인간 골수성 U937 세포에서 유세포 분석에 의한 SAMHD1 제한 분석

요약

여기에 설명된 것은 세포 억제 단백질 SAMHD1에 의한 HIV-1 제한의 정도를 결정하기 위한 확립된 방법입니다. 인간 골수성 계통 U937 세포는 YFP를 공동 발현하는 SAMHD1 발현 벡터로 형질도입되고, 분화된 후 HIV-RFP로 도전된다. 제한의 수준은 유세포 분석 분석에 의해 결정된다.

초록

멸균 α-모티프/히스티딘-아스파르테이트 도메인 함유 단백질 1(SAMHD1)은 정지 골수성 세포에서 HIV-1의 복제를 억제합니다. U937 세포는 SAMHD1 RNA 발현 수준이 낮아 검출할 수 없는 내인성 단백질 발현으로 이어지는 SAMHD1 활성을 분석하기 위한 편리한 세포 시스템으로 널리 사용됩니다. 다른 레트로바이러스 제한 인자를 특성화하기 위해 Stoye 실험실에서 개발된 유사한 분석을 기반으로 Bishop 실험실은 U937 세포에서 SAMHD1을 분석하기 위한 2색 제한 분석을 개발했습니다. 뮤린 백혈병 IRES에서 발현된 YFP와 함께 SAMHD1을 발현하는 바이러스 유사 입자는 U937 세포를 형질도입하는 데 사용됩니다. 이어서, 세포를 포르볼 미리스테이트 아세테이트로 처리하여 정지 표현형으로의 분화를 유도한다. 분화 후, 세포는 형광 리포터를 발현하는 HIV-1 바이러스 유사 입자에 감염된다. 48시간 후, 세포를 수확하고 유세포분석에 의해 분석한다. SAMHD1 발현 집단에서 HIV 감염 세포의 비율은 SAMHD1이 결핍 된 내부 대조군 세포의 비율과 비교됩니다. 이 비교는 제한 비율을 나타냅니다. SAMHD1 발현은 0.2의 제한 비율에 해당하는 HIV 감염을 5 배 감소시킵니다. 최근 HIV 감염에 대한 리포터 유전자로 원래 GFP에 대한 RFP를 대체함으로써 유세포 분석 분석이 용이해졌습니다.

이 분석은 발현 벡터의 부위 지향 돌연변이 유발에서 유래된 변경된 SAMHD1 단백질을 암호화하는 바이러스로 형질도입하여 SAMHD1 제한에 대한 아미노산 치환의 효과를 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 예를 들어, 촉매 부위 치환 HD206-7AA는 제한 활성의 손실을 나타내는 1의 제한 표현형을 나타낸다. 마찬가지로, 다른 테스터 바이러스의 감수성을 결정할 수 있습니다. 이 분석은 SAMHD1, 세포 대사 상태 및 바이러스 제한 간의 관계를 더 잘 이해하기 위해 분화 상태, 대사 상태 및 SAMHD1 변형제의 효과를 통합하도록 추가로 조정할 수 있습니다.

서문

멸균 α-모티프/히스티딘-아스파르테이트 도메인 함유 단백질 1(SAMHD1)은 골수성 계통의 정지 세포에서 인간 면역결핍 바이러스 유형 1(HIV-1)의 복제를 방해합니다. SAMHD1은 dNTP 트리포스포하이드롤라제로서의 효소 활성을 통해 복제를 차단하여 세포 내 dNTP 수준을 감소시킵니다. 결과적으로 HIV-1은 역전사 과정을 효율적으로 수행 할 수 없습니다. 이 초기 관찰 이후 몇 년 동안 특히 SAMHD1의 항 바이러스 활성에 대한 특정 도메인과 아미노산의 기여와 관련하여 많은 진전이있었습니다. 이러한 통찰력은 생리학적으로 관련된 정지 골수성 환경을 모방한 세포 시스템뿐만 아니라 생화학적 분석을 사용하여 이루어졌습니다. U937 세포¹ 은 SAMHD1 활성을 분석하기위한 편리한 골수 세포 시스템으로 널리 사용됩니다. 이는 내인성 SAMHD1 발현이 부족하기 때문이며, SAMHD1 발현 세포(진행 중인 연구 영역)에 비해 RNA 수준이 낮기 때문인 것으로 생각됩니다. 여기서, 프로토콜은 HIV-1의 SAMHD1 제한 메커니즘을 조사하기 위해 SAMHD1과 황색 형광 단백질(YFP) 리포터를 동시 발현하는 바이러스 유사 입자를 가진 U937 세포의 일시적인 형질도입을 설명합니다. 레트로바이러스 제한을 조사하기 위한 이러한 일시적인 2색 유세포분석 분석은 Stoye 실험실² 에서 처음 개발되었으며 이후 삼자 모티프(TRIM) 단백질³을 포함한 다른 제한 인자를 조사하도록 조정되었습니다. 이러한 분석에서 영감을 얻은 Bishop 실험실은 U937 세포에서 SAMHD1 제한을 분석하기 위한 2색 분석을 개발했습니다.

