用于线粒体疾病建模的人脑类器官的生成

摘要

我们描述了产生人类诱导多能干细胞衍生脑类器官及其在线粒体疾病建模的详细方案。

摘要

线粒体疾病是最大的一类先天性代谢缺陷，目前无法治愈。这些疾病导致神经发育缺陷，其潜在机制仍有待阐明。一个主要障碍是缺乏有效的模型来概括患者中早发性神经元损伤。诱导多能干细胞（iPSCs）技术的进步使三维（3D）脑类器官的产生成为可能，可用于研究疾病对神经系统发育和组织的影响。包括这些作者在内的研究人员最近引入了人脑类器官来模拟线粒体疾病。本文报告了人类iPSC衍生的脑类器官的强大生成及其在线粒体生物能量分析和成像分析中的应用的详细方案。这些实验将允许使用脑类器官来研究代谢和发育功能障碍，并可能为剖析线粒体疾病的神经元病理学提供关键信息。

引言

线粒体疾病是最大的一类先天性代谢缺陷¹。它们是由破坏不同线粒体过程的基因突变引起的，包括氧化磷酸化（OXPHOS）²，呼吸链组装，线粒体动力学和线粒体DNA转录或复制³。有能量需求的组织尤其受线粒体功能障碍^的影响4。因此，患有线粒体疾病的患者通常会出现早发性神经系统表现。

目前尚无针对线粒体疾病患儿的治疗方法⁵。线粒体疾病药物开发的一个主要障碍是缺乏概括人类疾病过程的有效模型⁶。目前研究的几种动物模型没有表现出患者中存在的神经缺陷⁷。因此，线粒体疾病神经元病理学的潜在机制仍未完全清楚。

最近的研究从受线粒体疾病影响的患者中产生了iPSCs，并使用这些细胞来获得患者特异性神经元细胞。例如，已发现与线粒体疾病Leigh综合征相关的遗传缺陷可导致细胞生物能量^学8，9，蛋白质合成¹⁰和钙稳态^9，11的畸变。这些报告为线粒体疾病中发生的神经元损伤提供了重要的机制线索，为这些不治之症的药物发现铺平了道路¹²。

然而，二维（2D）文化无法调查3D器官的建筑复杂性和区域组织¹³。为此，使用源自患者特异性^iPSCs14 的3D脑类器官可能使研究人员能够获得额外的重要信息，从而有助于剖析线粒体疾病如何影响神经系统的发育和功能¹⁵。使用iPSC衍生的脑类器官来研究线粒体疾病的研究开始揭示线粒体疾病的神经发育成分。

脊髓类器官携带与线粒体疾病、线粒体脑病、乳酸性酸中毒和卒中样发作综合征（MELAS）相关的突变，显示神经发生缺陷和运动神经元分化延迟¹⁶。来自线粒体疾病Leigh综合征患者的皮质类器官显示尺寸减小，神经上皮芽生成缺陷和皮质结构丧失¹⁷。来自Leigh综合征患者的脑类器官表明，疾病缺陷始于神经祖细胞的水平，其不能致力于线粒体代谢，导致异常神经元分支和形态发生¹⁸。因此，神经祖细胞可能代表线粒体疾病的细胞治疗靶点，促进其线粒体功能的策略可能支持神经系统的功能发育。

脑类器官的使用可能有助于揭示线粒体疾病的神经发育成分。线粒体疾病主要被认为是早发性神经变性⁵。然而，受线粒体疾病影响的患者也存在神经发育缺陷，包括发育迟缓和认知障碍¹⁹。患者特异性脑类器官可能有助于解决这些方面，并阐明线粒体疾病如何影响人脑发育。线粒体功能障碍也可能在其他更常见的神经系统疾病中起致病作用，例如阿尔茨海默病，帕金森病和亨廷顿病⁴。因此，使用脑类器官阐明线粒体缺陷对神经发育的影响也可能有助于研究这些疾病。本文描述了一种用于生成可重复脑类器官的详细方案，可用于进行线粒体疾病的疾病建模。

