Generierung menschlicher Gehirnorganoide für die mitochondriale Krankheitsmodellierung

Zusammenfassung

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Erzeugung von humaninduzierten pluripotenten Stammzell-abgeleiteten Hirnorganoiden und deren Verwendung bei der Modellierung mitochondrialer Erkrankungen.

Zusammenfassung

Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen dar und sind derzeit unheilbar. Diese Erkrankungen verursachen neurologische Entwicklungsdefekte, deren zugrunde liegende Mechanismen noch aufgeklärt werden müssen. Ein Haupthindernis ist der Mangel an effektiven Modellen, die die früh einsetzende neuronale Beeinträchtigung der Patienten rekapitulieren. Fortschritte in der Technologie der induzierten pluripotenten Stammzellen (iPS-Zellen) ermöglichen die Erzeugung von dreidimensionalen (3D) Hirnorganoiden, mit denen die Auswirkungen von Krankheiten auf die Entwicklung und Organisation des Nervensystems untersucht werden können. Forscher, einschließlich dieser Autoren, haben kürzlich menschliche Gehirnorganoide eingeführt, um mitochondriale Störungen zu modellieren. Dieser Artikel berichtet über ein detailliertes Protokoll für die robuste Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung in mitochondrialen bioenergetischen Profiling- und Bildgebungsanalysen. Diese Experimente werden die Verwendung von Gehirnorganoiden zur Untersuchung von Stoffwechsel- und Entwicklungsstörungen ermöglichen und können entscheidende Informationen liefern, um die neuronale Pathologie mitochondrialer Erkrankungen zu sezieren.

Einleitung

Mitochondriale Erkrankungen stellen die größte Klasse angeborener Stoffwechselstörungen ^dar1. Sie werden durch genetische Mutationen verursacht, die verschiedene mitochondriale Prozesse stören, einschließlich oxidativer Phosphorylierung (OXPHOS)², Assemblierung der Atmungskette, mitochondrialer Dynamik und mitochondrialer DNA-Transkription oder -Replikation3. Gewebe mit Energiebedarf sind besonders von mitochondrialer Dysfunktion ^betroffen4. Dementsprechend entwickeln Patienten mit mitochondrialen Erkrankungen typischerweise früh einsetzende neurologische Manifestationen.

Derzeit gibt es keine Behandlungen für Kinder, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen ^sind5. Ein Haupthindernis für die Entwicklung von Medikamenten mitochondrialen Erkrankungen ist das Fehlen wirksamer Modelle, die den menschlichen Krankheitsverlauf rekapitulieren6. Einige der derzeit untersuchten Tiermodelle weisen die bei den Patienten vorhandenen neurologischen Defekte nicht ^auf7. Daher sind die Mechanismen, die der neuronalen Pathologie mitochondrialer Erkrankungen zugrunde liegen, noch nicht vollständig verstanden.

Neuere Studien erzeugten iPS-Zellen von Patienten, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen waren, und verwendeten diese Zellen, um patientenspezifische neuronale Zellen zu erhalten. Zum Beispiel wurde festgestellt, dass genetische Defekte, die mit der mitochondrialen Erkrankung, dem Leigh-Syndrom, assoziiert sind, Aberrationen in der zellulären Bioenergetik8,9, der ^{Proteinsynthese10} und der Calciumhomöostase9,11 verursachen. Diese Berichte lieferten wichtige mechanistische Hinweise auf die neuronale Beeinträchtigung bei mitochondrialen Erkrankungen und ebneten den Weg für die Wirkstoffforschung für diese unheilbaren ^{Krankheiten12}.

Zweidimensionale (2D)Kulturen erlauben jedoch keine Untersuchung der architektonischen Komplexität und regionalen Organisation von 3D-Organen13. Zu diesem Zweck kann die Verwendung von 3D-Hirnorganoiden, die aus patientenspezifischen ^iPS-Zellen14 abgeleitet sind, es den Forschern ermöglichen, zusätzliche wichtige Informationen zu gewinnen und so zu analysieren, wie mitochondriale Erkrankungen die Entwicklung und Funktion des Nervensystems ^{beeinflussen15}. Studien, die iPSC-abgeleitete Gehirnorganoide zur Untersuchung mitochondrialer Erkrankungen einsetzen, beginnen, die neurologischen Entwicklungskomponenten mitochondrialer Erkrankungen aufzudecken.

