Генерация органоидов головного мозга человека для моделирования митохондриальных заболеваний

Резюме

Мы описываем подробный протокол генерации индуцированных человеком плюрипотентных органоидов мозга, полученных из стволовых клеток, и их использование в моделировании митохондриальных заболеваний.

Аннотация

Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок метаболизма и в настоящее время неизлечимы. Эти заболевания вызывают дефекты развития нервной системы, основные механизмы которых еще предстоит выяснить. Основным препятствием является отсутствие эффективных моделей, повторяющих раннее нарушение нейронов, наблюдаемое у пациентов. Достижения в технологии индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (IPSCs) позволяют генерировать трехмерные (3D) органоиды мозга, которые могут быть использованы для исследования влияния заболеваний на развитие и организацию нервной системы. Исследователи, в том числе эти авторы, недавно представили органоиды человеческого мозга для моделирования митохондриальных расстройств. В этой статье сообщается о подробном протоколе для надежной генерации органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использовании в митохондриальном биоэнергетическом профилировании и анализе изображений. Эти эксперименты позволят использовать органоиды мозга для исследования метаболических дисфункций и дисфункций развития и могут предоставить важную информацию для препарирования нейронной патологии митохондриальных заболеваний.

Введение

Митохондриальные заболевания представляют собой самый большой класс врожденных ошибок ^{метаболизма1}. Они вызваны генетическими мутациями, нарушающими различные митохондриальные процессы, включая окислительное фосфорилирование (OXPHOS)2, сборку дыхательной ^цепи, митохондриальную динамику и транскрипцию или репликацию митохондриальной ^ДНК3. Ткани с энергетическими потребностями особенно страдают от митохондриальной ^{дисфункции4}. Соответственно, у пациентов с митохондриальными заболеваниями обычно развиваются ранние неврологические проявления.

В настоящее время нет доступных методов лечения для детей, страдающих митохондриальными ^{заболеваниями5}. Основным препятствием для разработки лекарств от митохондриальных заболеваний является отсутствие эффективных моделей, повторяющих течение болезни ^{человека6}. Некоторые из изученных в настоящее время животных моделей не демонстрируют неврологических дефектов, присутствующих у ^{пациентов7}. Следовательно, механизмы, лежащие в основе нейронной патологии митохондриальных заболеваний, до сих пор не до конца поняты.

Недавние исследования генерировали ИПСК у пациентов, страдающих митохондриальными заболеваниями, и использовали эти клетки для получения специфических для пациента нейрональных клеток. Например, было обнаружено, что генетические дефекты, связанные с митохондриальным заболеванием, синдромом Ли, вызывают аберрации в клеточной биоэнергетике8,9, синтезе ^белка10 и гомеостазе ^{кальция9,11}. Эти отчеты предоставили важные механистические подсказки о нарушениях нейронов, происходящих при митохондриальных заболеваниях, проложив путь к открытию лекарств для этих неизлечимых ^{заболеваний12}.

Двумерные (2D) культуры, однако, не позволяют исследовать архитектурную сложность и региональную организацию 3D-органов13. С этой целью использование 3D-органоидов мозга, полученных из специфических для пациента ^iPSCs14, может позволить исследователям получить дополнительную важную информацию и тем самым помочь проанализировать, как митохондриальные заболевания влияют на развитие и функцию нервной ^{системы15}. Исследования с использованием органоидов головного мозга, полученных из iPSC, для изучения митохондриальных заболеваний начинают раскрывать компоненты развития нервной системы митохондриальных заболеваний.

Органоиды спинного мозга, несущие мутации, связанные с митохондриальным заболеванием, митохондриальной энцефалопатией, лактоацидозом и синдромом инсультоподобных эпизодов (MELAS), показали дефектный нейрогенез и задержку дифференцировки двигательных ^{нейронов16}. Корковые органоиды, полученные от пациентов с митохондриальным заболеванием, синдромом Ли, показали уменьшенные размеры, дефекты генерации нервных эпителиальных почек и потерю корковой ^{архитектуры17}. Органоиды головного мозга у пациентов с синдромом Ли показали, что дефекты заболевания инициируются на уровне нейронных клеток-предшественников, которые не могут фиксировать митохондриальный метаболизм, вызывая аберрантное ветвление нейронов и ^{морфогенез18}. Таким образом, нейронные предшественники могут представлять собой клеточную терапевтическую мишень для митохондриальных заболеваний, а стратегии, способствующие их митохондриальной функции, могут поддерживать функциональное развитие нервной системы.

Использование органоидов мозга может помочь раскрыть компоненты нейроразвития митохондриальных заболеваний. Митохондриальные заболевания в основном рассматриваются как раннее начало нейродегенерации5. Однако дефекты развития нервной системы также присутствуют у пациентов, страдающих митохондриальными заболеваниями, включая задержку развития и когнитивные ^{нарушения19}. Органоиды мозга, специфичные для пациента, могут помочь решить эти аспекты и прояснить, как митохондриальные заболевания могут влиять на развитие мозга человека. Митохондриальная дисфункция может также играть патогенетическую роль в других более распространенных неврологических заболеваниях, таких как болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона и болезнь ^{Хантингтона4}. Следовательно, выяснение влияния митохондриальных дефектов на нервное развитие с использованием органоидов мозга также может сыграть важную роль в изучении этих заболеваний. В этой статье описывается подробный протокол генерации воспроизводимых органоидов головного мозга, которые могут быть использованы для проведения моделирования заболеваний митохондрий.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Использование человеческих ИПСК может потребовать этического одобрения. IPSCs, используемые в этом исследовании, были получены от здоровых контрольных лиц после местного этического одобрения (#2019-681). Все процедуры культивирования клеток должны выполняться под стерильным клеточным культиватором, тщательно дезинфицируя все реагенты и расходные материалы перед переносом под капот. Человеческие ИПСК, используемые для дифференциации, должны иметь число проходов ниже 50, чтобы избежать потенциальных геномных аберраций, которые могут возникнуть при обширной культуре. Плюрипотентное состояние клеток должно быть подтверждено до генерации органоидов, например, путем мониторинга экспрессии маркеров, связанных с плюрипотентностью, таких как NANOG или OCT4. Тесты на микоплазму следует проводить еженедельно, чтобы обеспечить культуры без микоплазмы.

