ üst uç noktasına tıklayın. Bu ön geçidi, Tüm Örnekler çubuğuna sürükleyerek tüm Tek Hücreli popülasyonlara uygulayın. Kadran kapılarının popülasyonları tatmin edici bir şekilde ayırmadığı durumlarda, Şekil 2'de olduğu gibi çokgen aracını kullanarak bireysel kadranları geçmek gerekebilir.
6. Yalnızca vahşi tip SAMHD1 örneğine (yalnızca YFP) ilerleyin ve çevrilmemiş (YFP negatif) ile YFP pozitif arasındaki geçidin doğru olup olmadığını kontrol edin. Loş YFP hücrelerinden negatifi ayırt etmek için kontur görünümüne geçmek yardımcı olabilir. En üstteki YFP + ve hücreleri geniş bir alana yayılmışsa, üst-dikey kapıyı sağa doğru ayarlayın.
7. Tüm numuneler arasında gezinin ve geçidi YFP pozitifliğine göre kontrol edin. Tüm örnekler için geçerli olan YFP negatif ve pozitif arasındaki en iyi bölmeyi kullanın.
   NOT: Ücret, wild-type SAMHD1 YFP ifade düzeyine göre hesaplanmış olacaktır. Farklı SAMHD1-YFP transdüke edilmiş hücreler arasında enfeksiyon seviyeleri çok farklıysa, kompanzasyonun ayarlanması gerekebilir. Bu nedenle YFP VLP'nin kullanımdan önce normalleştirilmesi tercih edilir.
8. Dönüştürülmemiş, HIV-RFP virüslü tüpe ilerleyin ve enfekte olmamış RFP negatif ile enfekte RFP pozitif arasındaki geçidin doğru olup olmadığını kontrol edin. Gerekirse kontur görünümünü kullanarak uygun şekilde ayarlayın ve geçidin tüm numuneler için geçerli olup olmadığını kontrol etmek için kalan numuneler arasında gezinin.
9. Her örnek çift negatif (Q4: sol alt, dönüştürülmemiş, enfekte edilmemiş), YFP pozitif (Q1: sol üstte, SAMHD1 eksprese eden, enfekte olmayan), RFP-pozitif (Q3: sağ alt, dönüştürülmemiş, HIV ile enfekte olmuş) ve çift pozitif (Q2: sağ üstte, HIV ile enfekte SAMHD1) gerektirir. Simgeye tıklayarak tablo düzenleyicisini açın ve dört kadran kapısını kontrol paneline sürükleyin. Excel Dışa Aktar'ı seçin ve Tablo Oluştur'a tıklayın. Oluşturulan elektronik tabloyu yerel dosya adlandırma kurallarına göre kaydedin.
10. Grafiklerin ve geçit stratejilerinin temsillerini dışa aktarmak için, Düzen Düzenleyicisi simgesine tıklayın. Her popülasyonu seçin ve gerekli eksenler, etiketleme ve aralıklarla düzenleyiciye sürükleyin.
11. Tüm örnekler için gösterilen aynı grafiklere sahip bir mizanpaj oluşturmak için bir sütun seçin ve Toplu Et'e basın. Genişliğe Ölçekle'ye basın ve ardından Sayfa Sonlarını Önle'ye basın. Gerekli dosya biçiminde kaydedin.
12. Dışa aktarılan elektronik tabloda, YFP-ves'in yüzde RFP'si (RFP+ve / (çift negatifler + RFP+ve)) ve YFP+ves'in yüzde RFP'si (çift pozitifler / (çift pozitifler + YFP+ve)) sütunlarını ve ardından YFP-ve'nin (%YFP+ve / %RFP'si) son sütununu oluşturarak kısıtlama oranını hesaplayın, bkz. Her SAMHD1 yapısı için çoğaltılan verilerin ortalamasının ortalaması alınır ve uygun veri analiz yazılımı kullanılarak test edilen SAMHD1 varyantları için kısıtlama değerlerinin vahşi tip ve/veya 206-7AA'dan önemli ölçüde farklı olup olmadığını hesaplayın.