Rückenmarksorganoide, die Mutationen im Zusammenhang mit der mitochondrialen Erkrankung, der mitochondrialen Enzephalopathie, der Laktatazidose und dem Schlaganfall-ähnlichen Episodensyndrom (MELAS) tragen, zeigten eine fehlerhafte Neurogenese und eine verzögerte Motoneurondifferenzierung16. Kortikale Organoide, die von Patienten mit der mitochondrialen Erkrankung, dem Leigh-Syndrom, stammen, zeigten eine reduzierte Größe, Defekte in der neuronalen Epithelknospenbildung und einen Verlust der kortikalen ^{Architektur17}. Gehirnorganoide von Patienten mit Leigh-Syndrom zeigten, dass die Krankheitsdefekte auf der Ebene neuronaler Vorläuferzellen beginnen, die sich nicht an den mitochondrialen Stoffwechsel binden können, was zu einer aberranten neuronalen Verzweigung und Morphogenese ^führt18. So können neuronale Vorläufer ein zelluläres therapeutisches Ziel für mitochondriale Erkrankungen darstellen, und Strategien, die ihre mitochondriale Funktion fördern, können die funktionelle Entwicklung des Nervensystems unterstützen.

Die Verwendung von Gehirnorganoiden könnte helfen, die neurologischen Entwicklungskomponenten von mitochondrialen Erkrankungen aufzudecken. Mitochondriale Erkrankungen werden hauptsächlich als früh einsetzende Neurodegeneration ^angesehen5. Neuroentwicklungsstörungen treten jedoch auch bei Patienten auf, die von mitochondrialen Erkrankungen betroffen sind, einschließlich Entwicklungsverzögerung und kognitiver ^{Beeinträchtigung19}. Patientenspezifische Gehirnorganoide können helfen, diese Aspekte anzugehen und aufzuklären, wie mitochondriale Erkrankungen die Entwicklung des menschlichen Gehirns beeinflussen können. Mitochondriale Dysfunktion könnte auch eine pathogenetische Rolle bei anderen häufigeren neurologischen Erkrankungen wie der Alzheimer-Krankheit, der Parkinson-Krankheit und der ^{Huntington-Krankheit4} spielen. Daher könnte die Aufklärung der Auswirkungen von mitochondrialen Defekten auf die Neuroentwicklung unter Verwendung von Gehirnorganoiden auch für die Untersuchung dieser Krankheiten von entscheidender Bedeutung sein. Dieses Papier beschreibt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung reproduzierbarer Gehirnorganoide, die für die Durchführung der Krankheitsmodellierung von mitochondrialen Erkrankungen verwendet werden können.

Protokoll

HINWEIS: Die Verwendung menschlicher iPS-Zellen kann eine ethische Genehmigung erfordern. Die in dieser Studie verwendeten iPS-Zellen wurden von gesunden Kontrollpersonen nach lokaler ethischer Zulassung abgeleitet (#2019-681). Alle Zellkulturverfahren müssen unter einer sterilen Zellkulturhaube durchgeführt werden, wobei alle Reagenzien und Verbrauchsmaterialien sorgfältig desinfiziert werden müssen, bevor sie unter die Haube überführt werden. Menschliche iPS-Zellen, die zur Differenzierung verwendet werden, sollten eine Passagenzahl unter 50 haben, um mögliche genomische Aberrationen zu vermeiden, die bei extensiver Kultur auftreten können. Der pluripotente Zustand der Zellen sollte vor der Organoidbildung validiert werden, beispielsweise durch Überwachung der Expression von Pluripotenz-assoziierten Markern wie NANOG oder OCT4. Mykoplasmentests sollten wöchentlich durchgeführt werden, um mykoplasmenfreie Kulturen zu gewährleisten.