1. Генерация органоидов головного мозга

1. Культура человеческих ИПСК
   1. Культивируйте человеческие ИПСК в условиях, свободных от кормителей, в среде iPSC (см. Таблицу материалов) на покрытых 6-луночными пластинами и храните их в инкубаторе культуры увлажненных тканей при 37 °C и 5% _CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Перенос питательных клеток может препятствовать дифференцировке органоидов. Прохождение клеток по крайней мере один раз в условиях, свободных от кормушки.
   2. Проходят иПСК при 80% слиянии с использованием безферментной отслойной среды в соотношениях от 1:4 до 1:12. Чтобы увеличить выживаемость клеток, добавляют 10 мкМ Rho-ассоциированного ингибитора протеинкиназы (ROCK) (Y27632) после каждого расщепления.
2. Диссоциация iPSCs (80% слияния) - День 0.
   1. Готовят кортикальную дифференцировочную среду I (CDMI) (табл. 1). Передогреваемую среду CDMI при комнатной температуре (22-25 °C) перед добавлением ее в ячейки.
   2. Промывайте колодцы, содержащие ИПСК, фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) для удаления мертвых клеток и мусора.
   3. Добавьте 500 мкл предварительно расплавленного реагента А (Таблица материалов) в каждую лунку и инкубируйте в течение 5 мин при 37 °C. Проверьте под микроскопом, чтобы убедиться в отсоединении клеток.
   4. Добавляют 1 мл среды iPSC для разбавления реагента А для нейтрализации его активности.
   5. Используйте пипетку объемом 1000 мкл для диссоциации клеток путем пипетирования вверх и вниз и переноса клеточной суспензии в трубку центрифуги объемом 15 мл.
   6. Осторожно центрифугируйте иПСК при 125 х г в течение 5 мин при комнатной температуре (22-25 °C).
   7. Осторожно аспирируйте супернатант, чтобы не нарушить клеточную гранулу.
   8. Повторно суспендируйте гранулу с 1 мл CDMI для получения одноклеточной суспензии и подсчитайте номер ячейки.
   9. Готовят посевную среду с 9000 иПСК на 100 мкл в CDMI, дополненную ингибитором ROCK 20 мкМ, ингибитором WNT-катенина 3 мкМ (IWR1) и 5 мкМ SB431542.
   10. Добавьте 100 мкл посевной среды на скважину к пластине с v-образным дном из 96 лунок.
   11. Храните пластину в инкубаторе культуры увлажненной ткани при 37 °C и 5% _CO2.
3. Генерация нейросферы
   1. На 1-й день наблюдайте, что формируются круглые клеточные агрегаты (невросферы) с определенными гладкими границами. Обратите внимание на мертвые клетки вокруг агрегатов. Продолжают культивировать в инкубаторе при 37 °C и 5% _CO2.
   2. На 3-й день перемешайте тарелку, постукивая по бокам три раза, чтобы отделить мертвые клетки.
   3. Добавьте 100 мкл CDMI, дополненного ингибитором ROCK 20 мкМ, 3 мкМ IWR1 и 5 мкМ SB431542 к каждой лунке.
   4. Верните пластину в инкубатор при 37 °C и 5% _CO2.
   5. На 6 день осторожно удалите 80 мкл надопоставленной среды из каждой лунки. Избегайте прикосновения к дну колодца.
   6. Добавьте 100 мкл CDMI с добавлением 3 мкМ IWR1 и 5 мкМ SB431542 в каждую лунку. Верните пластину в инкубатор при 37 °C и 5% _CO2.
   7. Повторяйте шаги 5 и 6 каждые 3 дня до 18 дня.
4. Перенос невросфер
   1. На 18-й день подготовьте кортикальную дифференцировочную среду II (CDMII) (таблица 1) и добавьте 10 мл в 100 мм ультранизкую пластину для культивирования клеток.
   2. Используйте пипетку объемом 200 мкл с отрезанным наконечником, чтобы перенести круглые невросферы с 96-луночной пластины на 100-миллиметровую пластину для культивирования клеток со сверхнизким прикреплением.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы избежать повреждения невросфер, убедившись, что отверстие наконечника достаточно широкое и что агрегаты не аспирируются слишком быстро.
   3. Удалите 5 мл среды из пластины, содержащей невросферы, и добавьте 5 мл свежего CDMII.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура помогает уменьшить количество среды CDMI, которая, возможно, перешла от переноса невросфер.
   4. Поместите пластину на орбитальный шейкер со скоростью 70 об/мин внутри инкубатора культуры увлажненной ткани при 37 °C и 5% _CO2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Визуально осмотрите невросферы на следующий день. Увеличьте скорость орбитального шейкера, если невросферы слипнуты вместе или прикреплены к нижней части пластины.
   5. Каждые 3 дня тщательно аспирируйте надосадочную среду и заменяйте ее свежим CDMII. Оставьте небольшое количество среды, чтобы предотвратить высыхание невросфер.
   6. На 35-й день готовят кортикальную дифференцировочную среду III (CDMIII) (таблица 1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Компонент матрицы должен быть растворен в холодном CDMIII.
   7. Аспирируйте среду из пластины и добавьте 10 мл холодного CDMIII.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Более эффективно использовать холодную среду, чтобы компонент матрицы мог покрывать органоиды, не образуя сгустков.
   8. После изменения среды поместите пластину обратно на орбитальный шейкер при 70 об/мин внутри инкубатора культуры увлажненной ткани при 37 °C и 5% _CO2.
   9. Меняйте среду каждые 3-5 дней в зависимости от скорости роста, на что указывает цвет среды.
   10. На 70-й день готовят кортикальную дифференцировочную среду IV (CDMIV) (таблица 1). Используйте среду CDMIV до тех пор, пока не будет достигнут желаемый возраст органоидов. В течение этого периода держите пластину на орбитальном шейкере, установленном при 70 оборотах в минуту внутри инкубатора культуры увлажненной ткани (37 ° C и 5% _CO2).
   11. Меняйте среду каждые 3-5 дней, в зависимости от скорости роста.

