דור אורגנוידים במוח האדם למידול מחלות מיטוכונדריאליות

Summary

אנו מתארים פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח המושרים תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים והשימוש בהם בדוגמנות מחלות מיטוכונדריאליות.

Abstract

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף החומרים, וכיום הן חשוכות מרפא. מחלות אלה גורמות למומים נוירו-פיתוחיים שהמנגנונים הבסיסיים שלהם נותרים להתגלות. מחסום מרכזי הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את הליקוי העצבי המוקדם שנראה בחולים. ההתקדמות בטכנולוגיה של תאי גזע פלוריפוטנטים המושרים (iPSCs) מאפשרת ייצור של אורגנוידים תלת ממדיים (3D) במוח שניתן להשתמש בהם כדי לחקור את ההשפעה של מחלות על הפיתוח והארגון של מערכת העצבים. חוקרים, כולל מחברים אלה, הציגו לאחרונה אורגנוידים במוח האנושי מודל הפרעות מיטוכונדריאליות. מאמר זה מדווח על פרוטוקול מפורט לדור החזק של אורגנוידים אנושיים שמקורם ב- IPSC והשימוש בהם בפרופילים ביו-אנרגטיים מיטוכונדריאליים וניתוחי הדמיה. ניסויים אלה יאפשרו שימוש באורגנוידים במוח כדי לחקור תפקודים מטבוליים והתפתחותיים ועשויים לספק מידע חיוני כדי לנתח את הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות.

Introduction

מחלות מיטוכונדריאליות מייצגות את הכיתה הגדולה ביותר של טעויות מולדות של חילוף ^{החומרים1}. הם נגרמים על ידי מוטציות גנטיות המשבשות תהליכים מיטוכונדריאליים שונים, כולל זרחן חמצוני (OXPHOS)², הרכבת שרשרת הנשימה, דינמיקה מיטוכונדריאלית, ותעתיק DNA מיטוכונדריאלי או ^שכפול3. רקמות עם דרישות אנרגיה מושפעים במיוחד על ידי תפקוד מיטוכונדריאלי4. בהתאם, חולים עם מחלות מיטוכונדריאליות בדרך כלל לפתח ביטויים נוירולוגיים מוקדמים.

אין כיום טיפולים זמינים לילדים הנגועים במחלות מיטוכונדריאליות5. מכשול מרכזי להתפתחות תרופות של מחלות מיטוכונדריאליות הוא היעדר מודלים יעילים המשיבים את קורס המחלה ^{האנושית6}. כמה מהמודלים החייתיים הנחקרים כיום אינם מציגים את הפגמים הנוירולוגיים הקיימים ^{בחולים7}. לפיכך, המנגנונים שבביד הפתולוגיה העצבית של מחלות מיטוכונדריאליות עדיין אינם מובנים במלואם.

מחקרים אחרונים יצרו IPSCs מחולים מושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות והשתמשו בתאים אלה כדי להשיג תאים עצביים ספציפיים לחולה. לדוגמה, פגמים גנטיים הקשורים למחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, נמצאו כגורמים לסטיות בביו-אנרגטיקה ^תאית8,9, סינתזת ^{חלבונים10} וסידן הומאוסטזיס9,11. דיווחים אלה סיפקו רמזים מכניים חשובים על הליקוי העצבי המתרחש במחלות מיטוכונדריאליות, וסללו את הדרך לגילוי תרופות למחלות חשוכות מרפא ^אלה12.

תרבויות דו-ממדיות (דו-ממדיות), לעומת זאת, אינן מאפשרות לחקור את המורכבות האדריכלית והארגון האזורי של איברים ^{תלת-ממדיים13}. לשם כך, השימוש באורגנוידים מוחיים תלת-ממדיים הנגזרים מ- ^iPSCs14 ספציפי למטופל עשוי לאפשר לחוקרים להשיג מידע חשוב נוסף ובכך לעזור לנתח כיצד מחלות מיטוכונדריאליות משפיעות על התפתחותה ותפקודה של מערכת ^{העצבים15}. מחקרים המעסיקים אורגנוידים במוח שמקורם ב- IPSC כדי לחקור מחלות מיטוכונדריאליות מתחילים לחשוף את המרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות.

אורגנוידים חוט השדרה נושא מוטציות הקשורות למחלה המיטוכונדריאלית, אנצפלופתיה מיטוכונדריאלית, חמצת לקטית, ותסמונת פרקים דמויי שבץ (MELAS), הראו נוירוגנזה פגומה ובידול נוירון מוטורי ^מושהה16. אורגנוידים קליפת המוח נגזרים מחולים עם המחלה המיטוכונדריאלית, תסמונת לי, הראו גודל מופחת, פגמים ביצירת ניצני אפיתל עצביים, ואובדן ארכיטקטורה קליפת ^המוח17. אורגנוידים במוח מחולי תסמונת לי הראו כי פגמים המחלה ליזום ברמה של תאי אבות עצביים, אשר לא יכול להתחייב חילוף החומרים המיטוכונדריאלי, גרימת הסתעפות עצבית חריגה ^{מורפוגנזה18}. לכן, אבות עצביים עשויים לייצג יעד טיפולי תאי למחלות מיטוכונדריאליות, ואסטרטגיות לקידום תפקודם המיטוכונדריאלי עשויות לתמוך בהתפתחות התפקודית של מערכת העצבים.

השימוש באורגנוידים במוח עשוי לעזור לחשוף את הרכיבים הנוירו-התפתחותיים של מחלות מיטוכונדריאליות. מחלות מיטוכונדריאליות נחשבות בעיקר ניוון עצבי ^מוקדם5. עם זאת, פגמים נוירו-התפתחותיים קיימים גם בחולים המושפעים ממחלות מיטוכונדריאליות, כולל עיכוב התפתחותי ופגיעה ^{קוגניטיבית19}. אורגנוידים מוחיים ספציפיים לחולה עשויים לעזור לטפל בהיבטים אלה ולפרט כיצד מחלות מיטוכונדריאליות עשויות להשפיע על התפתחות המוח האנושי. תפקוד לקוי של מיטוכונדריה יכול גם לשחק תפקיד פתוגנטי במחלות נוירולוגיות נפוצות יותר, כגון מחלת אלצהיימר, מחלת פרקינסון ומחלת ^{הנטינגטון4}. לפיכך, לפרט את ההשפעה של פגמים מיטוכונדריאליים נוירו-פיתוח באמצעות organoids המוח עשוי גם להיות אינסטרומנטלי לחקר מחלות אלה. מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט ליצירת אורגנוידים במוח לשחזור שניתן להשתמש בהם לביצוע מודל מחלות של מחלות מיטוכונדריאליות.

Protocol

הערה: השימוש ב- IPSCs אנושי עשוי לדרוש אישור אתי. iPSCs בשימוש במחקר זה נגזרו מאנשים בקרה בריאה לאחר אישור אתי מקומי (#2019-681). כל נהלי תרבית התא חייבים להתבצע תחת מכסה המנוע של תרבית תאים סטרילית, בזהירות חיטוי כל ריאגנטים ומתכלים לפני המעבר מתחת למכסה המנוע. IPSCs אנושי המשמש לבידול צריך להיות מספר מעבר מתחת 50 כדי למנוע סטיות גנומיות פוטנציאליות שעלולות להתרחש על תרבות נרחבת. המצב pluripotent של התאים צריך להיות מאומת לפני יצירת organoid, למשל, על ידי ניטור הביטוי של סמנים הקשורים pluripotency כגון NANOG או OCT4. בדיקות Mycoplasma צריכות להתבצע כל שבוע כדי להבטיח תרבויות ללא מיקופלסמה.

1. דור האורגנוידים במוח

1. תרבות של IPSCs אנושיים
   1. תרבות IPSCs אנושי בתנאים ללא הזנה במדיום iPSC (ראה את טבלת החומרים) על לוחות מצופים 6-באר ולשמור אותם בחממה תרבית רקמות לחות ב 37 °C (5% _CO2.
      הערה: נשיאת תאי מאכיל עלולה לעכב את ההבחנה האורגנוידת. מעבר התאים לפחות פעם אחת בתנאים ללא מאכילה.
   2. מעבר IPSCs ב 80% השפעה באמצעות מדיום ניתוק ללא אנזימים ביחסים הנעים בין 1:4 ל 1:12. כדי להגביר את הישרדות התאים, הוסיפו מעכב 10 מיקרומטרי קינאז חלבון הקשור לרו (ROCK) (Y27632) לאחר כל פיצול.
2. נתק את ה- IPSCs (80% השפעה)-יום 0.
   1. הכן בידול קליפת המוח בינוני I (CDMI) (טבלה 1). מדיום CDMI לפני המלחמה בטמפרטורת החדר (22-25 °C (22 °F) לפני הוספתו לתאים.
   2. לשטוף את הבארות המכילות את iPSCs עם תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS) כדי להסיר תאים מתים ופסולת.
   3. הוסף 500 μL של ריאגנט A (טבלת חומרים) מחמם מראש לכל באר ודגר במשך 5 דקות ב 37 °C (7 °F). בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח ניתוק תאים.
   4. הוסף 1 מ"ל של iPSC בינוני כדי לדלל reagent A כדי לנטרל את פעילותה.
   5. השתמש בצינור 1000 μL כדי לנתק את התאים על ידי צנרת למעלה ולמטה ולהעביר את ההשעיה התא לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.
   6. צנטריפוגות בעדינות IPSCs ב 125 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר (22-25 °C (25 °F).
   7. בזהירות לשאוף supernatant כדי למנוע הפרעה גלולה התא.
   8. תגדיל מחדש את הכדור עם 1 מ"ל של CDMI כדי להשיג השעיה של תא בודד, ולספור את מספר התא.
   9. הכן את מדיום הזריעה עם 9,000 iPSCs לכל 100 μL ב- CDMI בתוספת מעכב 20 מיקרומטר ROCK, מעכב WNT-קטנין 3 מיקרומטר (IWR1) ו 5 μM SB431542.
   10. הוסף 100 μL של מדיום זריעה לבאר לצלחת V-תחתון 96-well.
   11. שמור את הצלחת באינקובטור תרבית רקמות לחות ב 37 °C (5% _CO2.
3. דור נוירוספירה
   1. ביום הראשון, שימו לב כי נוצרים אגרגטים של תאים עגולים (נוירוספירות) עם גבולות חלקים מוגדרים. שים לב לתאים המתים סביב האגרגטים. המשך לתרבות באינקובטור ב 37 °C (5°F) ו 5% _CO2.
   2. ביום 3, להסעיר את הצלחת על ידי הקשה על הצדדים שלוש פעמים כדי לנתק תאים מתים.
   3. הוסף 100 μL של CDMI בתוספת 20 מעכב רוק μM, 3 μM IWR1, ו 5 μM SB431542 לכל באר.
   4. מחזירים את הצלחת לאינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% _CO2.
   5. ביום 6, בזהירות להסיר 80 μL של מדיום על טבעי מכל באר. הימנעו מלגעת בתחתית הבאר.
   6. הוסף 100 μL של CDMI בתוספת 3 μM IWR1 ו 5 μM SB431542 לכל באר. מחזירים את הצלחת לאינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% _CO2.
   7. חזור על שלבים 5 ו- 6 כל 3 ימים עד יום 18.
4. העברת נוירוספרות
   1. ביום 18, הכן את בידול קליפת המוח בינוני II (CDMII) (טבלה 1) והוסף 10 מ"ל ללוח תרבית תאים אולטרה-נמוך בגודל 100 מ"מ.
   2. השתמש פיפטה 200 μL עם קצה מנותק כדי להעביר את הנוירוספרות העגולות מן צלחת 96-well ללוח תרבית תא מצורף 100 מ"מ אולטרה נמוך.
      הערה: להיות עדין כדי למנוע פגיעה בנוירוספירות על ידי מוודא את פתיחת הקצה רחב מספיק וכי האגרגטים אינם שואפים מהר מדי.
   3. הסר 5 מ"ל של בינוני מהצלחת המכילה את הנוירוספירות ולהוסיף 5 מ"ל של CDMII טרי.
      הערה: הליך זה מסייע להפחית את כמות מדיום CDMI שייתכן שנשאה מהעברת נוירוספירות.
   4. מניחים את הלוח על שייקר מסלולית ב-70 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית רקמות לח ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% _CO2.
      הערה: בדוק חזותית את הנוירוספירות למחרת. להגביר את המהירות של שייקר מסלולית אם הנוירוספירות מגושמות זו לזו או מחוברות לתחתית הלוח.
   5. כל 3 ימים, שאפו בזהירות את המדיום העל-טבעי והחליפו אותו ב-CDMII טרי. השאירו כמות קטנה של המדיום כדי למנוע מהנוירוספירות להתייבש.
   6. ביום 35, הכן בידול קליפת המוח בינוני III (CDMIII) (טבלה 1).
      הערה: יש להמיס את רכיב המטריצה ב- CDMIII קר.
   7. שאפו את המדיום מהצלחת והוסיפו 10 מ"ל של CDMIII קר.
      הערה: זה יעיל יותר להשתמש במדיום קר, כך רכיב המטריצה יכול לצפות את organoids מבלי ליצור גושים.
   8. לאחר שינוי המדיום, מניחים את הצלחת בחזרה על שייקר מסלולית ב 70 סל"ד בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח ב 37 °C (5%) ו 5% _CO2.
   9. לשנות את המדיום כל 3-5 ימים בהתאם לקצב הצמיחה, כפי שצוין על ידי צבע המדיום.
   10. ביום 70, הכן את ההבחנה הקליפתית בינונית IV (CDMIV) (טבלה 1). השתמש במדיום CDMIV עד להגעה לגיל הרצוי של organoids. במהלך תקופה זו, לשמור את הצלחת על שייקר מסלולית להגדיר ב 70 סל"ד בתוך אינקובטור תרבות רקמות לח (37 °C (37 °C (5% _CO2).
   11. לשנות את המדיום כל 3-5 ימים, בהתאם לקצב הצמיחה.

2. חיסונים של אורגנוידים במוח

1. הכנת רקמות
   1. הכן פתרון paraformaldehyde 4%, והנח אותו מתחת למכסה המנוע בטיחות.
      הערה: ללבוש ציוד בטיחות אישי בעת טיפול PFA.
   2. לאסוף organoids המוח ולהעביר אותם בעדינות עם פיפטה פסטר פלסטיק 3 מ"ל קהה לצלחת 6-באר מלא PFA.
      הערה: השתמש organoids מעל 40 ימים כדי לאפשר הדמיה של מבנים עם מורכבות תאית גבוהה יותר.
   3. שמור את האורגנוידים בתמיסת PFA למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.
   4. הסר בזהירות את PFA עם פיפטה פסטר פלסטיק 3 מ"ל, ולשטוף את organoids קבוע שלוש פעמים באמצעות PBS.
   5. יש לאחסן את האורגנוידים הקבועים ב-4 °C ב- PBS עד לשימוש נוסף.
2. הכנת פרוסות אורגנויד במוח
   1. מכינים תמיסה של 3% אגר ומחממים לאט עד להנזלה.
   2. מניחים את התבנית (הקצה החתוך של מזרק 10 מ"ל) על פיסת נייר סינון סופג (צד חלק למעלה). מניחים עליו טיפת אגר.
   3. מוציאים במהירות אורגנואיד אחד מהצלחת בעלת 6 הבאר עם מרית ומסירים PBS מוגזמים עם נייר סינון.
      הערה: היזהר לא לגעת organoid ישירות עם נייר מסנן.
   4. מניחים את האורגנויד על טיפת אגר.
   5. חזור על הליך זה עם עד שלושה organoids.
      הערה: עבוד מהר כדי למנוע התגבשות של אגר במהלך שלב זה.
   6. ממלאים את התבנית באגר עד שכל האורגנוידים מכוסים במלואם.
   7. המתינו עד שהאגר יתחיל להתמצק, ולאחר מכן מעבירים בעדינות את כל התבנית המכילה את האורגנוידים, כולל נייר המסנן הסופג, לאלמנט קירור.
      הערה: אם אלמנט קירור אינו זמין, לאחסן את organoids במשך כמה דקות במקרר ב 4 °C (70 °F).
   8. בינתיים, היכונו להליך החתך: הניחו סכין גילוח (ניקה עם אצטון ונשטפו במים מזוקקים כפולים) לתוך מחזיק הוויברטום, הר על האמבטיה, ולמלא אותו עם PBS.
   9. מוציאים את התבנית מהאגר (המוצק) ומשתמשים באזמל כדי לקצץ אותו ליצירת קובייה.
   10. חברו את קוביית אגר המכילה את האורגנוידים על צלחת המוביל של הוויברטום עם ג'ל דבק (ראו טבלת החומרים), ומניחים אותה באמבטיה המכילה PBS.
   11. כוונן את הוויברטום (ראה טבלת החומרים) כדי לחתוך פרוסות בעובי של 150 מיקרומטר.
       הערה: הגדרות ויברטום (זווית נכונה, משרעת, תדירות ומהירות הלהב) עשויות להיות דומות לאלה המשמשות לחתוך רקמת מוח קבועה המופקת מבעלי חיים מוקדמים לאחר ההולכה. עם זאת, ההגדרות האידיאליות תלויות מאוד בסוג הוויברטום ויש לקבוע בצעד הראשון כדי למנוע עיוות או אפילו קריעת הרקמה בעת חיתוך.
   12. התחל את הליך החיתוך. השתמשו בפיפטה מזכוכית או במרית כדי להעביר בעדינות כל פרוסה חתוכה טרייה לצלחת 24-well מלאה ב-PBS.
   13. לאחסן את הצלחת המכילה פרוסות ב 4 °C (עד כמה ימים) עד עיבוד נוסף.
   14. מעבירים את הפרוסות מהצלחת עם פיפטה מזכוכית או מרית על מגלשות מיקרוסקופ. השתמש במינימום של 2 פרוסות לשקופית.
   15. הסר בזהירות את אגר ועודף PBS עם מזרק.
   16. אפשר לפרוסות להתייבש עד שהן נצמדות לשקופיות.
       הערה: בעוד שקופיות מיקרוסקופ ניתן לאחסן בתאי פלסטיק מלא PBS ב 4 °C (4 °F), הם צריכים להיות מוכתמים בהקדם האפשרי לאחר הליך חיתוך.
3. כתמים אימונוהיסטוכימיים
   1. הכן את פתרון החסימה (טבלה 1).
   2. השתמש בעט PAP כדי לצייר גבול הידרופובי סביב הפרוסות בשקופית כדי לעזור לשמור את כל הפתרונות בשקופיות.
   3. בזהירות להוסיף את פתרון חסימה על השקופית, ודגור במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר (22-25 °C (25 °F). כדי למנוע השמדת הרקמה, לא להוסיף את הפתרון ישירות על גבי הפרוסות.
   4. שאפו את פתרון החסימה והחלו את הנוגדן הראשי הרצוי מדולל בתמיסת החסימה.
   5. לדגור את השקופית לילה בחדר לח ב 4 °C (5 °F).
   6. יש לשטוף את השקופית שלוש פעמים עם PBS 1x למשך 10 דקות כל אחת.
   7. לדגור את הפרוסות עם הנוגדן המשני הספציפי מדולל בתמיסת החסימה ולבצע הכתמת Hoechst (1:2,500) עבור 1 שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
      הערה: זכור לבצע פקדים שליליים כדי לאשר שאין איגוד לא ספציפי או פלואורסצנטיות אוטומטית.
   8. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS 1x למשך 10 דקות כל אחת בחושך.
   9. מוסיפים טיפה אחת של מדיום הרכבה לפרוסה, מניחים כיסוי על קצה הטיפה, ומניחים לאט את הכיסוי כלפי מטה לכיוון הפרוסה כדי למנוע בועות אוויר.
   10. אפשר למגלשה לנוח לילה בטמפרטורת החדר. החל לק על גבול כיסוי כדי לאטום עוד יותר את השקופית. לאחסון לטווח ארוך, יש לאחסן ב- 4 °C (70 °F).
4. תיעוד של כתמים
   1. כדי לסרוק תמונות גדולות לתפירה, השתמש במיקרוסקופ רחב-שדה ממונע המצויד (עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים) במטרה באיכות גבוהה; ערכת מסנני DAPI (למשל, עירור (EX): 340-380 ננומטר, מראה דיכרואית (DM): 400 ננומטר, מסנן מחסום (BA): 435-485 ננומטר); ערכת מסננים פלואורסצין איזוטיוצינט (למשל, EX: 465-495 ננומטר, DM: 505 ננומטר, BA: 515-555 ננומטר); ערכת מסננים Alexa594 (למשל, ET 575/40; T 600 LPXR; ח"כ 623/24); מצלמה דיגיטלית; תוכנת רכישה בעלת ביצועים גבוהים המאפשרת תפרים אוטומטיים ופעולות מחסנית.
   2. לטיפול בתמונה, השתמש בתוכנית עיבוד תמונה המסוגלת ליצור קבצי tif של 8 סיביות, לחתוך תפרים, להתאים ניגודיות ובהירות, למזג את הערוצים (לדוגמה, כחול, ירוק ואדום) והוספת סרגלי קנה מידה.
   3. כדי לסרוק פרטים, השתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי ממונע המצויד במטרה באיכות גבוהה, לייזר UV (EX: 408 ננומטר), לייזר ארגון (EX: 488 ננומטר), לייזר הליום-ניאון (EX: 543), תוכנת הדמיה למיקרוסקופ קונפוקלי.
   4. לטיפול בתמונה בפרטים, השתמש בתוכנית עיבוד תמונה המסוגלת ליצור תחזיות בעוצמה המרבית של ערימות z קונפוקליות (לדוגמה, מקטעים אופטיים של 0.6 מיקרומטר כל אחד), יצירת קבצי tif של 8 סיביות, התאמת ניגודיות ובהירות, מיזוג הערוצים (לדוגמה, כחול, ירוק ואדום), הוספת סרגלי קנה מידה.
   5. השתמש בעורך גרפי כדי לסדר את האיור.