1. Erzeugung von Hirnorganoiden

1. Kultur menschlicher iPS-Zellen
   1. Humane iPS-Zellen unter feederfreien Bedingungen in iPSC-Medium (siehe Materialtabelle) auf beschichteten 6-Well-Platten zu kultivieren und in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5% _CO2 aufzubewahren.
      HINWEIS: Die Verschleppung von Feederzellen kann die Organoiddifferenzierung behindern. Passieren Sie die Zellen mindestens einmal unter feederfreien Bedingungen.
   2. Passage der iPS-Zellen bei 80% Konfluenz unter Verwendung von enzymfreiem Ablösungsmedium in Verhältnissen von 1:4 bis 1:12. Um das Überleben der Zellen zu erhöhen, fügen Sie nach jeder Spaltung 10 μM Rho-assoziierte Proteinkinase (ROCK) -Inhibitor (Y27632) hinzu.
2. Dissoziieren Sie die iPS-Zellen (80% Konfluenz) - Tag 0.
   1. Vorbereitung des kortikalen Differenzierungsmediums I (CDMI) (Tabelle 1). CDMI-Medium bei Raumtemperatur (22-25 °C) vorwärmen, bevor es den Zellen zugesetzt wird.
   2. Waschen Sie die Vertiefungen, die die iPS-Zellen enthalten, mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um abgestorbene Zellen und Ablagerungen zu entfernen.
   3. Zu jeder Vertiefung werden 500 μL vorgewärmtes Reagenz A (Materialtabelle) gegeben und 5 min bei 37 °C inkubiert. Überprüfen Sie unter dem Mikroskop, um die Zellablösung sicherzustellen.
   4. Fügen Sie 1 ml iPSC-Medium hinzu, um Reagenz A zu verdünnen, um seine Aktivität zu neutralisieren.
   5. Verwenden Sie eine 1000 μL Pipette, um die Zellen durch Pipettieren auf und ab zu dissoziieren und die Zellsuspension in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen zu übertragen.
   6. Die iPS-Zellen bei 125 x g für 5 min bei Raumtemperatur (22-25 °C) vorsichtig zentrifugieren.
   7. Aspirieren Sie den Überstand vorsichtig, um das Zellpellet nicht zu stören.
   8. Resuspendieren Sie das Pellet mit 1 ml CDMI, um eine Einzelzellsuspension zu erhalten, und zählen Sie die Zellzahl.
   9. Bereiten Sie das Seeding-Medium mit 9.000 iPS-Zellen pro 100 μL in CDMI vor, ergänzt mit 20 μM ROCK-Inhibitor, 3 μM WNT-Catenin-Inhibitor (IWR1) und 5 μM SB431542.
   10. 100 μL Aussaatmedium pro Vertiefung in eine 96-Well-V-Bodenplatte geben.
   11. Bewahren Sie die Platte in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 °C und 5% _{CO2 auf}.
3. Neurosphären-Generierung
   1. Beobachten Sie an Tag 1, dass sich runde Zellaggregate (Neurosphären) mit definierten glatten Grenzen bilden. Beachten Sie die toten Zellen um die Aggregate. Kultur im Inkubator bei 37 °C und 5% _{CO2 fortsetzen}.
   2. An Tag 3 rühren Sie die Platte, indem Sie dreimal auf die Seiten klopfen, um abgestorbene Zellen zu lösen.
   3. Zu jeder Vertiefung werden 100 μL CDMI, ergänzt mit 20 μM ROCK-Inhibitor, 3 μM IWR1 und 5 μM SB431542, gegeben.
   4. Geben Sie die Platte bei 37 °C und 5% _CO2 in den Inkubator zurück.
   5. Entfernen Sie am Tag 6 vorsichtig 80 μL des überstehenden Mediums aus jeder Vertiefung. Vermeiden Sie es, den Boden des Brunnens zu berühren.
   6. Fügen Sie 100 μL CDMI, ergänzt mit 3 μM IWR1 und 5 μM SB431542, zu jeder Vertiefung hinzu. Geben Sie die Platte bei 37 °C und 5% _CO2 in den Inkubator zurück.
   7. Wiederholen Sie die Schritte 5 und 6 alle 3 Tage bis zum 18. Tag.
4. Transfer von Neurosphären
   1. Bereiten Sie am Tag 18 Cortical Differentiation Medium II (CDMII) vor (Tabelle 1) und geben Sie 10 ml in eine 100 mm Ultra-Low Attachment Cell Culture Plate.
   2. Verwenden Sie eine 200-μL-Pipette mit abgeschnittener Spitze, um die runden Neurosphären von der 96-Well-Platte auf die 100-mm-Zellkulturplatte mit extrem niedriger Befestigung zu übertragen.
      HINWEIS: Seien Sie vorsichtig, um die Neurosphären nicht zu beschädigen, indem Sie sicherstellen, dass die Öffnung der Spitze breit genug ist und dass die Aggregate nicht zu schnell abgesaugt werden.
   3. Entfernen Sie 5 ml Medium von der Platte, die die Neurosphären enthält, und fügen Sie 5 ml frisches CDMII hinzu.
      HINWEIS: Dieses Verfahren hilft, die Menge an CDMI-Medium zu reduzieren, die möglicherweise aus dem Transfer von Neurosphären übertragen wurde.
   4. Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler mit 70 U / min in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C und 5% _CO2.
      HINWEIS: Untersuchen Sie die Neurosphären am nächsten Tag visuell. Erhöhen Sie die Geschwindigkeit des Orbitalschüttlers, wenn die Neurosphären zusammengeklumpt oder am Boden der Platte befestigt sind.
   5. Alle 3 Tage das überstehende Medium vorsichtig absaugen und durch frisches CDMII ersetzen. Lassen Sie eine kleine Menge des Mediums, um zu verhindern, dass die Neurosphären austrocknen.
   6. Bereiten Sie am Tag 35 Kortikales Differenzierungsmittel III (CDMIII) vor (Tabelle 1).
      HINWEIS: Die Matrixkomponente sollte in kaltem CDMIII gelöst werden.
   7. Saugen Sie das Medium von der Platte ab und fügen Sie 10 ml kaltes CDMIII hinzu.
      HINWEIS: Es ist effektiver, kaltes Medium zu verwenden, damit die Matrixkomponente die Organoide beschichten kann, ohne Klumpen zu bilden.
   8. Nach dem Wechsel des Mediums legen Sie die Platte wieder auf einen Orbitalschüttler mit 70 U / min in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator bei 37 ° C und 5% _CO2.
   9. Wechseln Sie das Medium alle 3-5 Tage, abhängig von der Wachstumsrate, wie durch die Farbe des Mediums angezeigt.
   10. Bereiten Sie am Tag 70 das kortikale Differenzierungsmedium IV (CDMIV) vor (Tabelle 1). Verwenden Sie CDMIV-Medium, bis das gewünschte Alter der Organoide erreicht ist. Während dieser Zeit bewahren Sie die Platte auf einem Orbitalschüttler mit 70 U / min in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator (37 ° C und 5% _{CO2) auf}.
   11. Wechseln Sie das Medium alle 3-5 Tage, abhängig von der Wachstumsrate.

2. Immunfärbung von Hirnorganoiden

1. Gewebepräparation
   1. Bereiten Sie 4% ige Paraformaldehyd (PFA) -Lösung vor und legen Sie sie unter eine Sicherheitshaube.
      HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit PFA persönliche Sicherheitsausrüstung.
   2. Sammeln Sie Gehirnorganoide und übertragen Sie sie vorsichtig mit einer stumpfen 3 ml Kunststoff-Pasteur-Pipette auf eine mit PFA gefüllte 6-Well-Platte.
      HINWEIS: Verwenden Sie Organoide, die älter als 40 Tage sind, um die Visualisierung von Strukturen mit höherer zellulärer Komplexität zu ermöglichen.
   3. Bewahren Sie die Organoide in der PFA-Lösung für 1 h bei Raumtemperatur auf.
   4. Entfernen Sie die PFA vorsichtig mit einer 3 ml Kunststoff-Pasteurpipette und waschen Sie die festen Organoide dreimal mit PBS.
   5. Die festsitzenden Organoide bei 4 °C in PBS bis zur weiteren Verwendung lagern.
2. Vorbereitung von Organoidschnitten des Gehirns
   1. Bereiten Sie eine 3% ige Agarlösung vor und erhitzen Sie sie langsam, bis sie verflüssigt ist.
   2. Legen Sie die Form (das geschnittene Ende einer 10-ml-Spritze) auf ein Stück saugfähiges Filterpapier (glatte Seite nach oben). Legen Sie einen Tropfen Agar darauf.
   3. Nehmen Sie schnell ein einzelnes Organoid mit einem Spatel aus der 6-Well-Platte und entfernen Sie überschüssiges PBS mit Filterpapier.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, das Organoid nicht direkt mit Filterpapier zu berühren.
   4. Legen Sie das Organoid auf das Agartröpfchen.
   5. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit bis zu drei Organoiden.
      HINWEIS: Arbeiten Sie schnell, um eine Erstarrung des Agars während dieses Schritts zu vermeiden.
   6. Füllen Sie die Form mit Agar auf, bis alle Organoide vollständig bedeckt sind.
   7. Warten Sie, bis das Agar zu erstarren beginnt, und übertragen Sie dann vorsichtig die gesamte Form, die die Organoide enthält, einschließlich des absorbierenden Filterpapiers, auf ein Kühlelement.
      HINWEIS: Wenn ein Kühlelement nicht verfügbar ist, lagern Sie die Organoide einige Minuten im Kühlschrank bei 4 °C.
   8. Bereiten Sie sich in der Zwischenzeit auf den Schneidevorgang vor: Legen Sie eine Rasierklinge (mit Aceton gereinigt und mit doppelt destilliertem Wasser gewaschen) in den Halter des Vibratoms, montieren Sie es auf das Bad und füllen Sie es mit PBS.
   9. Entfernen Sie die Form von (erstarrtem) Agar und schneiden Sie sie mit einem Skalpell zu einem Würfel ab.
   10. Befestigen Sie den Agarwürfel mit den Organoiden auf der Trägerplatte des Vibratoms mit Klebegel (siehe Materialtabelle) und legen Sie ihn in das PBS-haltige Bad.
   11. Stellen Sie das Vibratom (siehe Materialtabelle) ein, um Scheiben mit einer Dicke von 150 μm zu schneiden.
       HINWEIS: Die Vibratomeinstellungen (richtiger Winkel, Amplitude, Frequenz und Geschwindigkeit der Klinge) können denen ähneln, die zum Schneiden von festem Hirngewebe aus frühen postnatalen Tieren verwendet werden. Die idealen Einstellungen hängen jedoch stark von der Art des Vibratoms ab und müssen in einem ersten Schritt bestimmt werden, um eine Verzerrung oder gar ein Reißen des Gewebes beim Schneiden zu verhindern.
   12. Starten Sie den Schneidvorgang. Verwenden Sie eine Glaspipette oder einen Spatel, um jede frisch geschnittene Scheibe vorsichtig in eine mit PBS gefüllte 24-Well-Platte zu geben.
   13. Lagern Sie den Teller mit den Scheiben bei 4 °C (bis zu einigen Tagen) bis zur Weiterverarbeitung.
   14. Die Scheiben mit einer Glaspipette oder einem Spatel aus der Platte auf Objektträger übertragen. Verwenden Sie mindestens 2 Scheiben pro Folie.