研究方案

注意:使用人类 iPSC 可能需要获得伦理批准。本研究中使用的iPSCs来自当地伦理批准后的健康对照个体（#2019-681）。所有细胞培养程序必须在无菌细胞培养罩下进行，在转移到罩下之前仔细消毒所有试剂和耗材。用于分化的人类iPSC的传代数应低于50，以避免在广泛培养时可能发生的潜在基因组畸变。细胞的多能状态应在类器官生成之前进行验证，例如，通过监测多能性相关标志物（如NANOG或OCT4）的表达。应每周进行支原体检测，以确保无支原体培养。

1. 脑类器官的产生

1. 人类 iPSC 的培养
   1. 在无饲养层条件下，在iPSC培养基（见 材料表）中，在包衣的6孔板上培养人iPSCs，并将其保存在37°C和5%CO ₂的加湿组织培养箱中。
      注意:饲养层细胞的残留可能会阻碍类器官分化。在无饲养层条件下至少传代细胞一次。
   2. 使用无酶分离培养基以80%汇合度通过iPSCs，比例范围为1:4至1:12。为了提高细胞存活率，每次分裂后加入10μM Rho相关蛋白激酶（ROCK）抑制剂（Y27632）。
2. 解离 iPSC（80% 汇合度）-第 0 天。
   1. 准备皮质分化培养基I（CDMI）（表1）。在将CDMI培养基添加到细胞之前，先在室温（22-25°C）下预热CDMI培养基。
   2. 用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤含有iPSCs的孔以去除死细胞和碎屑。
   3. 向每个孔中加入500μL预热试剂A（材料表），并在37°C下孵育5分钟。 在显微镜下检查以确保细胞脱离。
   4. 加入1mL iPSC培养基以稀释试剂A以中和其活性。
   5. 使用1000μL移液器通过上下移液解离细胞，并将细胞悬浮液转移到15mL离心管中。
   6. 在室温（22-25°C）下以125× g 轻轻离心iPSCs5分钟。
   7. 小心地吸出上清液以避免干扰细胞沉淀。
   8. 用1mL CDMI重悬沉淀以获得单细胞悬浮液，并计数细胞数。
   9. 在CDMI中每100μL用9，000个iPSCs制备接种培养基，并补充20μM ROCK抑制剂，3μM WNT-连环蛋白抑制剂（IWR1）和5μM SB431542。
   10. 将每孔100μL接种培养基加入96孔V底板中。
   11. 将板保持在37°C和5%CO ₂的加湿组织培养箱中。
3. 神经球生成
   1. 在第1天，观察具有明确平滑边界的圆形细胞聚集体（神经球）正在形成。注意聚集体周围的死细胞。继续在培养箱中以37°C和5%CO ₂培养。
   2. 在第3天，通过敲击侧面三次以分离死细胞来搅拌板。
   3. 向每个孔中加入100μLCDMI，补充有20μM ROCK抑制剂，3μM IWR1和5μM SB431542。
   4. 将板返回37°C和5%CO ₂的培养箱。
   5. 在第6天，小心地从每个孔中取出80μL上清液培养基。避免触摸井底。
   6. 向每个孔中加入100μLCDMI，辅以3μM IWR1和5μM SB431542。将板返回37°C和5%CO ₂的培养箱。
   7. 每 3 天重复一次步骤 5 和 6，直到第 18 天。
4. 神经球的转移
   1. 在第18天，准备皮质分化培养基II（CDMII）（表1），并将10mL加入100mm超低附着细胞培养板中。
   2. 使用200μL移液器，尖端被切断，将圆形神经球从96孔板转移到100 mm超低附着细胞培养板。
      注意:要轻柔地避免损坏神经球，确保尖端的开口足够宽，并且聚集体不会吸气太快。
   3. 从含有神经球的板中取出5 mL培养基，并加入5 mL新鲜CDMII。
      注意:此过程有助于减少可能从神经球转移中携带的CDMI培养基的量。
   4. 将板以70rpm的速度放在37°C和5%CO ₂的加湿组织培养箱内的轨道振荡器上。
      注意:第二天目视检查神经球。如果神经球聚集在一起或附着在板的底部，则增加眼眶振动器的速度。
   5. 每3天，小心地吸出上清液培养基，并用新鲜的CDMII代替。留下少量培养基，以防止神经球变干。
   6. 在第35天，准备皮质分化培养基III（CDMIII）（表1）。
      注:基质组分应溶解在冷CDMIII中。
   7. 从板中抽出培养基，加入10 mL冷CDMIII。
      注意:使用冷培养基更有效，以便基质组分可以涂覆类器官而不会形成团块。
   8. 更换培养基后，将板放回轨道振荡器上，在37°C和5%CO ₂的加湿组织培养箱内以70rpm的速度放置。
   9. 根据培养基的颜色所示，每3-5天更换培养基，具体取决于生长速度。
   10. 在第70天，准备皮质分化培养基IV（CDMIV）（表1）。使用CDMIV培养基，直到达到所需的类器官年龄。在此期间，将板保持在湿化组织培养培养箱（37°C和5%CO ₂）内设置为70rpm的轨道振荡器上。
   11. 根据生长速度，每3-5天更换一次培养基。

