JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים מתודולוגיית ייצור עבור מערכי אלקטרודה סיבי פחמן להתאמה אישית להקלטה ב vivo בעצב ובמוח.

Abstract

בדיקות עצבים היקפיות קונבנציונליות מיוצרות בעיקר בחדר נקי, הדורשות שימוש בכלים יקרים ומתמחים מאוד. מאמר זה מציג תהליך ייצור "אור" חדר נקי של מערכי אלקטרודות עצביות סיבי פחמן שניתן ללמוד במהירות על ידי משתמש חדר נקי חסר ניסיון. תהליך ייצור מערך אלקטרודות סיבי פחמן זה דורש רק כלי ניקוי אחד, מכונת תצהיר Parylene C, שניתן ללמוד במהירות או במיקור חוץ למתקן עיבוד מסחרי בעלות שולית. תהליך ייצור זה כולל גם איכון ידני של מעגלים מודפסים, בידוד ואופטימיזציה של טיפים.

שלוש אופטימיזציות הקצה השונות שנחקרו כאן (לייזר Nd:YAG, מבער ולייזר UV) גורמות למגוון גיאומטריות קצה ועוכבה של 1 kHz, עם סיבים מבערים וכתוצאה מכך העכבה הנמוכה ביותר. בעוד ניסויים קודמים הוכיחו יעילות אלקטרודה לייזר מבער, מאמר זה גם מראה כי סיבים לחתוך לייזר UV יכול להקליט אותות עצביים ויוו. מערכי סיבי פחמן קיימים אינם כוללים אלקטרודות מחולקות לטובת חבילות או דורשים מדריכים מפוברקים בחדר נקי לאוכלוסייה ובידוד. המערכים המוצעים משתמשים רק בכלים שניתן להשתמש בהם בספסל לאוכלוסיית הסיבים. תהליך ייצור מערך אלקטרודות סיבי פחמן זה מאפשר התאמה אישית מהירה של ייצור מערך בתפזורת במחיר מופחת בהשוואה לבדיקות זמינות מסחרית.

Introduction

רוב המחקר במדעי המוח מסתמך על הקלטת אותות עצביים באמצעות אלקטרופיזיולוגיה (ePhys). אותות עצביים אלה חיוניים להבנת הפונקציות של רשתות עצביות וטיפולים רפואיים חדשניים כגון מכונת מוח וממשקי עצב היקפיים1,2,3,4,5,6. מחקר סביב עצבים היקפיים דורש אלקטרודות הקלטה עצביות מותאמות אישית או זמינות מסחרית. הקלטה עצבית אלקטרודות - כלים ייחודיים עם ממדים בקנה מידה מיקרוני וחומרים שבירים - דורשים קבוצה מיוחדת של מיומנויות וציוד כדי לפברק. מגוון בדיקות מיוחדות פותחו לשימושי קצה ספציפיים; עם זאת, זה מרמז כי ניסויים חייבים להיות מתוכננים סביב בדיקות מסחריות זמינות כיום, או מעבדה חייבת להשקיע בפיתוח של בדיקה מיוחדת, שהוא תהליך ממושך. בשל המגוון הרחב של מחקר עצבי בעצבים היקפיים, יש ביקוש גבוה לבדיקת ePhys רב-תכליתית4,7,8. בדיקה ePhys אידיאלית תכלול אתר הקלטה קטן, עכבה נמוכה9, ונקודת מחיר מציאותית מבחינה כלכלית ליישום במערכת3.

אלקטרודות מסחריות נוכחיות נוטות להיות אלקטרודות חיצוניות או חפתים (Neural Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff Electrode11), שיושבות מחוץ לעצב, או תוך-פשוליות, החודרות לעצב ויושבות בתוך הפשיזם של העניין. עם זאת, ככל שאלקטרודות חפתים יושבות רחוק יותר מהסיבים, הן קולטות יותר רעש מהשרירים הסמוכים ומפשקים אחרים שאולי אינם המטרה. בדיקות אלה נוטות גם לכווץ את העצב, אשר יכול להוביל biofouling- הצטברות של תאי גליה ורקמת צלקת - בממשק האלקטרודה בזמן הרקמה מרפאת. אלקטרודות תוך-חשמליות (כגון LIFE12, TIME13 ו-Utah Arrays14) מוסיפות את היתרון של סלקטיביות פאשיסטית ובעלות יחסי אות לרעש טובים, החשובים בהפלת אותות למתממשקים במכונה. עם זאת, בדיקות אלה יש בעיות עם תאימות ביולוגית, עם עצבים הופכים מעוותים לאורך זמן 3,15,16. כאשר נרכש מסחרית, שתי בדיקות אלה יש עיצובים סטטיים ללא אפשרות להתאמה אישית ספציפית לניסוי והם יקרים עבור מעבדות חדשות יותר.