   15. Entfernen Sie vorsichtig das Agar und das überschüssige PBS mit einer Spritze.
   16. Lassen Sie die Scheiben trocknen, bis sie an den Objektträgern haften.
       HINWEIS: Während Objektträger in Kunststoffkammern gelagert werden können, die bei 4 °C mit PBS gefüllt sind, sollten sie so schnell wie möglich nach dem Schneidevorgang gefärbt werden.
3. Immunhistochemische Färbung
   1. Bereiten Sie die blockierende Lösung vor (Tabelle 1).
   2. Verwenden Sie einen PAP-Stift, um einen hydrophoben Rand um die Scheiben auf dem Objektträger zu zeichnen, um alle Lösungen auf den Objektträgern zu halten.
   3. Die Sperrlösung vorsichtig auf den Objektträger geben und 1 h bei Raumtemperatur (22-25 °C) inkubieren. Um eine Zerstörung des Gewebes zu vermeiden, fügen Sie die Lösung nicht direkt auf die Scheiben hinzu.
   4. Aspirieren Sie die Blocklösung und tragen Sie den gewünschten primären Antikörper in der Blockierungslösung verdünnt auf.
   5. Inkubieren Sie den Objektträger über Nacht in einer befeuchteten Kammer bei 4 °C.
   6. Spülen Sie den Objektträger dreimal mit 1x PBS für jeweils 10 min ab.
   7. Inkubieren Sie die Scheiben mit dem in der Blocklösung verdünnten spezifischen Sekundärantikörper und führen Sie eine Hoechst-Färbung (1:2.500) für 1 h bei Raumtemperatur im Dunkeln durch.
      HINWEIS: Denken Sie daran, Negativkontrollen durchzuführen, um sicherzustellen, dass keine unspezifische Bindung oder Autofluoreszenz vorliegt.
   8. Spülen Sie dreimal mit 1x PBS für jeweils 10 min im Dunkeln.
   9. Fügen Sie der Scheibe einen Tropfen Montagemedium hinzu, legen Sie einen Deckglas auf den Rand des Tropfens und legen Sie den Deckglas langsam in Richtung der Scheibe, um Luftblasen zu vermeiden.
   10. Lassen Sie die Rutsche über Nacht bei Raumtemperatur ruhen. Tragen Sie Nagellack auf den Rand des Deckglases auf, um den Objektträger weiter zu versiegeln. Für die Langzeitlagerung bei 4 °C lagern.
4. Dokumentation der Färbung
   1. Um große Bilder für das Stitching zu scannen, verwenden Sie ein motorisiertes aufrechtes Weitfeldmikroskop, das mit (siehe Materialtabelle für Details) einem hochwertigen Objektiv ausgestattet ist. DAPI-Filterset (z.B. Anregung (EX): 340-380 nm, dichroitischer Spiegel (DM): 400 nm, Sperrfilter (BA): 435-485 nm); Fluorescein-Isothiocyanat-Filterset (z. B. EX: 465-495 nm, DM: 505 nm, BA: 515-555 nm); Alexa594 Filterset (z.B. ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); Digitalkamera; Leistungsstarke Erfassungssoftware, die automatisierte Stiche und Stack-Operationen ermöglicht.
   2. Verwenden Sie für die Bildbearbeitung ein Bildverarbeitungsprogramm, das in der Lage ist, 8-Bit-Tif-Dateien zu generieren, Stiche zuzuschneiden, Kontrast und Helligkeit anzupassen, die Kanäle (z. B. Blau, Grün und Rot) zusammenzuführen und Maßstabsleisten hinzuzufügen.
   3. Um Details zu scannen, verwenden Sie ein motorisiertes konfokales Laser-Scanning-Mikroskop, das mit einem hochwertigen Objektiv, einem UV-Laser (EX: 408 nm), einem Argon-Laser (EX: 488 nm), einem Helium-Neon-Laser (EX: 543) und einer Bildgebungssoftware für ein konfokales Mikroskop ausgestattet ist.
   4. Verwenden Sie für die Bildbearbeitung von Details ein Bildverarbeitungsprogramm, das in der Lage ist, Projektionen mit maximaler Intensität von konfokalen Z-Stacks (z. B. optische Abschnitte von jeweils 0,6 μm) zu erzeugen, 8-Bit-Tif-Dateien zu generieren, Kontrast und Helligkeit anzupassen, die Kanäle (z. B. Blau, Grün und Rot) zusammenzuführen und Skalierungsbalken hinzuzufügen.
   5. Verwenden Sie einen grafischen Editor, um die Figuren anzuordnen.