실험의 워크플로는 그림 1에 나와 있습니다. IRES로부터 발현된 YFP와 함께 SAMHD1을 암호화하는 바이시스트로닉 메시지를 함유하는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV) 유사 입자는 U937 세포를 형질도입하는데 사용된다. 그런 다음 세포를 포볼 미리스테이트 아세테이트(PMA)로 처리하여 정지 표현형으로의 분화를 유도합니다. 세포는 다음으로 적색 형광 단백질 (RFP)을 발현하는 HIV-1 바이러스 유사 입자에 감염된다. 48시간 후, 세포를 수확하고 2색 유세포분석법으로 분석한다. 이 분석은 YFP 및 녹색 형광 단백질(GFP)과 함께 사용되므로 유세포분석 분석을 위한 표준 필터 조합이 덜 필요합니다. HIV-RFP를 사용하면 보다 직접적인 보상이 가능하므로 경험이 적은 유세포분석 사용자가 분석에 더 쉽게 접근할 수 있고 대부분의 세포분석기로 달성할 수 있습니다.

분석하는 동안 HIV 감염 세포의 비율을 SAMHD1 발현 세포와 동일한 세포 웰 내에서 SAMHD1이 부족한 세포 간에 비교합니다. 이것은 핵심 기능인 웰/유세포 분석 튜브의 내부 제어를 제공합니다. 형질도입된 세포와 형질도입되지 않은 세포에서의 감염 수준의 비교는 제한 비율을 나타낸다. 1.0의 비율은 형질도입된 인자가 감염성에 영향을 미치지 않음을 나타냅니다. 야생형 SAMHD1 발현은 이 분석에서 HIV 감염의 5배 감소를 유도하며, 이는 0.2의 제한 비율에 해당합니다. 이 효과는 TRIM5와 같은 보다 고전적인 제한 인자에 비해 미미하지만, 그럼에도 불구하고 효과는 재현 가능하며 변형된 SAMHD1 발현자를 야생형 단백질과 동등한 방식으로 제한하는 표현자, 제한하지 않는 표현자 및 중간 표현형을 갖는 표현자로 분류할 수 있습니다.

이 분석은 돌연변이 SAMHD1 서열을 암호화하는 바이러스로 형질도입하여 SAMHD1 도메인 및 아미노산 돌연변이체의 제한 표현형을 특성화하는 데 성공적으로 사용되었습니다. 예를 들어, 촉매 부위 치환 HD206-7AA는 이 분석에서 제한하지 못한다. 마찬가지로, 다른 테스터 바이러스의 감수성을 결정할 수 있습니다. 예를 들어, HIV-1 역전사효소 돌연변이체는 SAMHD1-매개 제한(예를 들어, 151V4)에 더 민감하다. 이 프로토콜은 바이러스 유사 입자 (VLP) 생산, SAMHD1 발현 벡터를 사용한 U937의 형질 도입, 형광 리포터를 운반하는 HIV 감염 및 유세포 분석에 의한 후속 분석의 세부 사항을 설명합니다. 이 문서에서는 예상되는 데이터와 최적이 아닌 결과를 방지하는 방법에 대해 설명합니다. 마지막으로, SAMHD1, dNTP 수준 및 바이러스 감염 간의 상호 작용을 보다 철저하게 이해하기 위해 다양한 SAMHD1 변이체를 검사하는 것 외에도 분석의 대체 용도가 간략하게 설명됩니다. 세포 대사의 중심에서 SAMHD1의 역할과 암과의 추가 연관성을 감안할 때 이것은 계속해서 강렬한 관심 분야입니다.

프로토콜

이 프로토콜에는 저자가 수행 한 동물 또는 인간 참가자와 관련된 연구가 포함되어 있지 않습니다. 이 프로토콜의 모든 단계는 수행 된 기관의 지침과 실행 강령에 따라 수행되었습니다.

1. VLP 생산을 위한 293T 세포의 형질감염(SAMHD1 발현 벡터 및 테스터 HIV 입자 모두)

참고: 바이러스 입자의 성공적인 생산에 가장 중요한 기여자는 생산자 293T 세포의 건강, 형질주입 시 컨플루언스 및 수확 시간입니다. 실험실은 전형적으로 레트로바이러스 입자 생산을 위한 그들의 바람직한 형질주입 시약 및 프로토콜을 가질 것이다. 다음 프로토콜은 양질의 감염성 입자를 생성하지만 동등한 프로토콜도 이 응용 분야에 적합합니다. 양질의 293T 세포를 유지하려면 일정한 성장 속도를 유지하기 위해 적어도 일주일에 세 번 계대하십시오. 세포는 효율적인 형질감염을 위해 성장의 로그 단계에 시딩되어야 한다.