בתגובה לבעיות העלות וההתאמה הביולוגית הגבוהות המוצגות על ידי בדיקות אחרות, אלקטרודות סיבי פחמן עשויות להציע שדרה למעבדות מדעי המוח לבנות בדיקות משלהן ללא צורך בציוד מיוחד. סיבי פחמן הם חומר הקלטה חלופי עם גורם צורה קטן המאפשר החדרת נזק נמוך. סיבי פחמן מספקים תאימות ביולוגית טובה יותר ותגובת צלקת נמוכה בהרבה מאשר סיליקון17,18,19 ללא עיבוד חדר ניקוי אינטנסיבי5,13,14. סיבי פחמן גמישים, עמידים, משולבים בקלות עם ביו-חומרים אחרים19, ויכולים לחדור ולתעד מהעצבים 7,20. למרות היתרונות הרבים של סיבי פחמן, מעבדות רבות מוצאות את הייצור הידני של מערכים אלה מפרך. קבוצות מסוימות21 לשלב סיבי פחמן לתוך חבילות כי באופן קולקטיבי לגרום בקוטר גדול יותר (~ 200 מיקרומטר); עם זאת, למיטב ידיעתנו, חבילות אלה לא אומתו בעצב. אחרים המציאו מערכי אלקטרודות של סיבי פחמן, אם כי השיטות שלהם דורשות מדריכי סיבי פחמן מפוברקים בחדר נקי22,23,24 וציוד כדי לאכלס את המערכים שלהם17,23,24. כדי לטפל בכך, אנו מציעים שיטה של ייצור מערך סיבי פחמן שניתן לבצע בספסל המעבדה המאפשר שינויים מאולתרים. המערך המתקבל שומר על טיפים אלקטרודות אינדיווידואליים ללא כלים מיוחדים לאכלוס סיבים. בנוסף, גיאומטריות מרובות מוצגות כדי להתאים לצרכים של הניסוי המחקרי. מאמר זה, שנבנה מעבודה קודמת8,17,22,25, מספק מתודולוגיות מפורטות כדי לבנות ולשנות מספר סגנונות של מערכים באופן ידני עם זמן אימון מינימלי בחדר נקי.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים אושרו על ידי אוניברסיטת מישיגן מוסדי טיפול בבעלי חיים ושימוש הוועדה.

1. בחירת מערך סיבי פחמן

  1. בחרו לוח מעגלים מודפס (PCB) מאחד משלושת העיצובים המוצגים באיור 1.
    הערה: עבור פרוטוקול זה, מערכי Flex יהיו המוקד.
    1. עיין בעיצובי PCB באתר האינטרנט של מעבדת צ'סטרק (https://chestekresearch.engin.umich.edu), ללא תשלום ומוכן לשליחה ולהזמנה להדפסה דרך בית דפוס PCB.
    2. ראה טבלה 1 לקבלת סיכום של מחברים עבור כל לוח והמפרטים שלהם כדי לסייע בבחירת המחבר שיעבוד עבור ההתקנה הניסיונית הספציפית.

2. הלחמת המחבר ללוח המעגלים

  1. הגדר מגהץ הלחמה ל 315 °C (600 °F).
  2. יש למרוח שטף על כל רפידות ההלחמה על ה-PCB.
    הערה: שטף בתוך צינור ניתן לסחוט על פני הרפידות, בעוד שטף בסיר ניתן להחיל עם קצה העץ של אפליקטור כותנה קצה על ידי מריחת השטף על פני כל רפידות בנדיבות.
  3. צרו ערימות קטנות של הלחמה על הרפידות האחוריות של מערך Flex (איור 2A).
  4. הלחמו את השורה התחתונה של פיני המחבר לשורה האחורית של רפידות הלחמה (איור 2B).
    הערה: כל עיצובי הלוח שסופקו על ידי מעבדת Chestek תוכננו כך שהמחברים ישולבו בדיוק עם הלוח הייעודי שלהם.
    1. כדי לעשות זאת, הלחמה את הסיכות משני צדי המחבר עם גישה קלה לתלוליות הלחמה. לאחר האבטחה, יש לדחוף בעדינות את קצה הברזל הלחמה בין הפינים הקדמיים כדי להלחים את החיבורים הנותרים מאחור.
      הערה: לאחר שהשורה האחורית של הפינים מאובטחת, שאר המחבר יתיישר עם כל פין מעל משטח ההלחמה שהוקצה לו.
  5. הלחמה השורה הראשונה של סיכות על הלוח על ידי החלת כמות קטנה של הלחמה על כל סיכה. החל שכבה נוספת של שטף אם הלחמה אינה מתרחשת במהירות.
    1. יש לנקות את השטף העודף עם 100% אלכוהול איזופרופיל (IPA) ומברשת זיפים קצרה.
  6. לתמצת את החיבורים המולחמים באפוקסי סט מושהה (איור 2 C,D) באמצעות מחט 23 G ומזרק 1 מ"ל להציב צד משופע על הסיכות. לדחוף אפוקסי דרך המזרק לאט, כך שהוא זורם לתוך ולאורך החיבורים.
    1. השאירו את הלוח ללילה כדי שאפוקסי הסט המתעכב יוכל לרפא.
      הערה: בעוד המוצר להוסיף עבור אפוקסי להגדיר מושהה קובע כי הוא מרפא בתוך 30 דקות, השארת אותו לילה מאפשר חיבור יציב יותר להיווצר.
  7. אבטח את החלק האחורי של הלוח לצדי המחבר על-ידי הנחת קו קטן של אפוקסי מוגדר מושהה על פני הצד האחורי של הלוח ומשיכתו אל קצות המחבר.
    1. תשאיר את הלוח כדי לרפא בן לילה שוב.
      הערה: בשלב זה, אחסן את המערכים או המשך בבנייה. אם אתם עוצרים במבנה, אחסנו את המערכים בקופסה נקייה ויבשה בטמפרטורת החדר.