2. Иммуноокрашивание органоидов головного мозга

1. Подготовка тканей
   1. Приготовьте 4% раствор параформальдегида (PFA) и поместите его под защитную оболочку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Носите средства индивидуальной безопасности при работе с PFA.
   2. Соберите органоиды мозга и аккуратно перенесите их с помощью пластиковой пипетки Пастера с тупым наконечником 3 мл на 6-луночную пластину, заполненную PFA.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте органоиды старше 40 дней, чтобы обеспечить визуализацию структур с более высокой клеточной сложностью.
   3. Выдерживают органоиды в растворе PFA в течение 1 ч при комнатной температуре.
   4. Осторожно удалите PFA пластиковой пипеткой Пастера объемом 3 мл и трижды вымойте неподвижные органоиды с помощью PBS.
   5. Храните фиксированные органоиды при температуре 4 °C в PBS до дальнейшего использования.
2. Приготовление органоидных срезов головного мозга
   1. Приготовьте 3% раствор агара и медленно нагревайте до разжижения.
   2. Поместите форму (вырезанный конец шприца объемом 10 мл) на кусок абсорбирующей фильтровальной бумаги (гладкая сторона вверх). Поместите на него каплю агара.
   3. Быстро достаньте один органоид из 6-луночной пластины шпателем и удалите лишний PBS фильтровальной бумагой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Будьте осторожны, чтобы не касаться органоида непосредственно фильтровальной бумагой.
   4. Поместите органоид на каплю агара.
   5. Повторите эту процедуру с тремя органоидами.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Работайте быстро, чтобы избежать затвердевания агара на этом этапе.
   6. Заправляйте форму агаром до тех пор, пока все органоиды не будут полностью покрыты.
   7. Подождите, пока агар начнет затвердевать, а затем аккуратно перенесите всю форму, содержащую органоиды, включая абсорбирующую фильтровальную бумагу, на охлаждающий элемент.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если охлаждающий элемент недоступен, храните органоиды в течение нескольких минут в холодильнике при температуре 4 °C.
   8. А пока подготовьтесь к процедуре нарезки: поместите лезвие бритвы (очищенное ацетоном и промытое двойной дистиллированной водой) в держатель вибратома, установите на ванну и наполните его PBS.
   9. Удалите плесень из (затвердевшего) агара и используйте скальпель, чтобы обрезать его, чтобы сформировать куб.
   10. Прикрепите куб агара, содержащий органоиды, к несущей пластине вибратома с помощью адгезивного геля (см. Таблицу материалов) и поместите его в ванну, содержащую PBS.
   11. Отрегулируйте вибратом (см. Таблицу материалов) для резки срезов толщиной 150 мкм.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки вибратома (правильный угол, амплитуда, частота и скорость лезвия) могут быть аналогичны тем, которые используются для нарезки фиксированной мозговой ткани, полученной от ранних постнатальных животных. Тем не менее, идеальные настройки сильно зависят от типа вибратома и должны быть определены на первом этапе, чтобы предотвратить искажение или даже разрыв ткани во время разреза.
   12. Начните процедуру резки. Используйте стеклянную пипетку или шпатель, чтобы аккуратно перенести каждый свеженарезанный кусочек в 24-луночную тарелку, наполненную PBS.
   13. Храните пластину, содержащую ломтики, при 4 °C (до нескольких дней) до дальнейшей обработки.
   14. Переложите кусочки из тарелки стеклянной пипеткой или шпателем на предметные стекла микроскопа. Используйте не менее 2 фрагментов на слайд.
   15. Аккуратно удалите агар и излишки ПБС шприцем.
   16. Дайте ломтикам высохнуть, пока они не прилипнут к слайдам.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя предметные стекла микроскопа можно хранить в пластиковых камерах, заполненных PBS при 4 °C, они должны быть окрашены как можно скорее после процедуры нарезки.
3. Иммуногистохимическое окрашивание
   1. Подготовьте блокирующий раствор (табл. 1).
   2. Используйте ручку PAP, чтобы нарисовать гидрофобную границу вокруг срезов на слайде, чтобы сохранить все решения на слайдах.
   3. Осторожно добавляют блокирующий раствор на горку, и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре (22-25 °С). Чтобы избежать разрушения ткани, не добавляйте раствор непосредственно поверх ломтиков.
   4. Аспирировать блокирующий раствор и применять желаемое первичное антитело, разведенное в блокирующем растворе.
   5. Инкубируйте горку в течение ночи в увлажненной камере при 4 °C.
   6. Промойте слайд три раза с 1x PBS в течение 10 минут каждый.
   7. Инкубируют срезы со специфическим вторичным антителом, разведенным в блокирующем растворе, и выполняют окрашивание Hoechst (1:2,500) в течение 1 ч при комнатной температуре в темноте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не забудьте выполнить отрицательные элементы управления, чтобы подтвердить, что нет неспецифического связывания или автофлуоресценции.
   8. Смойте три раза 1x PBS в течение 10 минут каждый в темноте.
   9. Добавьте одну каплю монтажной среды к срезу, поместите крышку на край капли и медленно положите крышку вниз к срезу, чтобы избежать пузырьков воздуха.
   10. Дайте слайду отдохнуть ночью при комнатной температуре. Нанесите лак для ногтей на границу обшивки, чтобы еще больше запечатать слайд. Для длительного хранения хранить при температуре 4 °C.
4. Документация по окрашиванию
   1. Для сканирования больших изображений на предмет сшивания используйте моторизованный вертикальный широкоугольный микроскоп, оснащенный (см. Таблицу материалов для деталей) высококачественным объективом; Набор фильтров DAPI (например, возбуждение (EX): 340-380 нм, дихроичное зеркало (DM): 400 нм, барьерный фильтр (BA): 435-485 нм); набор флуоресцеиновых изотиоцианатных фильтров (например, EX: 465-495 нм, DM: 505 нм, BA: 515-555 нм); Набор фильтров Alexa594 (например, ET 575/40; T 600 LPXR; HC 623/24); цифровой фотоаппарат; высокопроизводительное программное обеспечение для сбора, позволяющее автоматизировать стежки и стековые операции.
   2. Для обработки изображений используйте программу обработки изображений, способную генерировать 8-битные tif-файлы, обрезать стежки, регулировать контрастность и яркость, объединять каналы (например, синий, зеленый и красный) и добавлять шкалы масштаба.
   3. Для сканирования деталей используйте моторизованный конфокальный лазерный сканирующий микроскоп, оснащенный высококачественным объективом, УФ-лазер (EX: 408 нм), аргоновый лазер (EX: 488 нм), гелий-неоновый лазер (EX: 543), программное обеспечение для визуализации для конфокального микроскопа.
   4. Для обработки деталей изображения используйте программу обработки изображений, способную генерировать проекции максимальной интенсивности конфокальных z-стеков (например, оптических секций по 0,6 мкм каждый), генерировать 8-битные tif-файлы, регулировать контрастность и яркость, объединять каналы (например, синий, зеленый и красный), добавлять шкалы масштаба.
   5. Используйте графический редактор для упорядочения фигур.

3. Биоэнергетическое профилирование органоидов головного мозга

1. Подготовка органоидов для биоэнергетического профилирования
   1. Подготовьте раствор папаина и ДНКазы в соответствии с протоколом производителя.
   2. Переведите 3-5 органоидов в 6-луночную пластину. Вымойте их два раза с помощью предварительно расплавленного PBS.
   3. Добавьте 2 мл предварительно расплавленного активированного раствора папаина, содержащего ДНКазу. С помощью лезвия разрежьте органоиды на мелкие кусочки.
   4. Поместите пластину на орбитальный шейкер, установленный при 27 об/мин внутри инкубатора клеточной культуры (при 37 °C, 5% _CO2), и инкубируйте в течение 15-20 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Время инкубации зависит от органоидной стадии. Органоиды ранней стадии могут быть использованы такими, какие они есть. Для органоидов старше 3 месяцев рекомендуется разрезать органоиды на 2-3 части перед диссоциацией и инкубировать кусочки со скоростью раскачивания, установленной при 27 об/мин в течение 15-20 мин при 37 °C. Эта процедура может помочь удалить некротическую ткань, которая может присутствовать в органоидах более поздней стадии.
   5. Соберите переваренные ткани в пробирку объемом 15 мл и добавьте 5 мл органоидной культуральной среды CDMIV (таблица 1).
   6. Тритурируйте ткань пластиковой пипеткой объемом 10 мл, пипеткой вверх и вниз 10-15 раз. Дайте недиссоциированной ткани осесть на дно трубки.
   7. Осторожно перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл, избегая любых кусочков недиссоциированной ткани. Отфильтруйте раствор через 40-мкм клеточный сетчатый фильтр (например, полистирольные трубки круглого дна с крышками клеточного сетчатого фильтра).
   8. Гранулируют ячейки центрифугированием при 300 х г в течение 5 мин при комнатной температуре.
   9. Оцените количество и качество клеток с помощью трипан-синего цвета.
   10. Нанесите желаемое количество (~20 000/лунка) ячеек на покрытые 96-луночными микропластинами. Изменение среды через 6-8 ч после нанесения покрытия на нейронную среду (табл. 1).
   11. Инкубировать микропластину с покрытием из 96 лунок в _{CO2-инкубаторе} (37 °C, 5% _CO2) в течение 4 дней.
2. Биоэнергетическое профилирование
   1. На 3-й день после повторного покрытия диссоциированных клеток добавьте 200 мкл калибровочного раствора в каждую лунку нижней части 96-луночной микропластины и поместите верхний зеленый картридж датчика на гидратированную микропластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите картридж датчика поверх микропластины в правильной ориентации и убедитесь, что калибрант покрывает все датчики.
   2. Инкубируйте гидратированную 96-луночную микропластину в инкубаторе без _CO2 при 37 °C в течение ночи.
   3. Включите анализатор, чтобы прибор стабилизировался при 37 °C в течение ночи.
   4. На 4-й день после повторного покрытия осмотрите диссоциированную органоидную культуру на 96-луночной микропластине под микроскопом, чтобы убедиться, что клетки выглядят как сливающийся монослой.
   5. Подготовьте пробирную среду (табл. 1).
   6. Удалите нейронную среду из всех лунок с помощью пипетки, не касаясь дна лунки, чтобы предотвратить повреждение клеток. Кроме того, осторожно переверните всю пластину, а затем высушите ее на чистой бумаге. Работайте быстро, чтобы избежать гибели клеток.
   7. Дважды промыть клетки предварительно расплавленным 200 мкл пробирной среды. Добавьте пробирную среду к конечному объему 180 мкл на скважину. Инкубируйте 96-луночную микропластину в инкубаторе без _CO2 при 37 °C в течение 1 ч.
   8. Готовят 10 мкМ растворов митохондриальных ингибиторов в пробирной среде. Отметим, что конечная концентрация после инъекции составляет 1 мкМ.
   9. Загрузите картридж датчика, помещенный в гидратированную микропластинку, 10-кратными растворами митохондриальных ингибиторов.
      1. Добавьте 18 мкл митохондриального ингибитора 1 в порт А.
      2. Добавьте 19,8 мкл митохондриального ингибитора 2 в порт B.
      3. Добавьте 21,6 мкл митохондриального ингибитора 2 в порт С.
      4. Добавьте 23,4 мкл митохондриального ингибитора 3 в порт D.
   10. Поместите заряженный картридж в гидратированную микропластинку в инкубаторе без _CO2 при температуре 37 °C до начала анализа.
   11. Настройте работающий протокол в программном обеспечении прибора (таблица 2).
   12. Нажмите кнопку СТАРТ. Возьмите заряженный картридж из инкубатора без _CO2 и поместите его в анализатор для калибровки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что пластина вставлена в правильной ориентации и без крышки.
   13. Как только этап калибровки закончится, снимите калибровочную пластину. Возьмите 96-луночную микропластину из инкубатора без _CO2 и поместите ее в анализатор. Нажмите ПРОДОЛЖИТЬ , чтобы начать измерения.
   14. Когда пробег будет завершен, извлеките микропластину 96-луночной клеточной культуры из анализатора и соберите среду из всех лунок, не нарушая клетки.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Среда может храниться при -20 °C и использоваться позже для измерения количества лактата, высвобождаемого клетками в среде, с использованием соответствующего набора для анализа лактата.
   15. Промывайте ячейки 200 мкл 1x PBS в каждой лунке.
   16. После удаления PBS заморозьте пластину при -20 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Замороженная пластина может быть использована для количественной оценки клеток, белков или ДНК в каждой лунке микропластины. Эта количественная оценка понадобится для нормализации полученных биоэнергетических норм. Следуйте инструкциям производителя для количественных анализов клеток, белков или ДНК.

Результаты

Протокол, описанный здесь, облегчает надежную генерацию круглых органоидов (рисунок 1A). Генерируемые органоиды содержат зрелые нейроны, которые можно визуализировать с помощью белковых маркеров, специфичных для аксонов (SMI312) и дендритов (микротрубоче-ассоциир...

Обсуждение

В этой статье описывается воспроизводимая генерация органоидов головного мозга человека, полученных из iPSC, и их использование для моделирования митохондриальных заболеваний. Протокол, описанный здесь, модифицирован на основе ранее опубликованной ^{работы20}. Одним из основ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
2-mercaptoethanol	Gibco	31350-010
Affinity Designer	Serif (Europe) Ltd		Layout software; Vector graphics editor
Alexa Fluor 488 donkey anti-guinea pig	Sigma Aldrich	SAB4600033-250UL	1:300
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse	Thermo Fisher Scientific	A-31571	1:300
Antimycin A	Sigma Aldrich	1397-94-0
Anti-β-Tubulin III (TUJ-1)	Sigma Aldrich	T8578	1:2000
Argon Laser	Melles Griot		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 488 is fine, too
Ascorbic acid	Sigma	A92902
B-27 with Vitamin A	Gibco	17504044
Bacto Agar	Becton Dickinson		3% in PBS, store solution at -20 °C
BDNF	Miltenyi Biotec	130-093-0811
cAMP	Sigma	D0627
Cell Star cell culture 6 well plate	Greiner-Bio-One	657160
Chemically Defined Lipid Concentrate	Gibco	11905031
Confocal laser scanning microscope C1	Nikon Microscope Solutions		Modular confocal microscope system
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement membrane matrix, Phenol Red-free, LDEV-free	Corning	356231	Matrix component
CyQUANT Cell Proliferation Assay Kit	Thermo Fisher	C7026
DMEM/F12	ThermoFisher	31330038
DMSO	Sigma	D2660-100ML
Donkey anti-goat Cy3	Merck Millipore	AP180C	1:300
Donkey anti-mouse Cy3	Merck Millipore	AP192C	1:300
Donkey anti-rabbit Cy3	Merck Millipore	AP182C	1:300
DPBS	Gibco	14190250
DS-Q1Mc camera	Nikon Microscope Solutions
Eclipse 90i upright widefield microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse E 600FN upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Eclipse Ts2 Inverted Microscope	Nikon Microsope Solutions
EZ-C1 Silver Version 3.91	Nikon Microscope Solutions		Imaging software for confocal microscope
FCCP	Sigma Aldrich	370-86-5
Fetal Bovine Serum	Gibco	10270-106
GDNF	Miltenyi Biotec	130-096-291
Glasgow MEM	Gibco	11710-035
Glass Pasteur pipette	Brand	747715	Inverted
Glutamax	Gibco	35050-061
Helium-Neon Laser	Melles Griot		Every other Laser, e.g., diode lasers emitting 594 is fine, too
Heparin	Merck	H3149-25KU
HERACell 240i CO2 Incubator	Thermo Scientific	51026331
Hoechst 33342	Invitrogen	H3570	1:2500
Image J 1.53c	Wayne Rasband National Institute of Health		Image processing Software
Injekt Solo 10 mL/ Luer	Braun	4606108V
Knockout Serum Replacement	Gibco	10828010
Laser (407 nm)	Coherent		Any other Laser, e.g., diode lasers emitting 407 is fine, too
Map2	Synaptic Systems	No. 188004	1:1000
Maxisafe 2030i
MEM NEAA	Gibco	11140-050
mTeSR Plus	Stemcell Technology	85850	iPSC medium
Multifuge X3R Centrifuge	Thermo Scientific	10325804
MycoAlert Mycoplasma Detection Kit	Lonza	# LT07-218
N2 Supplement	Gibco	17502-048
Needle for single usage (23G x 1” TW)	Neoject	10016
NIS-Elements Aadvanced Research 3.2	Nikon		Imaging software
Oligomycin A	Sigma Aldrich	75351
Orbital Shaker Heidolph Unimax 1010	Heidolph	543-12310-00
PAP Pen	Sigma	Z377821-1EA	To draw hydrophobic barrier on slides.
Papain Dissociation System kit	Worthington	LK003150
Paraformaldehyde	Merck	818715	4% in PBS, store solution at -20 °C
Pasteur pipette 7mL	VWR	612-1681	Graduated up to 3 mL
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Plan Apo VC 20x / 0.75 air DIC N2  ∞/0.17 WD 1.0	Nikon Microscope Solutions		Dry Microscope Objective
Plan Apo VC 60x / 1.40 oil DIC N2 ∞/0.17 WD 0.13	Nikon Microscope Solutions		Oil Immersion Microscope Objective
Polystyrene Petri dish (100 mm)	Greiner Bio-One	664161
Polystyrene round-bottom tube with cell-strainer cap (5 mL)	Falcon	352235
Potassium chloride	Roth	6781.1
ProLong Glass Antifade Moutant	Invitrogen	P36980
Qualitative filter paper	VWR	516-0813
Rock Inhibitior	Merck	SCM075
Rotenone	Sigma	83-794
S100β	Abcam	Ab11178	1:600
SB-431542	Cayman Chemical Company	13031
Scalpel blades	Heinz Herenz Hamburq	1110918
SMI312	Biolegend	837904	1:500
Sodium bicarbonate	Merck/Sigma	31437-1kg-M
Sodium chloride	Roth	3957
Sodium dihydrogen phosphate	Applichem	131965
Sodium Pyruvate	Gibco	11360070
SOX2	Santa Cruz Biotechnology	Sc-17320	1:100
StemPro Accutase Cell Dissociation Reagent	Gibco/StemPro	A1110501	Reagent A
Super Glue Gel	UHU	63261	adhesive gel
SuperFrost Plus	VWR	631-0108
Syringe for single usage (1 mL)	BD Plastipak	300015
TB2 Thermoblock	Biometra
TC Plate 24 Well	Sarstedt	83.3922
TC Plate 6 Well	Sarstedt	83.392
TGFbeta3	Miltenyi Biotec	130-094-007
Tissue Culture Hood	ThermoFisher	51032711
TOM20	Santa Cruz Biotechnology	SC-11415	1:200
Triton-X	Merck	X100-5ML
UltraPure 0.5M EDTA	Invitrogen	15575020
Vibratome Microm HM 650 V	Thermo Scientific		Production terminated, any other adjustable microtome is fine, too.
Vibratome Wilkinson Classic Razor Blade	Wilkinson Sword	70517470
Whatman Benchkote	Merck/Sigma	28418852
Wnt Antagonist I	EMD Millipore Corp	3378738
XF 96 extracellular flux analyser	Seahorse Bioscience	100737-101
XF Assay DMEM Medium	Seahorse Bioscience	103680-100
XF Calibrant Solution	Seahorse Bioscience	100840-000
XFe96 FluxPak (96-well microplate)	Seahorse Bioscience	102416-100