3. Bioenergetische Profilierung von Hirnorganoiden

1. Präparation von Organoiden für das bioenergetische Profiling
   1. Bereiten Sie die Papain- und DNase-Lösung nach dem Protokoll des Herstellers vor.
   2. Übertragen Sie 3-5 Organoide in eine 6-Well-Platte. Waschen Sie sie zweimal mit vorgewärmtem PBS.
   3. Fügen Sie 2 ml vorgewärmte aktivierte Papainlösung hinzu, die DNase enthält. Schneiden Sie die Organoide mit einer Klinge in kleine Stücke.
   4. Legen Sie die Platte auf einen Orbitalschüttler mit 27 U / min in einem Zellkulturinkubator (bei 37 °C, 5% _CO2) und inkubieren Sie für 15-20 min.
      HINWEIS: Die Zeit der Inkubation hängt vom Organoidstadium ab. Organoide im Frühstadium können so verwendet werden, wie sie sind. Für Organoide, die älter als 3 Monate sind, wird empfohlen, die Organoide vor der Dissoziation in 2-3 Stücke zu schneiden und die Stücke mit einer Schaukelgeschwindigkeit bei 27 U / min für 15-20 min bei 37 ° C zu inkubieren. Dieses Verfahren kann helfen, nekrotisches Gewebe zu entfernen, das in den Organoiden im späten Stadium vorhanden sein kann.
   5. Sammeln Sie die verdauten Gewebe in einem 15-ml-Röhrchen und fügen Sie 5 ml Organoidkulturmedium CDMIV hinzu (Tabelle 1).
   6. Triturieren Sie das Gewebe mit einer 10 ml Kunststoffpipette, indem Sie 10-15 Mal auf und ab pipettieren. Lassen Sie das unzusammenhängende Gewebe sich auf dem Boden der Röhre absetzen.
   7. Übertragen Sie die Zellsuspension vorsichtig in einen 15-ml-Röhrchen, wobei Nichtsoziierte Gewebestücke vermieden werden. Filtern Sie die Lösung durch ein 40 μm Zellsieb (z. B. Polystyrol-Rundbodenröhrchen mit Zellsiebkappen).
   8. Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugieren bei 300 x g für 5 min bei Raumtemperatur.
   9. Beurteilen Sie die Zellzahl und -qualität mit trypan blue.
   10. Platten Sie die gewünschte Anzahl (~ 20.000 / Well) von Zellen auf beschichtete 96-Well-Mikroplatten. Wechseln Sie das Medium 6-8 h nach der Beschichtung zu Neuronales Medium (Tabelle 1).
   11. Inkubieren Sie die beschichtete 96-Well-Mikroplatte in einem CO2-Inkubator (37 °C, 5% _CO2) für 4 Tage.
2. Bioenergetische Profilerstellung
   1. Geben Sie an Tag 3 nach dem erneuten Plattieren der dissoziierten Zellen 200 μL Kalibrierlösung in jede Vertiefung des unteren Teils der 96-Well-Mikroplatte und legen Sie die obere grüne Sensorkartusche auf die hydratisierte Mikroplatte.
      HINWEIS: Legen Sie die Sensorkassette in der richtigen Ausrichtung auf die Mikroplatte und stellen Sie sicher, dass die Kalibrierlösung alle Sensoren abdeckt.
   2. Inkubieren Sie die hydratisierte 96-Well-Mikroplatte in einem Nicht-CO2-Inkubator bei 37 °C über Nacht.
   3. Schalten Sie den Analysator ein, damit sich das Gerät über Nacht bei 37 °C stabilisieren kann.
   4. Untersuchen Sie am Tag 4 nach der Neuplattierung die dissoziierte Organoidkultur auf der 96-Well-Mikroplatte unter dem Mikroskop, um sicherzustellen, dass die Zellen als konfluente Monoschicht erscheinen.
   5. Assay-Medium vorbereiten (Tabelle 1).