2. 脑类器官的免疫染色

1. 组织制备
   1. 准备4%多聚甲醛（PFA）溶液，并将其置于安全罩下。
      注意:处理PFA时，请穿戴个人安全设备。
   2. 收集脑类器官，并用钝头3 mL塑料巴斯德移液管轻轻地将其转移到充满PFA的6孔板中。
      注意:使用超过40天的类器官，以允许具有较高细胞复杂性的结构的可视化。
   3. 将类器官在室温下在PFA溶液中保存1小时。
   4. 用3 mL塑料巴斯德移液管小心地取出PFA，并使用PBS洗涤固定的类器官三次。
   5. 将固定的类器官储存在PBS中的4°C，直到进一步使用。
2. 脑类器官切片的制备
   1. 准备3%琼脂溶液，慢慢加热直到液化。
   2. 将模具（10 mL注射器的切割端）放在一张吸水滤纸上（光滑的一面朝上）。在上面放一滴琼脂。
   3. 用刮刀从6孔板中快速取出单个类器官，并用滤纸除去过多的PBS。
      注意:注意不要用滤纸直接触摸类器官。
   4. 将类器官放在琼脂液滴上。
   5. 用最多三个类器官重复此过程。
      注意:在此步骤中，请快速工作以避免琼脂凝固。
   6. 用琼脂重新填充模具，直到所有类器官被完全覆盖。
   7. 等到琼脂开始凝固，然后轻轻地将含有类器官的整个模具（包括吸水性滤纸）转移到冷却元件上。
      注意:如果没有冷却元件，请将类器官储存在4°C的冰箱中几分钟。
   8. 同时，准备切片程序:将剃须刀片（用丙酮清洁并用双蒸馏水洗涤）放入振动器的支架中，安装在浴槽上，并用PBS填充。
   9. 从（固化的）琼脂中取出霉菌，然后用手术刀修剪它以形成立方体。
   10. 用粘合凝胶将含有类器官的琼脂立方体附着在振动切片机的载板上（见 材料表），并将其置于含有PBS的浴中。
   11. 调整振动切片机（见 材料表）以切割厚度为150μm的切片。
       注意:振动器设置（叶片的适当角度、振幅、频率和速度）可能与用于切割产后早期动物的固定脑组织的设置相似。然而，理想的设置很大程度上取决于振动切片机的类型，并且必须在第一步中确定，以防止在切割时变形甚至撕裂组织。
   12. 开始切割过程。使用玻璃移液器或刮刀将每个新鲜切割的切片轻轻转移到装满PBS的24孔板中。
   13. 将含有切片的板储存在4°C（最多几天），直到进一步加工。
   14. 用玻璃移液器或刮刀将切片从板中移出到显微镜载玻片上。每张幻灯片至少使用 2 片。
   15. 用注射器小心地去除琼脂和多余的PBS。
   16. 让切片干燥，直到它们粘附在载玻片上。
       注意:虽然显微镜载玻片可以储存在4°C下充满PBS的塑料室中，但在切片程序后应尽快对其进行染色。
3. 免疫组化染色
   1. 准备阻塞溶液（表1）。
   2. 使用 PAP 笔在载玻片上的切片周围绘制疏水边框，以帮助将所有溶液保留在载玻片上。
   3. 小心地将封闭溶液加入载玻片上，并在室温（22-25°C）下孵育1小时。为避免破坏组织，请勿将溶液直接添加到切片的顶部。
   4. 吸出封闭溶液并施加在封闭溶液中稀释的所需一抗。
   5. 将载玻片在4°C的加湿室中孵育过夜。
   6. 用 1 次 PBS 冲洗载玻片三次，每次 10 分钟。
   7. 用稀释在封闭溶液中的特异性二抗孵育切片，并在黑暗中的室温下进行Hoechst染色（1:2，500）1小时。
      注意:请记住执行阴性对照，以确认没有非特异性结合或自动荧光。
   8. 在黑暗中用1x PBS冲洗三次，每次10分钟。
   9. 在切片中加入一滴安装介质，在液滴的边缘放置盖玻片，然后将盖玻片慢慢朝向切片，以避免气泡。
   10. 让载玻片在室温下静置过夜。在盖玻片的边框上涂抹指甲油以进一步密封载玻片。对于长期储存，储存在4°C。
4. 染色记录
   1. 要扫描大图像进行拼接，请使用配备高质量物镜（详见 材料表）的 电动立式宽视场显微镜;DAPI滤光片组（例如，激发（EX）:340-380纳米，二向色镜（DM）:400纳米，势垒滤波器（BA）:435-485纳米）;荧光素异硫氰酸酯滤光片组（例如，EX:465-495 nm，DM:505 nm，BA:515-555 nm）;Alexa594 过滤器集（例如，ET 575/40;T 600 液化铉;HC 623/24）;数码相机;高性能采集软件，可实现自动拼接和堆叠操作。
   2. 对于图像处理，请使用能够生成 8 位 tif 文件、裁剪针迹、调整对比度和亮度、合并通道（例如蓝色、绿色和红色）以及添加比例尺的图像处理程序。
   3. 要扫描细节，请使用配备高质量物镜的电动共聚焦激光扫描显微镜，紫外激光器（EX:408 nm），氩激光器（EX:488 nm），氦氖激光器（EX:543），共聚焦显微镜成像软件。
   4. 对于细节的图像处理，使用能够生成共聚焦z-stack的最大强度投影的图像处理程序（例如，每个0.6μm的光学部分），生成8位tif文件，调整对比度和亮度，合并通道（例如，蓝色，绿色和红色），添加比例尺。
   5. 使用图形编辑器排列图形。

3. 脑类器官的生物能量分析

1. 用于生物能量分析的类器官的制备
   1. 按照制造商的协议准备木瓜蛋白酶和DNA酶溶液。
   2. 将3-5个类器官转移到6孔板中。用预热的PBS清洗两次。
   3. 加入2 mL含有DNA酶的预热活化木瓜蛋白酶溶液。使用刀片将类器官切成小块。
   4. 将板置于细胞培养箱内以27rpm设置的轨道振荡器（在37°C，5%CO ₂下），并孵育15-20分钟。
      注意:孵育时间取决于类器官阶段。早期类器官可以按原样使用。对于超过3个月的类器官，建议在解离前将类器官切成2-3块，并在37°C下以27rpm的摇摆速度孵育这些片段15-20分钟。 该手术可以帮助去除可能存在于后期类器官中的坏死组织。
   5. 将消化的组织收集到15mL管中，并加入5mL类器官培养基CDMIV（表1）。
   6. 用10 mL塑料移液器通过上下移液10-15次来研磨组织。让未解离的组织沉降到管的底部。
   7. 小心地将细胞悬浮液转移到15 mL管中，避免任何未解离的组织。通过40μm细胞过滤器过滤溶液（例如，带有细胞过滤器盖的聚苯乙烯圆底管）。
   8. 通过在室温下以300× g 离心5分钟来沉淀细胞。
   9. 使用台盼蓝评估细胞数量和质量。
   10. 将所需数量的细胞（约20，000 /孔）接种到包衣的96孔微孔板上。接种后6-8小时更换培养基至神经元培养基（表1）。
   11. 将包被的96孔微孔板在_CO2 培养箱（37°C，5%CO ₂）中孵育4天。
2. 生物能量分析
   1. 在重新接种解离细胞后的第3天，将200μL校准溶液加入96孔微孔板底部的每个孔中，并将顶部绿色传感器盒置于水合微孔板上。
      注:将传感器盒以正确的方向放在微孔板的顶部，并确保校准液覆盖所有传感器。
   2. 将水合的96孔微孔板在37°C的非_CO2 培养箱中孵育过夜。
   3. 打开分析仪，让仪器在37°C下稳定过夜。
   4. 在重镀后的第4天，在显微镜下检查96孔微孔板上解离的类器官培养物，以确保细胞显示为汇合单层。
   5. 制备测定培养基（表1）。
   6. 用移液器从所有孔中取出神经元培养基，而不接触孔的底部，以防止细胞损伤。或者，小心地倒置整个盘子，然后在干净的纸上干燥。快速工作以避免细胞死亡。
   7. 用预热的200μL测定培养基洗涤细胞两次。将测定培养基加入每孔180μL的最终体积中。将96孔微孔板在37°C的非_CO2 培养箱中孵育1小时。
   8. 在测定培养基中制备10μM线粒体抑制剂溶液。请注意，注射后的终浓度为1μM。
   9. 将放置在水合微孔板中的传感器盒与10x线粒体抑制剂溶液一起加载。
      1. 将18μL线粒体抑制剂1加入端口A中。
      2. 将19.8μL线粒体抑制剂2加入端口B中。
      3. 将21.6μL线粒体抑制剂2加入端口C中。
      4. 将23.4μL线粒体抑制剂3加入端口D中。
   10. 将加载的墨盒置于37°C的非_CO2 培养箱中的水合微孔板中，直到测定开始。
   11. 在仪器的软件中设置运行协议（表2）。
   12. 按 开始。从非_CO2 培养箱中取出装载的墨盒，并将其放入分析仪进行校准。
       注:确保板以正确的方向插入，并且没有盖子。
   13. 校准步骤结束后，取出校准板。从非_CO2 培养箱中取出96孔微孔板，并将其放入分析仪中。单击" 继续 "开始测量。
   14. 运行完成后，从分析仪中取出96孔细胞培养微孔板，并从所有孔中收集培养基，而不会干扰细胞。
       注意:培养基可以储存在-20°C，稍后使用适当的乳酸测定试剂盒测量培养基中细胞释放的乳酸量。
   15. 在每个孔中用200μL1x PBS洗涤细胞。
   16. 取出PBS后，将板冷冻在-20°C。
       注意:冷冻板可用于定量微孔中每个孔中的细胞，蛋白质或DNA。需要这种定量来使获得的生物能量速率正常化。遵循制造商的细胞、蛋白质或 DNA 定量分析说明。

结果

这里描述的协议有助于圆类器官的稳健生成（图1A）。生成的类器官包含成熟的神经元，可以使用轴突（SMI312）和树突（微管相关蛋白2（MAP2））特异性的蛋白质标记物进行可视化（图1B） ）。成熟的类器官不仅含有神经元细胞（MAP2阳性），还含有神经胶质细胞（例如，星形胶质细胞标志物S100钙结合蛋白B（S100ß）...

讨论

本文描述了人类iPSC衍生的脑类器官的可重复生成及其在线粒体疾病建模中的应用。此处描述的协议是根据以前发表的 ^work20 进行修改的。本方案的一个主要优点是它不需要手动将每个类器官嵌入到支架基质中。实际上，基质溶液只是简单地溶解到细胞培养基中。此外，无需使用昂贵的生物反应器，因为类器官可以在标准组织培养物中培养6孔板，放置在培养箱内的轨道振荡器上。...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
Affinity Designer	Serif (Europe) Ltd		Layout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig	Sigma Aldrich	SAB4600033-250UL	1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-31571	1:300
Antimycin A	Sigma Aldrich	1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)	Sigma Aldrich	T8578	1:2000
Argon Laser	Melles Griot		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acid	Sigma	A92902
B-27 with Vitamin A	Gibco	17504044
Bacto Agar	Becton Dickinson		3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNF	Miltenyi Biotec	130-093-0811
cAMP	Sigma	D0627
Cell Star cell culture 6 well plate	Greiner-Bio-One	657160
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031
Confocal laser scanning microscope C1	Nikon Microscope Solutions		Modular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231	Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher	C7026
DMEM/F12	ThermoFisher	31330038
DMSO	Sigma	D2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3	Merck Millipore	AP180C	1:300
Donkey anti-mouse Cy3	Merck Millipore	AP192C	1:300
Donkey anti-rabbit Cy3	Merck Millipore	AP182C	1:300
DPBS	Gibco	14190250
DS-Q1Mc camera	Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91	Nikon Microscope Solutions		Imaging software for confocal microscope
FCCP	Sigma Aldrich	370-86-5
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-291
Glasgow MEM	Gibco	11710-035
Glass Pasteur pipette	Brand	747715	Inverted
Glutamax	Gibco	35050-061
Helium-Neon Laser	Melles Griot		Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
Heparin	Merck	H3149-25KU
HERACell 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	1:2500
Image J 1.53c	Wayne Rasband National Institute of Health		Image processing Software
Injekt Solo 10 mL/ Luer	Braun	4606108V
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828010
Laser (407 nm)	Coherent		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2	Synaptic Systems	No. 188004	1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAA	Gibco	11140-050
mTeSR Plus	Stemcell Technology	85850	iPSC medium
Multifuge X3R Centrifuge	Thermo Scientific	10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	# LT07-218
N2 Supplement	Gibco	17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW)	Neoject	10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2	Nikon		Imaging software
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
PAP Pen	Sigma	Z377821-1EA	To draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kit	Worthington	LK003150
Paraformaldehyde	Merck	818715	4% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mL	VWR	612-1681	Graduated up to 3 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0	Nikon Microscope Solutions		Dry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13	Nikon Microscope Solutions		Oil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm)	Greiner Bio-One	664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)	Falcon	352235
Potassium chloride	Roth	6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant	Invitrogen	P36980
Qualitative filter paper	VWR	516-0813
Rock Inhibitior	Merck	SCM075
Rotenone	Sigma	83-794
S100β	Abcam	Ab11178	1:600
SB-431542	Cayman Chemical Company	13031
Scalpel blades	Heinz Herenz Hamburq	1110918
SMI312	Biolegend	837904	1:500
Sodium bicarbonate	Merck/Sigma	31437-1kg-M
Sodium chloride	Roth	3957
Sodium dihydrogen phosphate	Applichem	131965
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
SOX2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-17320	1:100
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco/StemPro	A1110501	Reagent A
Super Glue Gel	UHU	63261	adhesive gel
SuperFrost Plus	VWR	631-0108
Syringe for single usage (1 mL)	BD Plastipak	300015
TB2 Thermoblock	Biometra
TC Plate 24 Well	Sarstedt	83.3922
TC Plate 6 Well	Sarstedt	83.392
TGFbeta3	Miltenyi Biotec	130-094-007
Tissue Culture Hood	ThermoFisher	51032711
TOM20	Santa Cruz Biotechnology	SC-11415	1:200
Triton-X	Merck	X100-5ML
UltraPure 0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
Vibratome Microm HM 650 V	Thermo Scientific		Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade	Wilkinson Sword	70517470
Whatman Benchkote	Merck/Sigma	28418852
Wnt Antagonist I	EMD Millipore Corp	3378738
XF 96 extracellular flux analyser	Seahorse Bioscience	100737-101
XF Assay DMEM Medium	Seahorse Bioscience	103680-100
XF Calibrant Solution	Seahorse Bioscience	100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate)	Seahorse Bioscience	102416-100