Sonuçlar

Yukarıdaki analizin sonuçları, vahşi tip SAMHD1 pozitif kontrol için 0.25 veya daha düşük bir kısıtlama oranı ve negatif kontrol için 1.0 olmalıdır. Bu iki kalite kontrol kontrolü geçerliyse, sonuçların istatistiksel önemini göz önünde bulundurun. Bu nedenle, vahşi tipten anlamlı bir fark göstermeyen SAMHD1 varyantları, bu bağlamda SAMHD1 kısıtlamasını etkilemeyen ikameler taşır. Vahşi tipten önemli ölçüde farklı olanlar, bozulmuş kısıtlama gösterir. Bunlar negatif kontrolden önemli ölçüde farklı değilse, bu bağlamda kısıtlama yeteneğinden yoksundurlar (Şekil 4 sol paneller).

Wild-type SAMHD1 kısıtlama değeri 0,3'ten büyükse, test edici virüsler için sonuçlar gösterge niteliğinde olabilir, ancak bunlara güvenilemez. Vahşi tip protein tarafından etkisiz kısıtlama, U937 hücrelerinin sulandırmadan sonra (2 hafta içinde) veya çok yaşlandıklarında (>2-3 ay) çok erken kullanılmasından kaynaklanabilir. Bu parametrelerin belirli bir hücre stoğu için ampirik olarak belirlenmesi gerekebilir. Tipik olarak, geçiş ne kadar düşük olursa, hücreler o kadar güvenilir bir şekilde farklılaşır ve bu nedenle SAMHD1 kısıtlaması için uygun ortamı sağlar. SAMHD1-YFP veya HIV-RFP ile uygunsuz enfeksiyon seviyesi, hem kompanzasyon hem de kısıtlama oranının aşağı yönde belirlenmesinde zorluklara neden olabilir. Bir örnek, Şekil 4'ün sağ panellerinde gösterilmiştir.

Negatif kontrol 1.0'dan saparsa (0.9-1.2 aralığının dışında), bu, enfekte olmuş hücrelerin oranı, geçit stratejisi veya hücrelerin sağlığı testi etkileyen analizle ilgili bir soruna işaret edebilir. Yukarıdaki NOTLAR'a bakın.

Şekil 1: Şematik anahat protokolü. VLP, virüs benzeri parçacıklar, PMA, forbol miristat asetat. Numaralandırılmış aşamalar protokoldeki aşamalara karşılık gelir. BioRender.com kullanılarak üretilen figür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 2: Retroviral plazmidlerin şeması . (A) Ambalaj vektörleri (B) Transfer vektörleri (C) VSV-G zarf ekspresörü. Anahtar kodlama ve düzenleyici öğeler gösterilir. Ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın. CMV IE: sitomegalovirüs hemen-erken promotör, BGH: sığır büyüme hormonu, pA: poliA, RRE: Rev Yanıt Elemanı, CMV-LTR: kompozit CMV-HIV-1 LTR promotörü, Psi: HIV-1 paketleme sinyali, cPPT / CTS: merkezi polipürin yolu / merkezi sonlandırma dizisi, SV40: simian vakumlama virüsü 40. BioRender.com kullanılarak üretilen figür. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 3: Akış sitometrisi analizi için geçit stratejisi. (A) Telafi kontrolleri: sol panel, dönüştürülmemiş, enfekte olmamış kontrol için dokunaklı hücreler üzerindeki FSC-A / SSC-A geçidini gösterir. Merkezi ve sağ paneller, YFP (orta) ve RFP (sağda) için tek renkli telafisi kontrollerinin ekran görüntülerini, telafi edilmemiş veriler siyah ve mavi olarak gösterir. (B) Yukarıdaki tazminat kontrolleri için karşılık gelen tazminat matrisi ve grafikleri. (C) Geçit stratejisi. Enkaz, tüm hücrelerin FSC-A/SSC-A (sol panel) ile analizi ile elimine edilir. Çiftler, FSC yüksekliğine karşı alana (merkezi panel) göre geçit verilerek hariç tutulur. Sağ panel, vahşi tip SAMHD1 tarafından HIV-1 kısıtlamasının bir örneğini göstermektedir. Eksenler sırasıyla YFP (SAMHD1) ve RFP (HIV) pozitif hücrelere karşılık gelen kompanse mavi ve sarı lazer floresansını gösterir. Kadran kapıları, RFP ve YFP için negatif ve tek renkli kontrollerin karşılaştırılmasıyla çizilir. Rakamlar ebeveyn popülasyonunun yüzdesini gösterir. GFP'li YFP için telafi değerleri çok daha yüksek olacaktır, ancak uygun filtre setleri kullanılarak ayırt edilmesi mümkün olacaktır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Şekil 4: Beklenen sonuçlar: ideal ve yetersiz veriler. (A) Optimal (sol) ve optimal olmayan (sağ) veriler için temsili YFP/RFP grafikleri. Rakamlar ebeveyn popülasyonunun yüzdesini gösterir. Sağ panelde, HIV enfeksiyonu çok düşüktür ve telafi ve geçit ile ilgili zorluklar yaratmaktadır. Kısıtlama oranı 0,5 ile beklenenden daha yüksektir. (B) İstatistiksel yazılım kullanılarak oluşturulan vahşi tip (WT, kırmızı) veya negatif kontrol (HD206-7AA, siyah) ile ilgili olarak SAMHD1 varyantları için kısıtlama oranı grafikleri. Her nokta bir çoğaltma değerini temsil eder. Ortalama ve standart sapma gösterilmiştir. Her grup arasındaki eşleştirilmiş t-testleri, gösterildiği yerde beklenen tüm vakalarda anlamlıydı. Solda: İdeal veri - WT beklenen kısıtlamayı yaklaşık 0,2, negatif 1,0 gösterir. R372D (gri) varyantı WT'den önemli ölçüde farklıdır, ancak negatif kontrolden önemli değildir ve bu nedenle kısıtlama yeteneğini kaybetmiştir. Sağ: Optimal olmayan veriler. Burada, negatif beklendiği gibi davranır, ancak altı kopyanın hepsinde WT, düşük enfeksiyon oranı nedeniyle yalnızca 0.5'lik bir kısıtlama oranı gösterir. Gruplar içindeki düşük varyans, R143H'nin WT ve negatiften istatistiksel olarak farklı bir ara fenotip gösterdiği anlamına gelirken, G209S kısıtlamaz; ancak, pozitif kontrol beklenen kısıtlama oranını vermediğinden bu taze hücrelerle tekrarlanmalıdır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Tartışmalar

Yukarıdaki notlarda tartışıldığı gibi, protokolün kritik yönleri, VLP üretimi için doğru hücre fenotipini korumak ve SAMHD1 kısıtlamasını gözlemlemek için uygun ortamı yaratmak etrafında toplanmaktadır. İlk olarak, iki renkli akış sitometrisi ile kısıtlamanın doğru analizi, transdüke edilmiş ve enfekte olmuş hücrelerin uygun oranlarının elde edilmesine dayanır, böylece grafiğin her alanında analiz için yeterli hücre bulunur. Bu nedenle, araştırmacı 1'den daha az bir MOI'yi hedeflemelidir (bakınız Protokol). Çok yüksek veya çok düşük olan transdüksiyon ve enfeksiyon oranları, enfekte olmamış veya iki kat enfekte olmuş hücrelerin eksikliği nedeniyle analizde sorunlara yol açmaktadır. Aynı şekilde, karşılaştırılacak SAMHD1 vektörleri için benzer bir transdüksiyon oranı, aynı kompanzasyon matrisinin ve geçidin tüm deneye uygulanmasına izin vermenin anahtarıdır ve sonraki analize olan güveni arttırır.

İkincisi, kullanılan U937 hücrelerinin yaşı, başarılı bir şekilde farklılaşıp farklılaşmamalarında önemli bir faktördür. Başarılı farklılaşma, aderans gözlemi, farklılaşmayı takiben ortamın zaman içinde asitlenmesinin azalması ve tahlilde vahşi tip pozitif kontrol ile yeterli kısıtlama ile izlenebilir. 5 güne kadar farklılaşma başarılı olmuştur.