1. 1일차: 293T 세포의 거의 합류 접시에서 1/4 분할하여 필요한 수의 10cm 접시를 파종하여 다음 날 약 60%의 컨플루언시를 산출합니다(약 5 x 10⁵ cells/mL). 다음 날 새로운 세포 스톡으로 작업할 때 형질주입을 위한 적절한 밀도를 달성하기 위해 여러 밀도를 시딩해야 할 수도 있습니다.
2. 2일차(오전): 현미경으로 약 60%의 컨플루언스를 확인하고 세포의 배지를 10mL의 신선한 Dulbecco의 변형 이글 배지(DMEM)로 부드럽게 교체합니다.
3. 2일차(오후, 배지 교체 후 최소 4시간): VLP 생산을 위해 형질전환합니다.
   1. 600 μL의 무혈청 DMEM에 각각 3μg의 gag-pol 발현 플라스미드, 긴 말단 반복(LTR) 구동 리포터 플라스미드 및 수포성 구내염 바이러스 G 단백질(VSV-G) 발현 플라스미드(총 9μg, 참고 참조)를 포함하는 DNA 희석 혼합물을 구성합니다. 와류와 원심 분리기를 잠깐 (15 초, >500 x g).
   2. 20μL의 형질주입 시약( 재료 표 참조), 와류(원심분리하지 않음)를 추가하고 20°C에서 15-20분 동안 배양합니다. 형질주입 혼합물을 플레이트에 적가하고, 부드럽게 소용돌이치며 혼합하고, 인큐베이터로 다시 돌아간다.
      참고: SAMHD1을 발현하는 MLV VLP의 경우 KB4 ^5,6 (gag-pol expressor plasmid), pLGatewaySAMHD1IeYFP¹ (LTR-driven reporter plasmid) 및 pczVSV-G⁷을 사용한다. HIV-RFP VLP의 경우 p8.91 ^8,9 (gag-pol 발현자 플라스미드), SCRPSY¹⁰ (LTR 구동 리포터 플라스미드) 및 pczVSV-G를 사용하십시오. 대안은 재료 표에서 논의됩니다. 플라스미드 비율은 상이한 플라스미드/형질주입 시스템에 대해 최적화되어야 할 수 있다.
4. 3일차(늦은 아침): 피펫팅으로 세포에서 배지를 조심스럽게 제거하고 5mL의 새로운 DMEM으로 세척하고 5mL의 새로운 DMEM으로 교체합니다.
5. 4일차(오전): 세포에서 상청액을 수집하여 바이러스를 수확하고 5mL의 신선한 DMEM으로 교체합니다. VLP 함유 상청액을 0.45 nm 필터에 통과시키고, 분취량을 -70°C로 옮겨 보관한다. 반복적인 동결-해동 주기로 인해 바이러스 역가가 손실되므로 분취량이 계획된 실험에 적합한 크기(제안으로 250μL)인지 확인하십시오.
6. 5일차(오전): 1.5에서와 같이 바이러스를 수확하되 상청액을 수집한 후 플레이트를 버립니다.

2. 사용 전 새로운 VLP 역가

1. 제1일: 시드 293T를 24-웰 플레이트의 웰당 2 x 10⁵ 세포-각 백본에 대해 알려진 감염성의 바이러스를 포함하여 바이러스 당 4 웰을 적정한다. 주어진 세포 스톡에 대한 파종 밀도를 최적화합니다.
2. 2일차: 플레이트를 관찰하여 컨플루언스를 확인합니다(이상적으로는 ~70%). 1.5단계와 1.6단계에서 바이러스가 함유된 상청액을 해동합니다. 각 웰에 0, 10, 25 또는 100 μL를 추가합니다.
3. 제4일(오전): 유세포분석에 의한 분석을 위해 세포를 수확한다.
   1. 조심스럽게 피펫팅하거나 흡인하여 배지를 제거합니다. 250μL의 인산염 완충 식염수(PBS)로 세포를 부드럽게 씻습니다. 250 μL PBS로 위아래로 피펫팅하여 플레이트로부터 세포를 제거하고, 마이크로원심분리 튜브로 옮긴다. 250 % 파라 포름 알데히드 4 μL를 첨가하십시오 (최종 농도를 2 %로 취함).
      주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이 있습니다. 염소 기반 소독제와 혼합해서는 안됩니다.
   2. 세포를 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 펠렛하고, 상청액을 버리고 세포 펠렛을 200μL의 PBS 또는 대안적인 유동 세포분석 완충액에 재현탁시킨다. 유세포분석에 의해 RFP 또는 YFP를 적절하게 분석합니다. 알려진 감염성 재고의 값에 대해 지정된 바이러스 스톡의 감염성을 정규화합니다.
      참고: VLP는 또한 p24 효소-결합 면역흡착 분석(ELISA)에 의해 표준화될 수 있고; 그러나, 이것이 반드시 VLP 감염성의 양호한 지표는 아니며, 특히 VLP 스톡이 상이한 형질감염으로 제조되는 경우이다. 공개된 중간 조직 배양 감염 용량 또는 감염 다중성(TCID50/MOI) 방법¹¹ 도 상대적 정량을 제공할 수 있지만 MLV에 대해서는 잘 확립되지 않았습니다. 상대 형광은 상용 역전사효소 ELISA 방법에 대한 비용 효율적인 대안을 제공합니다.

3. SAMHD1 및 YFP를 발현하는 VLP를 이용한 U937의 형질도입

참고: 3-6단계는 제한 실험을 구성합니다. 계획하기 쉽도록 날짜가 매겨집니다.

1. 1일차(오후): MLV-야생형 SAMHD1-YFP(양성 대조군), MLV-SAMHD1(HD206-7AA)-YFP(음성 대조군) 및 변이체 MLV-SAMHD1-YFP(실험 샘플)를 포함하는 형질도입을 위한 VLP 해동. 표준화된 VLP를 마이크로원속 튜브에서 로스웰 파크 기념 연구소 1640 배지(RPMI)로 최종 부피 500μL로 희석하고 폴리브렌(10mg/mL) 0.5μL를 추가하고 깜박임으로 혼합합니다.
   1. VLP를 미리 적정할 수 없는 경우 먼저 100μL를 사용하십시오. VLP 유도 독성을 제한하기 위해 VLP 대 RPMI의 최대 1:1 비율을 사용합니다. 약 30 % 형질 도입을 목표로합니다.
2. 분취량 5 x 10⁵ U937 세포를 각 형질도입 조건에 대해 멸균 미세원심분리 튜브에 넣습니다. 펠렛을 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여, 상청액을 제거한다 (유동 세포분석을 위한 형질도입되지 않은 대조군으로서 2개의 추가 튜브 포함). 세포 펠릿을 500μL의 희석된 VLP(또는 형질도입되지 않은 대조군의 경우 RPMI)에 재현탁하고 24웰 플레이트의 한 웰로 옮깁니다.
3. 탁상용 원심분리기에서 800 x g 로 20°C에서 90분 동안 접종합니다. 1mL의 37°C RPMI를 웰에 첨가하고 37°C 인큐베이터에서 3일 동안 회복되도록 한다.

4. 변환 된 U937의 차별화

1. 4일차(오전): 부드럽게 피펫팅하여 세포를 재부유시키고 350μL를 12웰 플레이트의 4웰 각각에 옮깁니다. 150 nM PMA를 함유하는 700 μL의 37°C RPMI를 각 웰에 첨가하여 100 nM의 최종 농도를 주고 3일 동안 분화시켰다.
   알림: PMA는 분말로 구입하며 DMSO에서 1mM로 재현탁하고 어두운 곳에 보관해야 합니다. 100μM의 작업 재고는 DMSO로 1mM 재고에서 1/10을 희석하여 준비해야 합니다.

5. 분화된 SAMHD1 발현 U937의 HIV-RFP 감염

1. 7일차: 현미경으로 세포를 관찰합니다. 세포가 부착되어 있는지 확인하십시오. 모든 웰에서 배지를 흡입하고 각 4세트 중 1개의 웰에 1mL의 RPMI를 추가하여 형질도입되지 않고 감염되지 않은 대조군과 단색 대조군을 허용합니다. 약 10μL의 HIV-1-RFP(가이드로 약 10ng p24)가 포함된 0.5mL의 RPMI를 다른 모든 웰에 다시 추가합니다. 약 50 %의 감염을 목표로합니다.
2. 8일차(오전): 감염된 각 웰에 0.5mL의 RPMI를 추가합니다.

6. 유세포 분석

참고: 유세포분석 파이프라인에 살아있는 죽은 얼룩을 포함하는 것이 좋습니다. 그러나 U937 셀의 품질이 양호한 경우 다운스트림 분석에 부정적인 영향을 미치지 않고 이 단계를 생략할 수 있습니다. 트립신 세포의 부드러운 피펫팅은 쉽게 단일 세포 현탁액을 생성해야 합니다.

1. 10일차(아침): 우물에서 배지를 흡입하고 PBS로 한 번 씻습니다. 300μL의 세포 해리 효소(또는 트립신)를 5-10분 동안 추가합니다. 300μL의 PBS를 추가로 추가하고 모든 세포가 플레이트에서 떨어져 나왔는지 완전히 재현탁한 다음 유세포분석 튜브로 옮깁니다.
2. 300 % 파라 포름 알데히드 4 μL를 첨가하십시오 (최종 농도를 2 %로 취함). 세포를 5분 동안 500 x g 에서 원심분리하여 펠렛하고, 상청액을 버리고 세포 펠렛을 200μL의 PBS 또는 대안적인 유동 세포분석 완충액에 재현탁시킨다. 유세포 분석으로 분석하십시오.
   참고: 아래 단계는 Fortessa 분석기를 위한 것이지만 RFP 및 YFP 형광을 판독할 수 있는 모든 분석기를 사용하여 동등한 분석을 수행할 수 있습니다. 유세포분석 분석을 설정하기 전에 현지 유세포분석 지원 또는 기타 숙련된 연구원에게 문의하십시오. 많은 샘플을 동시에 스크리닝해야 하는 경우 고처리량 샘플러가 적합할 수 있습니다. 이 경우 더 큰 셀 번호와 부피가 권장됩니다.