3. פרופיל ביו-אנרגטי של אורגנוידים במוח

1. הכנת אורגנוידים לפרופיל ביו-אנרגטי
   1. הכן את פתרון הפפאין וה- DNase בהתאם לפרוטוקול היצרן.
   2. מעבירים 3-5 אורגנוידים לצלחת 6-באר. לשטוף אותם פעמיים עם PBS קדם-קדם.
   3. הוסף 2 מ"ל של פתרון פפאין פעיל מחמם מראש המכיל DNase. בעזרת להב, חותכים את האורגנוידים לחתיכות קטנות.
   4. מניחים את הלוח על שייקר מסלולית שנקבע ב-27 סל"ד בתוך אינקובטור תרבית תאים (ב-37 °C (ב-37 °C(5%_CO2), ודגרה למשך 15-20 דקות.
      הערה: זמן הדגירה תלוי בשלב האורגנויד. אורגנוידים בשלב מוקדם יכולים לשמש כפי שהם. עבור organoids מעל 3 חודשים, מומלץ לחתוך את organoids לתוך 2-3 חתיכות לפני ניתוק ודגרה את החלקים במהירות נדנדה להגדיר על 27 סל"ד במשך 15-20 דקות ב 37 °C (75 °F). הליך זה יכול לעזור להסיר רקמה נמקית שעשויה להיות נוכחת באורגנוידים בשלב מאוחר יותר.
   5. לאסוף את הרקמות מעוכל לתוך צינור 15 מ"ל ולהוסיף 5 מ"ל של CDMIV בינוני תרבות organoid (טבלה 1).
   6. טריטוריאט את הרקמה עם פיפטה מפלסטיק 10 מ"ל על ידי צנרת למעלה ולמטה 10-15 פעמים. תן לרקמה הלא מזוהה להתיישב לתחתית הצינור.
   7. בזהירות להעביר את השעיית התא לצינור 15 מ"ל, הימנעות כל חתיכות של רקמה לא מזוהה. לסנן את הפתרון באמצעות מסננת תא 40 מיקרומטר (למשל, צינורות עגולים פוליסטירן עם כובעי מסננת התא).
   8. גלולה את התאים על ידי centrifuging ב 300 x g במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
   9. להעריך את מספר התא ואת האיכות באמצעות כחול טריפן.
   10. צלחת את המספר הרצוי (~ 20,000 / טוב) של תאים על מצופה 96-היטב מיקרו-לוחות. שנה את הבינוני 6-8 שעות לאחר ציפוי למדיום עצבי (טבלה 1).
   11. לדגור על המיקרו-לוח מצופה 96-well באינקובטור _CO2 (37 °C(37 °C, 5% _CO2) למשך 4 ימים.
2. פרופיל ביו-אנרגטי
   1. ביום 3 לאחר שתשובו לתאים המנותקים, הוסיפו 200 מיקרו-אל של פתרון כיול לכל באר בחלק התחתון של המיקרו-לוח בן 96 הבארות, והנחו את מחסנית החיישן הירוק העליון על המיקרו-לוח hydrated.
      הערה: הנח את מחסנית החיישן על גבי המיקרו-לוח בכיוון הנכון, וודא שפתרון הכיול מכסה את כל החיישנים.
   2. לדגור על מיקרו-לוחית 96-באר hydrated באינקובטור שאינו _CO2 ב 37 °C (50 °F) לילה.
   3. הפעל את המנתח כדי לאפשר למכשיר להתייצב ב 37 °C (50 °F) לילה.
   4. ביום 4 לאחר ההשתלה, בדוק את התרבות האורגנויד מנותק על 96-well microplate מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח כי התאים מופיעים כמו monolayer confluent.
   5. הכן את אסאי מדיום (טבלה 1).
   6. הסר בינוני עצבי מכל בארות עם pipette מבלי לגעת בתחתית הבאר כדי למנוע נזק לתא. לחלופין, בזהירות הפוך את כל הצלחת ולאחר מכן לייבש אותו על נייר נקי. עבוד במהירות כדי למנוע מוות בתא.
   7. לשטוף את התאים פעמיים עם 200 μL 200 μL של אסאי מדיום. הוסף את מדיום אסאי לנפח סופי של 180 μL לבאר. לדגור על 96-היטב microplate בחממה שאינה _CO2 ב 37 °C (50 °F) עבור 1 שעה.
   8. הכן 10 פתרונות μM של מעכבי מיטוכונדריאליים במדיום אסאי. שים לב כי הריכוז הסופי לאחר הזרקה הוא 1 μM.
   9. טען את מחסנית החיישן המוצבת במיקרו-לוח hydrated עם פתרונות פי 10 של מעכבי המיטוכונדריה.
      1. הוסף 18 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 1 לתוך יציאה A.
      2. הוסף 19.8 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 2 לתוך יציאה B.
      3. הוסף 21.6 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 2 לתוך יציאה C.
      4. הוסף 23.4 μL של מעכב מיטוכונדריאלי 3 לתוך יציאה D.
   10. מניחים את המחסנית הטעון במיקרו-לוח hydrated בחממה שאינה _CO2 ב 37 °C (7 °F) עד תחילת ההסתה.
   11. הגדר פרוטוקול פועל בתוכנת המכשיר (טבלה 2).
   12. לחץ על התחל. קח את המחסנית הטעונה מהחממה שאינה _CO2 והנח אותה במנתח לכיול.
       הערה: ודאו שהצלחת מוכנסת לכיוון הנכון וללא המכסה.
   13. לאחר סיום שלב הכיול, הסר את לוח הכיול. קח את המיקרו-לוחית 96-well מהחממה שאינה _CO2 והכנס אותו למנתח. לחץ על CONTINUE כדי להתחיל את המדידות.
   14. כאשר הריצה מסתיימת, להסיר את 96-היטב תרבית התא microplate מן המנתח ולאסוף את המדיום מכל בארות מבלי להפריע לתאים.
       הערה: המדיום יכול להיות מאוחסן ב -20 °C (20 °F) ולהשתמש מאוחר יותר למדידת כמות הלקטאט ששוחררו על ידי התאים במדיום באמצעות ערכת בדיקות לקטט מתאימה.
   15. לשטוף את התאים עם 200 μL של 1x PBS בכל באר.
   16. לאחר הסרת PBS, להקפיא את הצלחת ב -20 °C (50 °F).
       הערה: ניתן להשתמש בלוח הקפוא כדי לכמת תאים, חלבונים או DNA בכל באר של המיקרו-פלט. כימות זה יהיה צורך לנרמל את שיעורי הביו-אנרגטית המתקבלים. בצע את הוראות היצרן לבדיקות כימות תאים, חלבונים או דנ"א.

תוצאות

הפרוטוקול המתואר כאן מאפשר את הדור החזק של organoids עגול (איור 1A). האורגנוידים שנוצרו מכילים נוירונים בוגרים שניתן לדמיין באמצעות סמני חלבון ספציפיים לאקסונים (SMI312) ודנדריטים (חלבון הקשור למיקרוטובול 2 (MAP2)) (איור 1B). אורגנוידים בוגרי?...

Discussion

מאמר זה מתאר את הדור הניתב לשחזור של אורגנוידים אנושיים המופקים מ- IPSC ואת השימוש בהם למידול מחלות מיטוכונדריאליות. הפרוטוקול המתואר כאן משתנה בהתבסס על עבודה שפורסמה ^בעבר20. אחד היתרונות העיקריים של הפרוטוקול הנוכחי הוא שהוא אינו דורש הטמעה ידנית של כל אורגנויד במטריצה פיגומ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
Affinity Designer	Serif (Europe) Ltd		Layout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig	Sigma Aldrich	SAB4600033-250UL	1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-31571	1:300
Antimycin A	Sigma Aldrich	1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)	Sigma Aldrich	T8578	1:2000
Argon Laser	Melles Griot		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acid	Sigma	A92902
B-27 with Vitamin A	Gibco	17504044
Bacto Agar	Becton Dickinson		3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNF	Miltenyi Biotec	130-093-0811
cAMP	Sigma	D0627
Cell Star cell culture 6 well plate	Greiner-Bio-One	657160
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031
Confocal laser scanning microscope C1	Nikon Microscope Solutions		Modular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231	Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher	C7026
DMEM/F12	ThermoFisher	31330038
DMSO	Sigma	D2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3	Merck Millipore	AP180C	1:300
Donkey anti-mouse Cy3	Merck Millipore	AP192C	1:300
Donkey anti-rabbit Cy3	Merck Millipore	AP182C	1:300
DPBS	Gibco	14190250
DS-Q1Mc camera	Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91	Nikon Microscope Solutions		Imaging software for confocal microscope
FCCP	Sigma Aldrich	370-86-5
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-291
Glasgow MEM	Gibco	11710-035
Glass Pasteur pipette	Brand	747715	Inverted
Glutamax	Gibco	35050-061
Helium-Neon Laser	Melles Griot		Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
Heparin	Merck	H3149-25KU
HERACell 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	1:2500
Image J 1.53c	Wayne Rasband National Institute of Health		Image processing Software
Injekt Solo 10 mL/ Luer	Braun	4606108V
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828010
Laser (407 nm)	Coherent		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2	Synaptic Systems	No. 188004	1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAA	Gibco	11140-050
mTeSR Plus	Stemcell Technology	85850	iPSC medium
Multifuge X3R Centrifuge	Thermo Scientific	10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	# LT07-218
N2 Supplement	Gibco	17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW)	Neoject	10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2	Nikon		Imaging software
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
PAP Pen	Sigma	Z377821-1EA	To draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kit	Worthington	LK003150
Paraformaldehyde	Merck	818715	4% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mL	VWR	612-1681	Graduated up to 3 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0	Nikon Microscope Solutions		Dry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13	Nikon Microscope Solutions		Oil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm)	Greiner Bio-One	664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)	Falcon	352235
Potassium chloride	Roth	6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant	Invitrogen	P36980
Qualitative filter paper	VWR	516-0813
Rock Inhibitior	Merck	SCM075
Rotenone	Sigma	83-794
S100β	Abcam	Ab11178	1:600
SB-431542	Cayman Chemical Company	13031
Scalpel blades	Heinz Herenz Hamburq	1110918
SMI312	Biolegend	837904	1:500
Sodium bicarbonate	Merck/Sigma	31437-1kg-M
Sodium chloride	Roth	3957
Sodium dihydrogen phosphate	Applichem	131965
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
SOX2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-17320	1:100
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco/StemPro	A1110501	Reagent A
Super Glue Gel	UHU	63261	adhesive gel
SuperFrost Plus	VWR	631-0108
Syringe for single usage (1 mL)	BD Plastipak	300015
TB2 Thermoblock	Biometra
TC Plate 24 Well	Sarstedt	83.3922
TC Plate 6 Well	Sarstedt	83.392
TGFbeta3	Miltenyi Biotec	130-094-007
Tissue Culture Hood	ThermoFisher	51032711
TOM20	Santa Cruz Biotechnology	SC-11415	1:200
Triton-X	Merck	X100-5ML
UltraPure 0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
Vibratome Microm HM 650 V	Thermo Scientific		Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade	Wilkinson Sword	70517470
Whatman Benchkote	Merck/Sigma	28418852
Wnt Antagonist I	EMD Millipore Corp	3378738
XF 96 extracellular flux analyser	Seahorse Bioscience	100737-101
XF Assay DMEM Medium	Seahorse Bioscience	103680-100
XF Calibrant Solution	Seahorse Bioscience	100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate)	Seahorse Bioscience	102416-100