Bu tahlilin en önemli avantajlarından biri esnekliğidir. SAMHD1'in çeşitli modifiye versiyonları (alanlar, amino asitler, tür dizileri), vektörün veya klonlamanın basit bir saha yönelimli mutagenezi ile test edilebilir. Aynı şekilde, test edici virüsün varyantları da araştırılabilir. Tahlil daha önce dNTP'yi bağlama kapasitesi azaltılmış HIV-1 ters transkriptaz mutantlarının SAMHD1 kısıtlamasına karşı daha duyarlı olduğunu göstermek için kullanılmıştır. Aynı prensip, diğer virüslerin SAMHD1 tarafından kısıtlanmasını test etmek için de kullanılabilir. Ayrıca, değişen farklılaşma koşulları veya hücre içi dNTP konsantrasyonlarının yapay manipülasyonu, hücre içi koşullar ile Bishop laboratuvarında aktif bir araştırma alanı olan SAMHD1 aktivitesi arasındaki etkileşimi daha da araştırmak için kullanılabilir. SAMHD1'in çeşitli nükleozid ters transkriptaz inhibitörleri ile etkileşimi de tanımlanmıştır ve bu tahlil kullanılarak SAMHD1'in etkisi birincil hücrelerde kullanılmak üzere modifiye edilmiştir^12,13,14,15.

Primer hücrelerde kullanılmak üzere protokolün uyarlanması, transforme olmuş hücrelerdeki metabolik fenotiplerin incelenmesiyle ortaya çıkan sınırlamanın üstesinden gelir. Bununla birlikte, mevcut format, özellikle yüksek verimli bir örnekleyiciye sahip bir akış sitometresinin kullanılmasıyla, yüksek verim analizi için uygun ve teknik olarak daha az zorlayıcı bir protokole izin verir. Protokolü uyarlarken, dahili olarak dönüştürülmemiş hücrelerin seyirci etkilerine (örneğin, bağışıklık sinyalizasyonu) duyarlılığı göz önünde bulundurulmalıdır.

Hücre biyolojisinin birçok yönüyle olduğu gibi, bu tür testlerin belirli bir fenomeni anlamak için bütünsel bir yaklaşımın parçası olarak kullanılması esastır. SAMHD1 aktivitesi¹⁶ için biyokimyasal tahlillerin paralel kullanımı, hücre içi dNTP havuzlarının nicelleştirilmesi ve insanlarda, ex vivo ve hayvan modellerinde SAMHD1 mutant fenotiplerinin gözlemlenmesi (dünyadaki laboratuvarlar tarafından yürütülen, bazıları bu sayıda tanımlanmıştır) bu karmaşık proteinin gelişen anlayışı için anahtardır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T cells	ATCC	CRL-3216
0.45 µm syringe filters	Sartorius	FCT122
10 cm dishes	Corning	430167	virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance
12 well plates	Greiner	665180
24 well plates	Greiner	662160
BD LSRFortessa cell analyzer	BD Bioscience	649225	alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence
DMEM	Sigma	D6429	ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate.
DMSO	Fisher	BP-231-100
fetal bovine serum	Gibco	10500064
Flowjo	BD Bioscience	-	alternative analysis software can be used
light microscope	-	-	Any bright field light microscope
p8.91	-	-	HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)
paraformaldehyde (4 % in PBS)	Alfa Aesar	J61889
PBS	Sigma	D8537
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher	15140122
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma	P8139
polybrene	Sigma	TR-1003
pKB4	-	-	Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)
pLGatewaySAMHD1eYFP	-	-	MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP	-	-	As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues
Prism	Graphpad	-	https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable
pVSV-G	-	-	VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)
RPMI	ThermoFisher	21875034
screw-cap tubes	StarLab	E1415-2231
SCRPSY	-	-	HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/
stripettes 10 mL	Corning	10084450
stripettes 5 mL	Corning	10420201
TrypLE express	Gibco	12604021	Trypsin will also be suitable
Turbofect	ThermoFisher	R0531	alternative transfection reagents will also work well
U937 cells	ATCC	CRL-1593.2