7. 유세포 분석

1. 필요한 10 분 전에 세포 분석기를 켜고 컴퓨터를 켭니다. 폐기물이 비어 있고 외피 탱크가 가득 찼는지 확인하십시오.
2. 기기에 로그인하고 분석 소프트웨어를 엽니다.
3. 팔을 옆으로 움직이고 수관을 빼고 유속을 높음 으로 설정하고 프라임을 누릅니다. 표시등이 꺼질 때까지 기다렸다가 세 번 더 반복하십시오.
4. 물을 다시 켜고 3분 동안 높은 곳에서 실행한 다음 낮음 으로 전환하고 획득을 진행할 때까지 대기를 누릅니다.
5. 한편 소프트웨어 내에서 실험을 설정하십시오.
   1. 실험/새 실험(현지 지침에 따른 이름)을 선택합니다. 검사기에서 불필요한 형광 색소를 삭제하고 청색 레이저 530/30 및 황색 레이저 610/20 또는 기계의 YFP 및 RFP에 권장되는 레이저 및 필터 조합을 남겨 둡니다.
   2. 실험을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 세포분석기 설정/응용 프로그램 설정/워크시트 만들기를 선택합니다. 워크시트에서 해당 아이콘을 클릭하고 축 레이블을 클릭하여 축을 변경하여 전방 산란 영역(FSC-A)/측면 산란 영역(FSC-A) 도트 블롯 및 YFP 히스토그램, RFP 히스토그램 및 GFP/YFP 도트 블롯을 만듭니다.
   3. 실험을 다시 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 새 표본을 추가합니다. 적절하게 이름을 바꿉니다. 더하기 기호를 클릭하여 시편을 열면 새 튜브가 나타납니다.
6. View에서 획득 대시보드를 열고 감염되지 않은 변환되지 않은 컨트롤을 로드하고 Acquire를 누릅니다. 대시보드에서 FSC 및 SSC 전압을 조정하여 셀을 왼쪽 아래 사분면에 배치합니다(축에 셀 없음). 이 인구 P1 주변의 게이트. 다른 플롯을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 P1 표시를 선택하여 후속 분석에서 파편을 제거합니다.
7. YFP(야생형 SAMHD1만 해당)에 대한 단색 컨트롤을 로드하고 획득합니다. 대시보드에서 YFP 전압을 조정하여 대부분의 형광 셀이 축의 가장자리가 아닌 검출기 범위 내에 있도록 합니다. 단색 RFP 제어에 대해 반복합니다.
8. 변환되지 않은, 감염되지 않은 단색 컨트롤을 사용하여 자동 보정을 실행합니다.
   1. 메뉴에서 실험 > 보정 설정 > 보정 컨트롤 만들기를 선택하여 일반 워크시트로 전환합니다. 얼룩이없는 일반 워크 시트를 선택하고 실행을 누르고 얼룩지지 않은 컨트롤에 대해 획득하십시오.
   2. 손상되지 않은 셀(P1) 주위에 게이트를 그리고 기록합니다. 튜브를 제거하고 기기를 대기 모드로 전환합니다. P1을 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 모든 보정 컨트롤에 적용을 클릭합니다.
   3. RFP 일반 워크시트로 전환하고 실행을 누릅니다. 단색 RFP 컨트롤을 기록하고 컴퓨터를 대기 모드로 전환합니다 . 소프트웨어가 자동으로 양수 모집단을 선택해야 합니다.
   4. YFP 단색 제어에 대해 반복합니다. 실험 > 보정 설정을 선택하여 보정 계산 > 링크를 > 저장하고 저장합니다.
9. 전역 워크시트로 전환합니다. HIV-RFP에 감염된 야생형 SAMHD1로 형질도입된 세포를 획득하고 YFP 및 RFP에 대해 각각 수직 및 수평으로 정렬된 사분면의 모서리에서 4개의 별개의 집단을 볼 수 있는지 확인합니다. 튜브를 제거하고 대기를 누릅니다.
10. 형질도입되지 않고 감염되지 않은 샘플을 다시 로드하고 실행을 누르고 P1을 중지 게이트로 사용하여 30,000개의 이벤트를 기록합니다 . 나머지 샘플(다른 컨트롤 포함)에 대해 반복합니다. 실행 중이거나 사후에 샘플의 이름을 바꿉니다. 내보낸 후에는 파일 이름을 바꿀 수 없습니다.
11. 데이터를 .fcs 파일로 내보내고 로컬 지침에 따라 유체를 청소합니다.

8. 데이터 분석

참고: 다음 단계는 FlowJo v10의 분석에 해당합니다. 그러나 다른 분석 소프트웨어에서 동일한 단계를 쉽게 수행할 수 있습니다.

1. 소프트웨어를 열고 모든 .fcs 파일을 대시 보드로 드래그하십시오. 보정 컨트롤을 선택하고 보정 하위 폴더로 드래그합니다. 변환되지 않은 감염되지 않은 튜브에 대한 파일을 두 번 클릭하여 열면 FSC-A/SSC-A 플롯이 나타납니다.
2. 다각형 도구를 선택하고 왼쪽 아래 모서리에 있는 파편을 제외한 온전한 셀 모집단의 게이트를 선택합니다. 이 셀의 이름을 지정합니다. 이 게이트를 모든 샘플 막대의 전체 튜브 모집단으로 드래그합니다. 수평 화살표 버튼을 사용하여 각 개별 샘플을 스크롤하여 게이팅이 각 튜브에 적합한지 확인합니다.
3. 형질도입되지 않고 감염되지 않은 샘플에 대한 세포 집단을 두 번 클릭하고 축을 FSC 높이(H) 대 FSC 영역(A)으로 조정합니다. 직사각형 게이트를 사용하여 단일 큰 모집단을 선택하여 이중선을 제외합니다. 소프트웨어는이 단일 셀의 이름을 자동으로 제안합니다.
4. 이 게이트를 모든 세포 집단으로 드래그하고 다시 게이팅이 모든 샘플에 적합한지 확인합니다. 감염되지 않은 형질도입된 샘플에 대한 단일 세포 집단을 선택하고 축을 보정된 청색 레이저(y , YFP) 대 보정된 노란색 레이저(x, RFP)로 변경합니다. 축에서 T 를 누르고 x와 y에 대해 이지수 척도를 선택합니다.
5. 사분면 게이팅 도구를 선택하고 음수 셀 모집단의 오른쪽 위 극단을 클릭합니다. 이 예비 게이팅을 모든 단일 세포 모집단에 적용하여 모든 표본 막대로 드래그합니다. 사분면 게이트가 모집단을 만족스럽게 분리하지 못하는 경우 그림 2와 같이 다각형 도구를 사용하여 개별 사분면을 게이트해야 할 수 있습니다.
6. 야생형 SAMHD1 전용 샘플(YFP만 해당)로 스크롤하여 변환되지 않은(YFP 음성) 및 YFP 양성 사이의 게이팅이 올바른지 확인합니다. 희미한 YFP 세포에서 음성을 구별하기 위해 등고선보기로 전환하는 것이 도움이 될 수 있습니다. 맨 위 YFP + ve 셀이 넓게 퍼져 있으면 위쪽 수직 게이트를 오른쪽으로 조정하십시오.
7. 모든 샘플을 스크롤하여 YFP 양성과 관련하여 게이팅을 확인합니다. 모든 표본에 유효한 YFP 음수와 양성 간의 최상의 분할을 사용합니다.
   참고: 보상은 야생형 SAMHD1 YFP 발현 수준을 기준으로 계산되었습니다. 다른 SAMHD1-YFP 형질도입 세포 간에 감염 수준이 매우 다른 경우 보상을 조정해야 할 수 있습니다. 따라서, YFP VLP가 사용 전에 정규화되는 것이 바람직하다.
8. 형질도입되지 않은 HIV-RFP 감염 튜브로 스크롤하여 감염되지 않은 RFP 음성과 감염된 RFP 양성 사이의 게이팅이 올바른지 확인합니다. 필요한 경우 등고선 보기를 사용하여 적절하게 조정하고 나머지 샘플을 스크롤하여 게이팅이 모든 샘플에 유효한지 확인합니다.
9. 각 샘플에는 이중 음성(Q4: 왼쪽 하단, 형질도입되지 않음, 감염되지 않음), YFP 양성(Q1: 왼쪽 상단, SAMHD1 발현, 비감염), RFP 양성(Q3: 오른쪽 하단, 형질도입되지 않음, HIV 감염) 및 이중 양성(Q2: 오른쪽 상단, SAMHD1 HIV 감염). 아이콘을 클릭하여 테이블 편집기를 열고 4개의 사분면 게이트를 대시보드로 끕니다. Excel 내보내기 를 선택하고 테이블 만들기를 클릭합니다. 생성된 스프레드시트를 로컬 파일 명명 규칙에 따라 저장합니다.
10. 플롯 및 게이팅 전략의 표현을 내보내려면 레이아웃 편집기 아이콘을 클릭합니다. 각 모집단을 선택하고 필요한 축, 레이블 지정 및 간격이 있는 편집기로 드래그합니다.
11. 모든 샘플에 대해 표시된 동일한 플롯으로 배치를 생성하려면 하나의 열을 선택하고 배치를 누릅니다. 너비로 배율을 누른 다음 페이지 나누기를 피하십시오. 필요한 파일 형식으로 저장합니다.
12. 내보낸 스프레드시트에서 YFP-ves의 백분율 RFP(RFP+ve / (이중 부정 + RFP+ve)) 및 YFP+ves의 백분율 RFP(이중 양성 / (이중 양성 + YFP+ve)) 및 (YFP+ve의 %RFP/YFP-ve의 %RFP)의 최종 열을 생성하여 제한 비율을 계산합니다( 그림 1 참조). 각 SAMHD1 구조에 대한 복제 데이터의 평균을 구하고 적절한 데이터 분석 소프트웨어를 사용하여 테스트된 SAMHD1 변이체의 제한 값이 야생형 및/또는 206-7AA와 유의하게 다른지 여부를 계산합니다.

결과

위의 분석 결과는 야생형 SAMHD1 양성 대조군의 경우 0.25 이하, 음성 대조군의 경우 1.0의 제한 비율을 산출해야 합니다. 이 두 가지 품질 관리 검사가 유효하다면 결과의 통계적 유의성을 고려하십시오. 따라서 야생형과 유의미한 차이가 없는 SAMHD1 변이체는 이러한 맥락에서 SAMHD1 제한에 영향을 미치지 않는 치환을 수행합니다. 야생형과 크게 다른 것은 손상된 제한을 보여줍니다. 이들이 음성 대조군과 크게 다르지 않다면 이러한 맥락에서 제한할 수 있는 능력이 부족합니다(그림 4 왼쪽 패널).

야생형 SAMHD1 제한 값이 0.3보다 크면 테스터 바이러스에 대한 결과가 지표가 될 수 있지만 신뢰할 수는 없습니다. 야생형 단백질에 의한 비효과적인 제한은 U937 세포를 재구성 후 회복 후 너무 일찍 사용하거나(2주 이내) 너무 오래된(>2-3개월) 사용할 때 발생할 수 있습니다. 이들 파라미터는 주어진 세포 스톡에 대해 경험적으로 결정될 필요가 있을 수 있다. 전형적으로, 계대가 낮을수록, 세포가 더 안정적으로 분화하고, 따라서 SAMHD1 제한에 대한 적절한 환경을 제공한다. SAMHD1-YFP 또는 HIV-RFP의 부적절한 감염 수준은 또한 보상 및 제한 비율의 다운스트림 결정 모두에 어려움을 초래할 수 있습니다. 그림 4의 오른쪽 패널에 예가 나와 있습니다.

음성 대조군이 1.0(0.9-1.2 범위 밖)에서 벗어나면 분석에 문제가 있거나 감염된 세포의 비율, 게이팅 전략 또는 세포의 건강이 분석에 영향을 미치므로 나타낼 수 있습니다. 위의 참고 사항을 참조하십시오.

그림 1: 회로도 개요 프로토콜. VLP, 바이러스 유사 입자, PMA, 포볼 미리 스테이트 아세테이트. 번호가 매겨진 단계는 프로토콜의 단계에 해당합니다. BioRender.com 사용하여 제작 된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 레트로바이러스 플라스미드의 개략도 . (A) 패키징 벡터 (B) 전달 벡터 (C) VSV-G 엔벨로프 익스프레서. 키 코딩 및 규제 요소가 표시됩니다. 자세한 내용은 재료 표를 참조하십시오. CMV IE: 거대세포 바이러스 즉시-초기 프로모터, BGH: 소 성장 호르몬, pA: polyA, RRE: Rev 반응 요소, CMV-LTR: 복합 CMV-HIV-1 LTR 프로모터, Psi: HIV-1 패키징 신호, cPPT/CTS: 중앙 폴리퓨린 관/중앙 종결 서열, SV40: 유인원 액포 바이러스 40. BioRender.com 사용하여 제작 된 그림. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3: 유세포분석 분석을 위한 게이팅 전략. (A) 보상 제어: 왼쪽 패널은 형질도입되지 않고 감염되지 않은 대조군에 대한 택트 내 세포에 대한 FSC-A/SSC-A 게이팅을 보여줍니다. 중앙 및 오른쪽 패널에는 보정되지 않은 데이터가 검은색으로 표시되고 보정된 YFP(중간) 및 RFP(오른쪽)에 대한 단색 보정 컨트롤의 스크린샷이 표시됩니다. (B) 위의 보상 통제에 대한 해당 보상 매트릭스 및 플롯. (C) 게이팅 전략. 파편은 FSC-A/SSC-A(왼쪽 패널)에 의한 모든 세포의 분석을 통해 제거됩니다. 더블릿은 FSC 높이 대 면적(중앙 패널)의 게이팅으로 제외됩니다. 오른쪽 패널은 야생형 SAMHD1에 의한 HIV-1 제한의 예를 보여줍니다. 축은 각각 YFP(SAMHD1) 및 RFP(HIV) 양성 세포에 해당하는 보정된 청색 및 황색 레이저 형광을 보여줍니다. 사분면 게이트는 RFP 및 YFP에 대한 네거티브 및 단색 컨트롤의 비교를 통해 그려집니다. 숫자는 부모 인구의 백분율을 나타냅니다. GFP를 사용하는 YFP에 대한 보정 값은 훨씬 더 높지만 적절한 필터 세트를 사용하여 구별할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4: 예상 결과: 이상적인 데이터와 최적이 아닌 데이터. (A) 최적(왼쪽) 및 차선(오른쪽) 데이터에 대한 대표적인 YFP/RFP 플롯. 숫자는 부모 인구의 백분율을 나타냅니다. 오른쪽 패널에서 HIV 감염이 너무 낮아 보상 및 게이팅에 어려움이 있습니다. 제한 비율이 0.5로 예상보다 높습니다. (B) 통계 소프트웨어를 사용하여 생성된 야생형(WT, 적색) 또는 음성 대조군(HD206-7AA, 흑색)에 대한 SAMHD1의 변이체에 대한 제한비의 플롯. 각 점은 반복실험 값을 나타냅니다. 평균과 표준 편차가 표시됩니다. 각 그룹 간의 쌍체 t-검정은 표시된 모든 경우에 유의했습니다. 왼쪽: 이상적인 데이터 - WT는 약 0.2의 예상 제한을 나타내고 음수는 1.0을 나타냅니다. 변종 R372D (회색)는 WT와 유의하게 다르지만 음성 대조군과는 유의하지 않으므로 제한 능력을 상실했습니다. 오른쪽: 최적이 아닌 데이터. 여기서 음성은 예상대로 동작하지만 6번의 반복 실험 모두에서 WT는 감염률이 낮기 때문에 제한 비율이 0.5에 불과합니다. 그룹 내의 낮은 분산은 R143H가 WT 및 음성과 통계적으로 다른 중간 표현형을 나타내는 반면 G209S는 제한하지 않음을 의미합니다. 그러나 양성 대조군이 예상 제한 비율을 제공하지 않았기 때문에 신선한 세포로 반복해야합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

토론

위의 노트에서 논의된 바와 같이, 프로토콜의 중요한 측면은 VLP 생산을 위한 올바른 세포 표현형을 유지하고 SAMHD1 제한을 관찰하기 위한 적절한 환경을 조성하는 데 중점을 둡니다. 첫째, 2색 유세포분석에 의한 제한의 정확한 분석은 분석을 위해 플롯의 각 영역에 충분한 세포가 있도록 형질도입 및 감염된 세포의 적절한 비율을 달성하는 데 의존합니다. 따라서 연구원은 1 미만의 MOI를 목표로해야합니다 ( 프로토콜 참조). 형질도입 및 감염률이 너무 높거나 낮으면 감염되지 않거나 이중으로 감염된 세포가 없기 때문에 분석에 문제가 발생합니다. 마찬가지로, SAMHD1 벡터에 대한 유사한 형질도입 속도는 동일한 보상 매트릭스와 게이팅을 전체 실험에 적용하여 후속 분석에 대한 신뢰도를 높이는 데 중요합니다.