3. אוכלוסיית הסיבים

  1. חותכים נימי זכוכית משוך כך שהקצה שלו יתאים בין עקבות המערך (איור 3A).
    1. באמצעות משיכת זכוכית ו חוט, לעשות נימים באמצעות ההגדרות הבאות: חום = 900, למשוך = 70, מהירות = 35, זמן = 200, לחץ = 900.
      הערה: המספרים הם ללא יחידה וספציפיים להתקן זה (עיין בטבלת החומרים).
  2. השתמשו בקצות העץ של שני אפליקטורים בעלי קצה כותנה (אחד לכל חלק של אפוקסי כסף) כדי לגרוף יחס קטן של 1:1 של אפוקסי כסף בצלחת פלסטיק ולערבב באמצעות אותם מקלות המשמשים לגרוף. יש להשליך את האפליקטורים לאחר ערבוב.
  3. חותכים 2-4 מ"מ מקצה חבילת סיבי הפחמן על פיסת נייר מדפסת באמצעות סכין גילוח. כדי להפריד בקלות את הסיבים בחבילה, אשר קשה להקניט זה מזה, למשוך פיסת נייר למינציה בעדינות על החלק העליון של החבילה.
    הערה: פיסת נייר למינציה מעבירה סטטי לתוך הסיבים, אשר ייפרדו בעצמם.
  4. החל אפוקסי כסף בין כל זוג אחר של עקבות בצד אחד של הלוח עם נימי הזכוכית (איור 3B).
    1. קח טיפה קטנה של אפוקסי על הקצה של נימי משך. יש למרוח בעדינות בין כל עקבות אחרים בקצה הלוח, ולמלא את הרווח.
      הערה: יש למלא את הפער בחלק העליון של שני העקבות מבלי לעלות על גדותיו כדי לגעת בעקבות שכנים. כל עקבות מחוברים לערוץ אחד. שיטה זו של אוכלוסיית אפוקסי פירושה שלכל סיב יהיו שני ערוצים המחוברים אליו. הסיבה לכך היא ששני עקבות מאפשרים יישור סיבים טוב יותר, ויתירות בערוץ מסייעת להבטיח חיבור חשמלי.
  5. השתמשו בפינצטה מצופה טפלון כדי למקם סיבי פחמן אחד בכל עקבות אפוקסי (איור 3C).
  6. השתמשו בנימי משוך ונקי כדי להתאים את סיבי הפחמן, כך שהם יהיו מאונכים עד סוף לוח מערך Flex ויקברו מתחת לאפוקסי (איור 3D).
  7. מניחים את המערכים על בלוק עץ עם קצוות סיבים מעל קצה הבלוק.
    הערה: המשקל של הקצה האחורי ישאיר את המערך בבלוק.
  8. אופים את בלוק העץ ואת מערכים ב 140 °C (50 °F) במשך 20 דקות כדי לרפא את אפוקסי הכסף ולנעול את הסיבים למקומו.
  9. חזור על שלבים 3.4-3.8 עבור הצד השני של הלוח.
    הערה: ניתן לאחסן מערכים לאחר כל שלב אפייה; עם זאת, סטטי מתיבות האחסון עלול לגרום לסיבים להתרחק מהלוח אם מעט מדי אפוקסי כסף הוחל בעת אכלוס הלוח.
    1. צור פלטפורמת דבק מוגבהת בתוך קופסה, כך שרוב הלוח יכול להיות דבוק לדבק המאפשר את הקצוות הסיבים של הלוח להיות מושעה בתוך הקופסה כדי למנוע שבירת סיבים. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
      הערה: אם סיבים מתרחקים מהלוח במהלך האחסון, לגרד את האפוקסי מתוך העקבות עם נימי זכוכית משוך נקי ולחזור על שלבים 3.1-3.8 כדי להחליף את הסיבים. מנקודה זו ואילך, מערכים חייבים להיות מאוחסנים עם הסיבים מושעים באופן זה כדי למנוע שבירת סיבים.

4. החלת אפוקסי אולטרה סגול (UV) כדי לבודד את סיבי הפחמן

  1. השתמשו בנימי נקי והחלו טיפה קטנה (בקוטר של כ-0.5 מ"מ של אפוקסי UV על העקבות החשופים בצד אחד של הלוח (איור 4A). המשך להוסיף טיפות אפוקסי UV עד העקבות מכוסים לחלוטין.
    הערה: אין לאפשר לאפוקסי UV לעלות על סיבי הפחמן מעבר לסוף ה- PCB כדי להבטיח הכנסה חלקה מאוחר יותר.
  2. לרפא את אפוקסי UV תחת אור עט UV במשך 2 דקות (איור 4B).
  3. חזור על שלבים 4.1-4.2 עבור הצד השני של הלוח.
  4. חותכים את הסיבים ל 1 מ"מ באמצעות רשת סטריאוסקופ ומספריים כירורגיים.
    הערה: ניתן לאחסן מערכים בשלב זה עד שיהיו מוכנים להמשיך לשלבים הבאים. הם צריכים להיות מאוחסנים בקופסה שתרומם את סיבי הפחמן הרחק מהקופסה עצמה. ניתן לאחסן מערכים בטמפרטורת החדר ללא הגבלת זמן.

5. בדיקת חיבורים חשמליים באמצעות סריקות עכבה של 1 קילו-הרץ (איור 5)

  1. שקוע סיבי פחמן 1 מ"מ לתוך 1x תמיסת מלח חוצץ פוספט (PBS).
  2. כדי להשלים את המעגל, השתמש בכלוריד כסף-כסף (Ag| AgCl) אלקטרודת התייחסות מוט נירוסטה (אלקטרודה נגד).
    1. באמצעות מהדק, להשעות את Ag| אלקטרודה AgCl ב 1x PBS ולחבר אותו להפניה של מערכת עכבה בשימוש.
    2. באמצעות מהדק, להשעות את מוט נירוסטה ב 1x PBS ולהתחבר לקלט אלקטרודה מונה של מערכת עכבה בשימוש.
  3. הפעל סריקת עכבה של 1 kHz עבור כל סיב באמצעות potentiostat המוגדר לתדר סריקה של 1 kHz ב- 0.01 Vrms בצורת גל סינוס אחת. הגדר את potentiostat ל 0 V בתחילת כל סריקה עבור 5 s כדי לייצב את האות המוקלט. הקלט את המדידות באמצעות התוכנה הקשורה לפוטנציוסטאט.
    הערה: ניתן לנקוט מדידות בכל נקודה בבנייה; עם זאת, הם נחוצים רק לפני בידוד ובמהלך הכנת קצה. טבלה 2 מפרטת טווחים אופייניים של עכבה לאחר כל שלב בנייה ב- 1 kHz עבור הפניית המשתמש.
  4. לשטוף את הסיבים במים deionized (DI) על ידי טבילתם לתוך קטנה שלוש פעמים ולהשאיר אותם להתייבש בטמפרטורת החדר.
    הערה: ניתן להשאיר מערכים באחסון עד שהמשתמש יוכל להמשיך לשלב הבא.

6. בידוד פארילן C

הערה: Parylene C נבחר כחומר הבידוד עבור סיבי הפחמן כפי שניתן להפקיד בטמפרטורת החדר על פני קבוצות של מערכים ומספק ציפוי קונפורמי מאוד.

  1. הסוך את מחבר מערך Flex באמצעות מחבר ההזדווגות.
  2. מקם אצווה של 8-12 מערכים לתוך תיבת אחסון עם פלטפורמת דבק מוגבהת, כך שהם יכולים להיות מבודדים בריצה אחת. הניחו את המערכים כך שקצה המחבר של המערך יהיה על פלטפורמת ההדבקה עם הקצה הסיבי של המערך (איור 6) כדי למנוע מהסיבים להידבק ולמשוך החוצה ולהבטיח ציפוי פארילן אחיד על הסיבים.
  3. מצופה את המערכים במערכת תצהיר Parylene C לעובי של 800 ננומטר בחדר נקי, לובש ציוד הגנה אישי מתאים (PPE) כפי שהוגדר על ידי חדר הניקוי הבודד בשימוש.
    הערה: כאן, PPE הוגדר כנעלי חדר נקי, חליפה, כיסוי ראש, משקפי מגן, מסכה וכפפות לטקס. יש לציין כי זהו PPE סטנדרטי לכניסה לחדר נקי. צעד זה יכול להיות במיקור חוץ לחברת ציפוי Parylene תמורת תשלום; עם זאת, ייתכן ששירות מסחרי יוכל לצפות מערכים נוספים בו-זמנית. לכל מערכת תצהיר של פארילן C עשויים להיות אמצעי זהירות שונים. יש ליצור קשר עם הטכנאי לפני השימוש כדי להבטיח את בטיחות המשתמש.
  4. הסר את מחבר ההזדווגות המשמש כמסיכה ממערך Flex.
  5. מקם את המערכים בתיבה חדשה לאחסון עד שיהיה מוכן לשימוש.

7. שיטות הכנת טיפים

הערה: שתי תכשירי קצה בסעיף זה משתמשים בלייזר כדי לחתוך סיבים. PPE תקין, כגון משקפי מגן עמידים לאורכי הגל המשמשים, תמיד צריך להיות משוחק בעת שימוש בלייזר, ומשתמשי מעבדה אחרים בקרבת הלייזר צריך להיות גם PPE. למרות שאורכי הסיבים המפורטים בשלבים אלה הם אורכים מומלצים, משתמשים עשויים לנסות כל אורך שמתאים לצרכים שלהם. המשתמש חייב לבחור אחת משיטות הכנת הטיפים הבאות כמו חיתוך מספריים לבד לא יספיק כדי לחשוף מחדש את electrode25.

  1. גארנט אלומיניום yttrium מסומם Neodymium (Nd:YAG) חיתוך לייזר
    1. חותכים את הסיבים ל 550 מיקרומטר עם מספריים כירורגיות.
    2. השתמש בלייזר 532nm Nd:YAG פעמו (5 mJ / דופק, 5 ns משך, 900 mW) כדי לחתוך 50 מיקרומטר מקצה הסיבים כדי לחשוף מחדש את הפחמן מתחת Parylene C (בדרך כלל לוקח 2-3 פולסים).
      1. יישר את קצות הסיבים באמצעות הסטריאוסקופ המובנה שמגיע עם מערכת לייזר זו.
        הערה: מערכת זו מאפשרת למשתמש ליישר חלון (כאן, 50 מיקרומטר x 20 מיקרומטר (גובה x רוחב)) שימש להקיף את קצה הסיבים.
      2. מקד את הסטריאוסקופ בקצה הסיבים בהגדלה של פי 500 לחיתוך מדויק ומדויק.
        הערה: Parylene C יתפוגג מעט (<10 מיקרומטר) מהקצה וישאיר קצה גלילי קהה.
  2. חידוד מבער25,26,27
    1. חותכים את הסיבים ל 300 מיקרומטר עם מספריים כירורגיים.
    2. שקועים את המערך בצלחת של מים deionized, מחבר בצד למטה, ומאובטח לתחתית המנה עם כמות קטנה של מרק.
    3. השתמש במצלמת עט כדי ליישר את הסיבים עם פני המים, כך הסיבים הם רק בקושי נוגעים פני השטח של המים.
    4. התאימו להבת מבער בוטאן ל-3-5 מ"מ והעבירו אותה על גבי הסיבים בתנועה קדימה ואחורה כדי לחדד סיבים.
      הערה: טיפים לסיבים יזהרו בכתום כשהלהבה תעבור מעליהם.
    5. הסר את המערך מהמרק ובדוק אותו תחת סטריאוסקופ לקבלת עצות מחודדות תחת הגדלה של פי 50.
      הערה: אם טיפים מחודדים נצפים, אז אין צורך מבער נוסף. אם העצות נראות בוטה, חזור על שלבים 7.2.2-7.2.5.
  3. חיתוך לייזר UV28
    הערה: לייזר UV יכול לשמש רק על אפס כוח הכנסה (ZIF) ועיצובי לוח רחב כרגע בשל נקודת המוקד הגדולה של לייזר UV בשימוש להיות גדול יותר מאשר המגרש של סיבי פחמן Flex Array.
    1. חותכים את סיבי הפחמן ל 1 מ"מ עם מספריים כירורגיים.
    2. הצמדת לייזר UV לשלושה שלבים ממונעים המוגדרים באורתוגונל.
      הערה: לייזר UV הוא מוליך למחצה אינדיום גליום ניטריד (InGaN) רב-מצבי עם הספק יציאה של 1.5 ואט ואורך גל של 405 ננומטר.
      1. ודא שללייזר יש קרן רציפה ליישור וחיתוך מהירים ויעילים.
    3. אבטחו את המערך במקום כדי לשמור על מישור אלקטרודות סטילס ברמה של אלקטרודות כדי שהלייזר יעבור. ודא שהמערך מוחזק במרחק מתאים מהלייזר כך שהסיבים יהיו קלים עם נקודת המוקד של הלייזר. כדי לעשות זאת, לספק כוח נמוך יותר לייזר ולהתאים את המרחק כדי להתמקד בצורה הטובה ביותר על סיבים28.
    4. הזז את נקודת המוקד לייזר UV על פני מישור הסיבים במהירות של 25 מיקרומטר לשנייה כדי לחתוך את הסיבים לאורך הרצוי (כאן, כל הסיבים נחתכים ל 500 מיקרומטר).
      הערה: סיבים יפלטו אור בהיר לפני חיתוך. לאחסן את הסיבים לאחר הטיפול עד שהם מוכנים להיות מצופים עם פולימר מוליך.

8. פולי (3,4-אתילנדיוקסיתופין) :p-טולואנסולפונט (PEDOT:pTS) ציפוי מוליך עבור עכבה מופחתת

  1. יש לערבב פתרונות של 0.01 M 3,4-ethylenedioxythiophene ו-0.1 M נתרן p-toluenesulfonate ב-50 מ"ל של מי DI ומערבבים למשך הלילה על צלחת ערבוב (כ-450 סל"ד) או עד שלא ניתן לראות חלקיקים בתמיסה.
    הערה: יש לאחסן את הפתרון במיכל עמיד באור. יש לשמור את הפתרון בקירור לאחר ערבוב כדי לשמור על הפתרון שמיש עד 30 יום.
  2. הפעל סריקת עכבה של 1 kHz באמצעות אותם פרמטרים כמו קודם (שלבים 5.2-5.3) ב- 1x PBS. שים לב אילו סיבים יש חיבור טוב (<1 MΩ, בדרך כלל 14-16 של 16 סיבים).
  3. אלקטרופלט עם PEDOT:pTS כדי להוריד את העכבה של האלקטרודות.
    1. שקוע את קצות הסיבים בתמיסת PEDOT:pTS.
    2. בצע את השלבים המפורטים בשלב 5.2, תוך החלפת פתרון 1x PBS עבור PEDOT:pTS וקצר את כל החיבורים ללוח לערוץ הנוכחי המוחל.
    3. יש למרוח 600 pA לכל סיבים טובים למשך 600 שניות באמצעות פוטנציוסטאט.
    4. כבה את התא ואפשר לו לנוח במשך 5 שניות בסוף הריצה.
  4. הסר את הסיבים מן הפתרון ולשטוף אותם במים DI.
  5. יש ליטול מחדש עכבה של 1 kHz כדי לבדוק שהסיבים היו מצופים בהצלחה (השתמש באותם פרמטרים המפורטים בשלבים 5.2-5.3).
    הערה: סיבים טובים מוגדרים כמו כל סיבים בעלי עכבה של פחות מ 110 kΩ.

9. חיבור חוטי קרקע והפניה

  1. לגרד בעדינות את פארילן C מהקרקע ולהתייחס דרך על הלוח באמצעות פינצטה. קצר את הקרקע ואת ההתייחסות דרך יחד בזוגות על עיצוב לוח זה.
    הערה: ניתן למצוא דרך קרקע והפניה ליד המחבר במערך Flex והם ארבעת עיגולי הזהב הקטנים ליד המחברים. משתמשים יצטרכו רק להסיר Parylene C מן vias הקרוב ביותר סיבי פחמן למדידות.
  2. חותכים שני אורכים 5 ס"מ של חוט כסף מבודד עם סכין גילוח. לנטרל את קצות החוטים 2-3 מ"מ מקצה אחד להיות מחובר למערך Flex ו ~ 10 מ"מ מהקצוות הנגדיים כדי לאפשר הארקה קלה יותר והפניה במהלך הניתוח.
  3. מחממים את מגהץ ההלחמה בחזרה ל 600 ° F. החל כמות קטנה של שטף על vias.
  4. הכנס חוט אחד (קצה חשוף של 2-3 מ"מ) לכל אחד מה- ePhys vias על הלוח. החל הלחמה על החלק העליון של vias (איור 7A). אפשרו לגשוש להתקרר, ואז הפכו אותו כדי למרוח כמות קטנה של הלחמה על החלק האחורי של ה-via (איור 7A).
  5. באמצעות מספריים כירורגיות, לגזור את כל חוט חשוף בולט מתוך תלולית ההלחמה האחורית כמו זה עוזר להפחית את הרעש שנראה בהקלטה (איור 7B).
  6. הנח את המערכים בחזרה לתיבת האחסון, כיפוף החוטים אחורה והרחק מהסיבים. אבטחו את החוטים בסרט הדבקה כדי למנוע אינטראקציות פוטנציאליות של חוטי סיבים (איור 7C).

10. הליך כירורגי

הערה: קליפת המוח חולדה שימשה כדי לבדוק את היעילות של סיבים מוכנים לייזר UV כפי שתואר בעבר 7,20. בדיקות אלה יעבדו בעצב בשל הגיאומטריה הדומה שלהם ורמות עכבה כדי מבער סיבים מוכנים. ניתוח זה בוצע בשפע של זהירות כדי לאמת כי לייזר UV לא שינה את התגובה של אלקטרודות.

  1. להרדים עכברוש לונג אוונס זכר בוגר באמצעות שילוב של קטמין (90 מ"ג/ק"ג) וקסילזין (10 מ"ג/ק"ג). אשר הרדמה עם בדיקת צביטת בוהן. יש למרוח משחה על העיניים כדי למנוע מעיני החולדה להתייבש במהלך הניתוח.
  2. צור גולגולת 2 מ"מ x 2 מ"מ מעל קליפת המוח המוטורית של חצי הכדור הימני. זהה את הפינה השמאלית התחתונה של הגולגולת על ידי מדידת 1 מ"מ קדמי של ברגמה ו 1 מ"מ לרוחב של קו האמצע.
  3. הר את המערך לתוך מכשיר סטריאוטקסי, ואפס את המכשיר הסטריאוטקסי בדוורה על ידי הנמכה עדינה של הסיבים עד שהם נוגעים בפני השטח של הדורה. הרימו את המערך הרחק מאתר הניתוח והעבירו אותו לצד עד שהוא מוכן להכנסה.
  4. לכרות את הדורה על ידי משיכה עדינה של מחט עם קצה תיל על פני השטח של הרקמה. ברגע שחלק מהדורה נפתח למוח, השתמש בזוג מלקחיים עדינים כדי לסייע עוד יותר בהרחקת הדורה.
  5. הכנס את הסיבים לתוך גולגולת ו 1.2 מ"מ לתוך המוח באמצעות מכשיר סטריאוטקסי, מוריד לאט ביד.
  6. הקלט נתוני ePhys למשך 10 דקות עם הבמה הספציפית ל- ePhys ומקדם הבמה.
    1. הגדר את מסנן המעבר הגבוה של preamplifier כך שיעבד את האות ב- 2.2 הרץ, אנטי-alias ב- 7.5 kHz ודגימה ב- 25 קילו-הרץ.
      הערה: עבור מדידות אלה, רק פעילות ספונטנית נרשמת. אין גירוי מוחל.
  7. המתת חסד
    1. מניחים את החולדה תחת איזופלוריין ב 5% מתחת 1 ליטר / דקה של חמצן עד סימני חיים הפסיקו (20-30 דקות). אשר המתת חסד עם עריפת ראש.

11. מיון ספייק

  1. השתמש בתוכנת מיון ספייק כדי למיין ולנתח את הנתונים באמצעות שיטות שדווחו בעבר8.
  2. השתמש במסנן בעל מעבר גבוה בכל הערוצים (פינת 250 הרץ, באטרוורת' מסדר רביעי ), והגדר את רמת הזיהוי של צורת הגל למינוס 3.5 × סף RMS.
    1. השתמש במודל גאוסי כדי לאגד קוצים עם מאפיינים דומים. שלב אשכולות ממוצעים של לפחות 10 צורות גל שייכללו בניתוח נוסף.
    2. ביטול או מחיקה של כל צורות הגל שאינן קוצים מערכת הנתונים.
  3. יצא נתונים לאחר מיון כל הערוצים והשתמש בתוכנת ניתוח כדי להתוות ולנתח עוד יותר את צורות הגל.

12. סריקת הדמיה מיקרוסקופית אלקטרונית (SEM)

הערה: שלב זה יהפוך מערכים לבלתי שמישים ויש להשתמש בהם רק כדי לבדוק את תוצאות הטיפול בעצות כדי לבדוק שהמערךים מעובדים כראוי. אין צורך לבצע שלב זה כדי לבנות מערך מוצלח. לסיכום להלן חלוקה לרמות כללית של תהליך SEM; עם זאת, משתמשים שלא השתמשו בעבר ב- SEM צריכים לקבל עזרה ממשתמש מיומן.

  1. חותכים את הקצה הסיבי של ה-PCB ומרכיבים אותו על ספח SEM עם מסיכת סרט פחמן. הנח את המערכים על פלטפורמה קטנה של סרט פחמן מוערם (4-5 שכבות) כדי למנוע מסיבי הפחמן להידבק לספח SEM.
  2. מקציפים את המערכים בזהב (100-300 Å) בעקבות הליכים שמתוארים על ידי היצרן של מעיל פולט הזהב.
  3. כדי לבדוק את השפעות הטיפול בקצה, דמיינו את המערכים ב-SEM במרחק עבודה של 15 מ"מ ועוצמת קרן 20 kV.
    הערה: ניתן לצלם מערכים ללא ציפוי מבעבע תחת ואקום נמוך, כפי שמוצג באיור 8D לסיבים בחיתוך לייזר UV. עבור התקנה זו, מומלץ להיות מרחק עבודה של 11-12 מ"מ וכוח קרן 4 kV.

תוצאות

אימות עצה: תמונות SEM
עבודה קודמת20 הראתה כי חיתוך מספריים הביא עכבה לא אמינה כמו Parylene C מקופל על פני אתר ההקלטה. חיתוך מספריים משמש כאן רק כדי לחתוך סיבים לאורך הרצוי לפני עיבוד עם שיטת חיתוך גימור נוספת. תמונות SEM של הטיפים שימשו לקביעת אורך הפחמן החשוף וגיאומטריית הק?...

Discussion

החלפת חומרים
בעוד שכל החומרים המשמשים מסוכמים בטבלת החומרים, מעט מאוד מהחומרים נדרשים להגיע מספקים ספציפיים. לוח מערך Flex חייב להגיע מהספק הרשום מכיוון שהם החברה היחידה שיכולה להדפיס את הלוח הגמיש. יש להזמין גם את מחבר מערך Flex מהספק המפורט מכיוון שהוא מחבר קנייני. פאריל...

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה כלכלית על ידי המכונים הלאומיים להפרעות נוירולוגיות ושבץ מוחי (UF1NS107659 ו- UF1NS115817) והקרן הלאומית למדע (1707316). המחברים מכירים בתמיכה כספית מהמכללה להנדסה של אוניברסיטת מישיגן ותמיכה טכנית ממרכז מישיגן לאפיון חומרים ומעבדת התואר הראשון של ואן ולאק. המחברים מודים לד"ר ח'ליל נג'אפי על השימוש בלייזר Nd:YAG ובמתקן Nanofabrication Lurie על השימוש במכונת התצהיר פארילן C שלהם. ברצוננו גם להודות למערכות ציפוי מיוחדות (אינדיאנפוליס, IN) על עזרתם במחקר השוואת הציפוי המסחרי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
3 prong clams05-769-6QFisherQty: 2
Unit Cost (USD): 20
3,4-ethylenedioxythiophene (25 g)
(PEDOT)		96618Sigma-AldrichQty: 1
Unit Cost (USD): 102
353ND-T Epoxy (8oz)++
(ZIF and Wide Board Only)		353ND-T/8OZEpoxy TechnologyQty: 1
Unit Cost (USD): 48
Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3)50-854-570FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 100
AutolabPGSTAT12Metrohm
Blowtorch1WG61GraingerQty: 1
Unit Cost (USD): 36
Carbon FibersT-650/35 3KCytec ThornelQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Carbon tapeNC1784521FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 27
Cotton Tipped ApplicatorWOD1002MediChoiceQty: 1
Unit Cost (USD): 0.57
Delayed Set Epoxy++1FBG8GraingerQty: 1
Unit Cost (USD): 3
DI Watern/an/aQty: n/a
Unit Cost (USD): n/a
Dumont Tweezers #550-822-409FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 73
Flex Array**n/aMicroConnexQty: 1
Unit Cost (USD): 68
FluxSMD291ST8CCDigiKeyQty: 1
Unit Cost (USD): 13
Glass Capillaries (pack of 350)50-821-986FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 60
Glass Dishn/an/aQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Hirose Connector
(ZIF Only)		H3859CT-NDDigiKeyQty: 2
Unit Cost (USD): 2
Light-resistant Glass Bottlen/aFisherQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Heating FilimentFB315BSutter Instrument CoQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Micropipette PullerP-97Sutter Instrument CoQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Nitrile Gloves (pack of 200)19-041-171CFisherQty: 1
Unit Cost (USD): 47
Offline Sorter softwaren/aPlexonQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Omnetics Connector*
(Flex Array Only)		A79025-001Omnetics IncQty: 1
Unit Cost (USD): 35
Omnetics Connector*
(Flex Array Only)		A79024-001Omnetics IncQty: 1
Unit Cost (USD): 35
Omnetics to ZIF connectorZCA-OMN16Tucker-Davis TechnologiesQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Pin Terminal Connector
(Wide Board Only)		ED11523-NDDigiKeyQty: 16
Unit Cost (USD): 10
Probe storage boxG2085MelmatQty: 1
Unit Cost (USD): 2
Razor Blade4A807GraingerQty: 1
Unit Cost (USD): 2
SEM post16327lnfQty: 1
Unit Cost (USD): 3
Silver Epoxy (1oz)++H20E/1OZEpoxy TechnologyQty: 1
Unit Cost (USD): 125
Silver GND REF wires50-822-122FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 423.2
Sodium p-toulenesulphonate(pTS)- 100g152536Sigma-AldrichQty: 1
Unit Cost (USD): 59
Solder24-6337-9703DigiKeyQty: 1
Unit Cost (USD): 60
Soldering Iron TipT0054449899N-NDDigikeyQty: 1
Unit Cost (USD): 13
Soldering StationWD1002N-NDDigikeyQty: 1
Unit Cost (USD): 374
SpotCure-B UV LED Cure Systemn/aFusionNet LLCQty: 1
Unit Cost (USD): 895
Stainless steel rodn/an/aQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Stir Platen/aFisherQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Surgical Scissors08-953-1BFisherQty: 1
Unit Cost (USD): 100
TDT Shroud
(ZIF Only)		Z3_ZC16SHRD_RSNTDTQty: 1
Unit Cost (USD): 3.5
Teflon Tweezers50-380-043FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 47
UV & Visible Light Safety Glassees92522LoctiteQty: 1
Unit Cost (USD): 45
UV Epoxy (8oz)++
(Flex Array Only)		OG142-87/8OZEpoxy TechnologyQty: 1
Unit Cost (USD): 83
UV Lasern/aWERQty: 1
Unit Cost (USD): 30
Weigh boat
(pack of 500)		08-732-112FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 58
Wide Board+n/aAdvanced CircuitsQty: 1
Unit Cost (USD): 3
ZIF Active HeadstageZC16Tucker-Davis TechnologiesQty: 1
Unit Cost (USD): 925
ZIF Passive HeadstageZC16-PTucker-Davis TechnologiesQty: 1
Unit Cost (USD): 625
ZIF*n/aCoast to Coast CircuitsQty: 1
Unit Cost (USD): 9

References

  1. Szostak, K. M., Grand, L., Constandinou, T. G. Neural interfaces for intracortical recording: Requirements, fabrication methods, and characteristics. Frontiers in Neuroscience. 11, 665 (2017).
  2. Cunningham, J. P., et al. A closed-loop human simulator for investigating the role of feedback control in brain-machine interfaces. Journal of Neurophysiology. 105 (4), 1932-1949 (2011).
  3. Yoshida, K., Bertram, M. J., Hunter Cox, T. G., Riso, R. R., Horch, K., Kipke, D. Peripheral nerve recording electrodes and techniques. Neuroprosthetics: Theory and Practice. , 377-466 (2017).
  4. Dweiri, Y. M., Stone, M. A., Tyler, D. J., McCallum, G. A., Durand, D. M. Fabrication of high contact-density, flat-interface nerve electrodes for recording and stimulation applications. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (116), e54388 (2016).
  5. Kim, H., et al. Cuff and sieve electrode (CASE): The combination of neural electrodes for bi-directional peripheral nerve interfacing. Journal of Neuroscience Methods. 336, 108602 (2020).
  6. Ciancio, A. L., et al. Control of prosthetic hands via the peripheral nervous system. Frontiers in Neuroscience. 10, 116 (2016).
  7. Jiman, A. A., et al. Multi-channel intraneural vagus nerve recordings with a novel high-density carbon fiber microelectrode array. Scientific Reports. 10 (1), 15501 (2020).
  8. Welle, E. J., et al. Sharpened and mechanically robust carbon fiber electrode arrays for neural interfacing. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 29, 993-1003 (2021).
  9. Moffitt, M. A., McIntyre, C. C. Model-based analysis of cortical recording with silicon microelectrodes. Clinical Neurophysiology. 116 (9), 2240-2250 (2005).
  10. Nerve-cuff electrodes. Micro-Leads Neuro Available from: https://www.microleadsneuro.com/research-products/?jumpto=nerve-cuff (2021)
  11. Mortimer, J. T., et al. Perspectives on new electrode technology for stimulating peripheral nerves with implantable motor prostheses. IEEE Transactions on Rehabilitation Engineering. 3 (2), 145-154 (1995).
  12. Boretius, T., et al. A transverse intrafascicular multichannel electrode (TIME) to interface with the peripheral nerve. Biosensors & Bioelectronics. 26 (1), 62-69 (2010).
  13. Grill, W. M., Norman, S. E., Bellamkonda, R. V. Implanted neural interfaces biochallenges and engineered solutions. Annual Review of Biomedical Engineering. 11, 1-24 (2009).
  14. Larson, C. E., Meng, E. A review for the peripheral nerve interface designer. Journal of Neuroscience Methods. 332, 108523 (2020).
  15. Christensen, M. B., et al. The foreign body response to the Utah Slant Electrode Array in the cat sciatic nerve. Acta Biomaterialia. 10 (11), 4650-4660 (2014).
  16. Patel, P. R., et al. Chronic in vivo stability assessment of carbon fiber microelectrode arrays. Journal of Neural Engineering. 13 (6), 066002 (2016).
  17. Yoshida Kozai, T. D., et al. Ultrasmall implantable composite microelectrodes with bioactive surfaces for chronic neural interfaces. Nature Materials. 11 (12), 1065-1073 (2012).
  18. Saito, N., et al. Application of carbon fibers to biomaterials: A new era of nano-level control of carbon fibers after 30-years of development. Chemical Society Reviews. 40 (7), 3824-3834 (2011).
  19. Welle, E. J., et al. Fabrication and characterization of a carbon fiber peripheral nerve electrode appropriate for chronic recording. FASEB Journal. 34 (1), 1 (2020).
  20. Guitchounts, G., Cox, D. 64-Channel carbon fiber electrode arrays for chronic electrophysiology. Scientific Reports. 10 (1), 3830 (2020).
  21. