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この記事について

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要約

ヒト誘導多能性幹細胞由来の脳オルガノイドの生成とミトコンドリア病のモデル化におけるその使用に関する詳細なプロトコルについて述べています。

要約

ミトコンドリア病は、代謝の生まれ変わりエラーの最大のクラスを表し、現在不治です。これらの疾患は、根本的なメカニズムが解明されたままの神経発達上の欠陥を引き起こす。主要な障害は、患者に見られる早期発症神経障害を再現する効果的なモデルの欠如である。誘導多能性幹細胞(iPSC)の技術の進歩により、神経系の発達と組織に対する疾患の影響を調べるための3次元(3D)脳オルガノイドの生成が可能になります。これらの著者を含む研究者は、最近、ミトコンドリア障害をモデル化するためにヒト脳オルガノイドを導入しました。本論文は、ヒトiPSC由来の脳オルガノイドの堅牢な生成と、ミトコンドリアの生体エネルギープロファイリングおよびイメージング分析におけるその使用に関する詳細なプロトコルを報告する。これらの実験は、脳オルガノイドを使用して代謝および発達の機能不全を調査することを可能にし、ミトコンドリア病の神経病理学を解剖するための重要な情報を提供するかもしれない。

概要

ミトコンドリア病は、代謝の内生誤差の最大のクラスを表します1.それらは、酸化リン酸化(OXPHOS)2、呼吸連鎖集合体、ミトコンドリアダイナミクス、ミトコンドリアDNA転写または複製を含む異なるミトコンドリアプロセスを破壊する遺伝子変異によって引き起こされる。エネルギー要件を有する組織は、特にミトコンドリア機能不全4の影響を受ける。したがって、ミトコンドリア病の患者は、典型的には早期発症の神経学的症状を発症する。

現在、ミトコンドリア病の影響を受ける小児に対する治療法はない5。ミトコンドリア病の薬剤開発の大きな障害は、ヒト疾患コース6を再現する有効なモデルの欠如である。現在研究されている動物モデルのいくつかは、患者7に存在する神経学的欠陥を示さない。したがって、ミトコンドリア病の神経病理学の根底にあるメカニズムはまだ完全には理解されていない。

最近の研究では、ミトコンドリア病の影響を受けた患者からiPSCを生成し、これらの細胞を使用して患者特異的神経細胞を得た。例えば、ミトコンドリア病に伴う....

プロトコル

注: 人間の iPSC を使用するには、倫理的な承認が必要な場合があります。本研究で用いたiPSCは、現地の倫理的承認(#2019-681)に従って健康なコントロール個人に由来した。すべての細胞培養手順は、ボンネットの下で移送する前に、慎重にすべての試薬および消耗品を消毒し、無菌細胞培養フードの下で行われなければなりません。分化に使用するヒトiPSCは、広範な培養で起こり得る潜在的なゲノム収差を避けるために、50未満の通過番号を持つべきである。細胞の多能性状態は、例えば、NANOGまたはOCT4のような多能性関連マーカーの発現を監視することによって、オルガノイド生成の前に検証されるべきである。マイコプラズマの検査は、マイコプラズマを含まない培養を確実にするために毎週実施する必要があります。

1. 脳オルガノイドの生成

  1. ヒトiPSCの文化
    1. コーティングされた6ウェルプレートのiPSC培地( 材料表参照)のフィーダーフリー条件下で培養したヒトiPSCを、37°Cおよび5%CO2の加湿組織培養インキュベーターに保管します。
      注:フィーダー細胞の持ち越しは、オルガノイド分化を妨げる可能性があります。フィーダーフリー条件で少なくとも一回細胞を通過させる。
    2. 1:4~1:12の酵素無剥離媒体を用いて80%の合流率でiPSCを通過させる。細胞生存率を高めるには、分割後に10....

結果

ここで説明するプロトコルは、丸型オルガノイドの堅牢な生成を容易にする(図1A)。生成されたオルガノイドには、軸索(SMI312)および樹状突起(微小管関連タンパク質2(MAP2))に特異的なタンパク質マーカーを使用して視覚化できる成熟したニューロンが含まれています(図1B)。成熟したオルガノイドは、神経細胞(MA.......

ディスカッション

本論文では、ヒトiPSC由来の脳オルガノイドの再現性のある生成と、ミトコンドリア病のモデル化に用いることを説明する。ここで説明するプロトコルは、以前に公開された work20 に基づいて変更されます。本プロトコルの大きな利点の1つは、各オルガノイドを足場マトリックスに手動で埋め込む必要がなされないことである。実際、マトリックス溶液は、細胞培養培地に単.......

開示事項

著者らは、競合する財政的利益や非財政的利益を宣言しない。

謝辞

ミリアム・ビュニングの技術サポートに感謝します。我々は、ドイツ・フォルシュングスゲミンシャフト(DFG)(PR1527/5-1からA.P.)、スパークとベルリン衛生研究所(BIH)(BIH検証資金からA.P.)、ユナイテッド・水戸からの支援を認める コンドリア病財団(UMDF)(リー症候群国際コンソーシアム補助金A.P.)、大学病院デュッセルドルフ(Forschungskommission UKDからA.P.)、ドイツ連邦教育研究省(BMBF)(e:バイオ若手研究者は、AZ 031L0211をA.P.に付与します。C.R.R.の研究室での作業は、DFG(FOR 2795 「ストレス下のシナプス」、Ro 2327/13-1)によってサポートされました。

....

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
2-mercaptoethanolGibco31350-010
Affinity DesignerSerif (Europe) LtdLayout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pigSigma AldrichSAB4600033-250UL1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouseThermo Fisher ScientificA-315711:300
Antimycin ASigma Aldrich1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)Sigma AldrichT85781:2000
Argon LaserMelles GriotAny other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acidSigmaA92902
B-27 with Vitamin AGibco17504044
Bacto AgarBecton Dickinson3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNFMiltenyi Biotec130-093-0811
cAMPSigmaD0627
Cell Star cell culture 6 well plateGreiner-Bio-One657160
Chemically Defined Lipid ConcentrateGibco11905031
Confocal laser scanning microscope C1Nikon Microscope SolutionsModular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-freeCorning356231Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay KitThermo FisherC7026
DMEM/F12ThermoFisher31330038
DMSOSigmaD2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3Merck MilliporeAP180C1:300
Donkey anti-mouse Cy3Merck MilliporeAP192C1:300
Donkey anti-rabbit Cy3Merck MilliporeAP182C1:300
DPBSGibco14190250
DS-Q1Mc cameraNikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscopeNikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscopeNikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted MicroscopeNikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91Nikon Microscope SolutionsImaging software for confocal microscope
FCCPSigma Aldrich370-86-5
Fetal Bovine SerumGibco10270-106
GDNFMiltenyi Biotec130-096-291
Glasgow MEMGibco11710-035
Glass Pasteur pipetteBrand747715Inverted
GlutamaxGibco35050-061
Helium-Neon LaserMelles GriotEvery other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
HeparinMerckH3149-25KU
HERACell 240i CO2 IncubatorThermo Scientific51026331
Hoechst 33342InvitrogenH35701:2500
Image J 1.53cWayne Rasband National Institute of HealthImage processing Software
Injekt Solo 10 mL/ LuerBraun4606108V
Knockout Serum ReplacementGibco10828010
Laser (407 nm)CoherentAny other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2Synaptic SystemsNo. 1880041:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAAGibco11140-050
mTeSR PlusStemcell Technology85850iPSC medium
Multifuge X3R CentrifugeThermo Scientific10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection KitLonza# LT07-218
N2 SupplementGibco17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW)Neoject10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2NikonImaging software
Oligomycin ASigma Aldrich75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010Heidolph543-12310-00
PAP PenSigmaZ377821-1EATo draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kitWorthingtonLK003150
ParaformaldehydeMerck8187154% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mLVWR612-1681Graduated up to 3 mL
Penicillin-StreptomycinGibco15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0Nikon Microscope SolutionsDry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13Nikon Microscope SolutionsOil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm)Greiner Bio-One664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)Falcon352235
Potassium chlorideRoth6781.1
ProLong Glass Antifade MoutantInvitrogenP36980
Qualitative filter paperVWR516-0813
Rock InhibitiorMerckSCM075
RotenoneSigma83-794
S100βAbcamAb111781:600
SB-431542Cayman Chemical Company13031
Scalpel bladesHeinz Herenz Hamburq1110918
SMI312Biolegend8379041:500
Sodium bicarbonateMerck/Sigma31437-1kg-M
Sodium chlorideRoth3957
Sodium dihydrogen phosphateApplichem131965
Sodium PyruvateGibco11360070
SOX2Santa Cruz BiotechnologySc-173201:100
StemPro Accutase Cell Dissociation ReagentGibco/StemProA1110501Reagent A
Super Glue GelUHU63261adhesive gel
SuperFrost PlusVWR631-0108
Syringe for single usage (1 mL)BD Plastipak300015
TB2 ThermoblockBiometra
TC Plate 24 WellSarstedt83.3922
TC Plate 6 WellSarstedt83.392
TGFbeta3Miltenyi Biotec130-094-007
Tissue Culture HoodThermoFisher51032711
TOM20Santa Cruz BiotechnologySC-114151:200
Triton-XMerckX100-5ML
UltraPure 0.5M EDTAInvitrogen15575020
Vibratome Microm HM 650 VThermo ScientificProduction terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor BladeWilkinson Sword70517470
Whatman BenchkoteMerck/Sigma28418852
Wnt Antagonist IEMD Millipore Corp3378738
XF 96 extracellular flux analyserSeahorse Bioscience100737-101
XF Assay DMEM MediumSeahorse Bioscience103680-100
XF Calibrant SolutionSeahorse Bioscience100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate)Seahorse Bioscience102416-100

参考文献

  1. Koopman, W. J., Willems, P. H., Smeitink, J. A. Monogenic mitochondrial disorders. New England Journal of Medicine. 366 (12), 1132-1141 (2012).
  2. Gorman, G. S., et al. Mitochondrial diseases. Nature Review Disease Primers. 2, 16080 (2016).
  3. Vaf....

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