둘째, 사용된 U937 세포의 나이는 성공적으로 분화하는지 여부에 대한 핵심 요소입니다. 성공적인 분화는 순응도 관찰, 분화 후 시간이 지남에 따라 배지의 산성화 감소 및 분석에서 야생형 양성 대조군에 의한 적절한 제한을 통해 모니터링할 수 있습니다. 최대 5 일의 차별화가 성공했습니다.

이 분석의 주요 이점 중 하나는 유연성입니다. SAMHD1의 다양한 변형 버전(도메인, 아미노산, 종 서열)은 벡터의 간단한 부위 지향 돌연변이유발 또는 클로닝을 통해 테스트할 수 있습니다. 마찬가지로 테스터 바이러스의 변종을 탐색할 수 있습니다. 이 분석은 dNTP에 결합하는 능력이 감소된 HIV-1 역전사효소 돌연변이체가 SAMHD1 제한에 더 민감하다는 것을 입증하기 위해 이전에 사용되었습니다. SAMHD1에 의한 다른 바이러스의 제한을 테스트하기 위해 동일한 원리를 사용할 수 있습니다. 또한 다양한 분화 조건 또는 세포 내 dNTP 농도의 인공 조작을 사용하여 세포 내 조건과 SAMHD1 활성 간의 상호 작용을 추가로 조사할 수 있으며, 이는 Bishop 실험실에서 활발한 연구 영역입니다. SAMHD1과 다양한 뉴 클레오 시드 역전사 효소 억제제의 상호 작용이 또한 설명되었으며,이 분석을 사용하여 나타난 SAMHD1의 효과는 1 차 세포^12,13,14,15에서 사용하도록 변형되었습니다.

일차 세포에서 사용하기 위한 프로토콜의 적응은 형질전환 세포에서 대사 표현형을 검사함으로써 제기되는 한계를 극복합니다. 그러나 기존 형식은 특히 고처리량 샘플러가 있는 유세포분석기를 사용하여 고처리량 분석을 위한 편리하고 기술적으로 덜 어려운 프로토콜을 허용합니다. 프로토콜을 조정할 때, 방관자 효과 (예 : 면역 신호 전달)에 대한 내부적으로 형질 도입되지 않은 세포의 감수성을 고려해야합니다.

세포 생물학의 여러 측면과 마찬가지로 이러한 분석은 주어진 현상을 이해하기 위한 전체론적 접근 방식의 일부로 사용되는 것이 필수적입니다. SAMHD1 활성¹⁶에 대한 생화학적 분석의 병행, 세포 내 dNTP 풀의 정량화, 인간, 생체 외 및 동물 모델에서 SAMHD1 돌연변이 표현형 관찰(전 세계 실험실에서 수행, 일부는 이번 호에 설명됨)은 이 복잡한 단백질에 대한 진화하는 이해의 핵심입니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
293T cells	ATCC	CRL-3216
0.45 µm syringe filters	Sartorius	FCT122
10 cm dishes	Corning	430167	virus preps can be scaled up through transfection in higher capacity plates/flasks - see transfection reagent guidance
12 well plates	Greiner	665180
24 well plates	Greiner	662160
BD LSRFortessa cell analyzer	BD Bioscience	649225	alternative analysers can be used as long as they can read RFP and YFP fluorescence
DMEM	Sigma	D6429	ATCC recommends Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) is modified to contain 4 mM L-glutamine, 4500 mg/L glucose, 1 mM sodium pyruvate, and 1500 mg/L sodium bicarbonate.
DMSO	Fisher	BP-231-100
fetal bovine serum	Gibco	10500064
Flowjo	BD Bioscience	-	alternative analysis software can be used
light microscope	-	-	Any bright field light microscope
p8.91	-	-	HIV GagPol expressor (PMID: 8602510)
paraformaldehyde (4 % in PBS)	Alfa Aesar	J61889
PBS	Sigma	D8537
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	ThermoFisher	15140122
phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)	Sigma	P8139
polybrene	Sigma	TR-1003
pKB4	-	-	Murine leukaemia Virus GagPol expressor (PMID: 23035841)
pLGatewaySAMHD1eYFP	-	-	MLV packaging plasmid encoding wild-type human sequence. Details and cloning procedures Arnold et al 2015 (Ref 1).
pLGatewaySAMHD1HD206-7AAeY FP	-	-	As above, encodes amino acid substitutions at crucial active sites residues
Prism	Graphpad	-	https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ Other data representation software are also suitable
pVSV-G	-	-	VSV-G expressor (https://www.addgene.org/138479/), alternative: pMD2.G (https://www.addgene.org/12259/)
RPMI	ThermoFisher	21875034
screw-cap tubes	StarLab	E1415-2231
SCRPSY	-	-	HIV packaging plasmid encoding RFP, Sam Wilson, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5026698/
stripettes 10 mL	Corning	10084450
stripettes 5 mL	Corning	10420201
TrypLE express	Gibco	12604021	Trypsin will also be suitable
Turbofect	ThermoFisher	R0531	alternative transfection reagents will also work well
U937 cells	ATCC	CRL-1593.2