   6. Entfernen Sie neuronales Medium mit einer Pipette aus allen Vertiefungen, ohne den Boden des Brunnens zu berühren, um Zellschäden zu vermeiden. Alternativ können Sie die gesamte Platte vorsichtig umkehren und dann auf sauberem Papier trocknen. Arbeiten Sie schnell, um den Zelltod zu vermeiden.
   7. Waschen Sie die Zellen zweimal mit vorgewärmten 200 μL Assay Medium. Geben Sie Assay Medium zu einem Endvolumen von 180 μL pro Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die 96-Well-Mikroplatte in einem _Co2-freien Inkubator bei 37 °C für 1 h.
   8. 10 μM-Lösungen von mitochondrialen Inhibitoren in Assay-Medium herstellen. Beachten Sie, dass die Endkonzentration nach der Injektion 1 μM beträgt.
   9. Laden Sie die Sensorkartusche, die in die hydratisierte Mikroplatte gelegt wird, mit 10-fachen Lösungen der mitochondrialen Inhibitoren.
      1. Fügen Sie 18 μL des mitochondrialen Inhibitors 1 in Port A hinzu.
      2. 19,8 μL des mitochondrialen Inhibitors 2 in Port B geben.
      3. 21,6 μL des mitochondrialen Inhibitors 2 in Port C geben.
      4. Fügen Sie 23,4 μL des mitochondrialen Inhibitors 3 in Port D hinzu.
   10. Legen Sie die geladene Kartusche bis zum Beginn des Assays in die hydratisierte Mikrotiterplatte in einen _CO2-freien Inkubator bei 37 °C.
   11. Richten Sie ein laufendes Protokoll in der Software des Geräts ein (Tabelle 2).
   12. Drücken Sie START. Nehmen Sie die geladene Kartusche aus dem Nicht-CO2-Inkubator und legen Sie sie zur Kalibrierung in den Analysator.
       HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Platte in der richtigen Ausrichtung und ohne Deckel eingesetzt ist.
   13. Sobald der Kalibrierungsschritt beendet ist, entfernen Sie die Kalibrierplatte. Nehmen Sie die 96-Well-Mikrotiterplatte aus dem Nicht-CO2-Inkubator und legen Sie sie in den Analysator. Klicken Sie auf WEITER, um die Messungen zu starten.
   14. Wenn der Lauf beendet ist, entfernen Sie die 96-Well-Zellkultur-Mikroplatte aus dem Analysator und sammeln Sie das Medium aus allen Vertiefungen, ohne die Zellen zu stören.
       HINWEIS: Das Medium kann bei -20 °C gelagert und später zur Messung der von den Zellen im Medium freigesetzten Laktatmenge mit einem geeigneten Laktat-Assay-Kit verwendet werden.
   15. Waschen Sie die Zellen mit 200 μL 1x PBS in jeder Vertiefung.
   16. Nach dem Entfernen des PBS die Platte bei -20 °C einfrieren.
       HINWEIS: Die gefrorene Platte kann verwendet werden, um Zellen, Proteine oder DNA in jeder Vertiefung der Mikrotiterplatte zu quantifizieren. Diese Quantifizierung wird für die Normalisierung der erhaltenen bioenergetischen Raten benötigt. Befolgen Sie die Anweisungen des Herstellers für Zell-, Protein- oder DNA-Quantifizierungsassays.

Ergebnisse

Das hier beschriebene Protokoll erleichtert die robuste Erzeugung von runden Organoiden (Abbildung 1A).< Die erzeugten Organoide enthalten reife Neuronen, die mit Hilfe von axonspezifischen Proteinmarkern (SMI312) und Dendriten (Mikrotubuli-assoziiertes Protein 2 (MAP2)) sichtbar gemacht werden können (Abbildung 1B). Reife Organoide enthalten nicht nur neuronale Zellen (MAP2-positiv), sondern auch Gliazellen (z...

Diskussion

Dieser Artikel beschreibt die reproduzierbare Erzeugung von humanen iPSC-abgeleiteten Gehirnorganoiden und deren Verwendung für die mitochondriale Krankheitsmodellierung. Das hier beschriebene Protokoll wurde auf der Grundlage einer zuvor veröffentlichten Arbeit ^{modifiziert20}. Ein großer Vorteil des vorliegenden Protokolls besteht darin, dass es nicht die manuelle Einbettung jedes Organoids in eine Gerüstmatrix erfordert. Tatsächlich wird die Matrixlösung einfach in das Zellkulturmedium gel?...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
Affinity Designer	Serif (Europe) Ltd		Layout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig	Sigma Aldrich	SAB4600033-250UL	1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-31571	1:300
Antimycin A	Sigma Aldrich	1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)	Sigma Aldrich	T8578	1:2000
Argon Laser	Melles Griot		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acid	Sigma	A92902
B-27 with Vitamin A	Gibco	17504044
Bacto Agar	Becton Dickinson		3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNF	Miltenyi Biotec	130-093-0811
cAMP	Sigma	D0627
Cell Star cell culture 6 well plate	Greiner-Bio-One	657160
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031
Confocal laser scanning microscope C1	Nikon Microscope Solutions		Modular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231	Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher	C7026
DMEM/F12	ThermoFisher	31330038
DMSO	Sigma	D2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3	Merck Millipore	AP180C	1:300
Donkey anti-mouse Cy3	Merck Millipore	AP192C	1:300
Donkey anti-rabbit Cy3	Merck Millipore	AP182C	1:300
DPBS	Gibco	14190250
DS-Q1Mc camera	Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91	Nikon Microscope Solutions		Imaging software for confocal microscope
FCCP	Sigma Aldrich	370-86-5
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-291
Glasgow MEM	Gibco	11710-035
Glass Pasteur pipette	Brand	747715	Inverted
Glutamax	Gibco	35050-061
Helium-Neon Laser	Melles Griot		Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
Heparin	Merck	H3149-25KU
HERACell 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	1:2500
Image J 1.53c	Wayne Rasband National Institute of Health		Image processing Software
Injekt Solo 10 mL/ Luer	Braun	4606108V
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828010
Laser (407 nm)	Coherent		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2	Synaptic Systems	No. 188004	1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAA	Gibco	11140-050
mTeSR Plus	Stemcell Technology	85850	iPSC medium
Multifuge X3R Centrifuge	Thermo Scientific	10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	# LT07-218
N2 Supplement	Gibco	17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW)	Neoject	10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2	Nikon		Imaging software
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
PAP Pen	Sigma	Z377821-1EA	To draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kit	Worthington	LK003150
Paraformaldehyde	Merck	818715	4% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mL	VWR	612-1681	Graduated up to 3 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0	Nikon Microscope Solutions		Dry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13	Nikon Microscope Solutions		Oil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm)	Greiner Bio-One	664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)	Falcon	352235
Potassium chloride	Roth	6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant	Invitrogen	P36980
Qualitative filter paper	VWR	516-0813
Rock Inhibitior	Merck	SCM075
Rotenone	Sigma	83-794
S100β	Abcam	Ab11178	1:600
SB-431542	Cayman Chemical Company	13031
Scalpel blades	Heinz Herenz Hamburq	1110918
SMI312	Biolegend	837904	1:500
Sodium bicarbonate	Merck/Sigma	31437-1kg-M
Sodium chloride	Roth	3957
Sodium dihydrogen phosphate	Applichem	131965
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
SOX2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-17320	1:100
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco/StemPro	A1110501	Reagent A
Super Glue Gel	UHU	63261	adhesive gel
SuperFrost Plus	VWR	631-0108
Syringe for single usage (1 mL)	BD Plastipak	300015
TB2 Thermoblock	Biometra
TC Plate 24 Well	Sarstedt	83.3922
TC Plate 6 Well	Sarstedt	83.392
TGFbeta3	Miltenyi Biotec	130-094-007
Tissue Culture Hood	ThermoFisher	51032711
TOM20	Santa Cruz Biotechnology	SC-11415	1:200
Triton-X	Merck	X100-5ML
UltraPure 0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
Vibratome Microm HM 650 V	Thermo Scientific		Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade	Wilkinson Sword	70517470
Whatman Benchkote	Merck/Sigma	28418852
Wnt Antagonist I	EMD Millipore Corp	3378738
XF 96 extracellular flux analyser	Seahorse Bioscience	100737-101
XF Assay DMEM Medium	Seahorse Bioscience	103680-100
XF Calibrant Solution	Seahorse Bioscience	100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate)	Seahorse Bioscience	102416-100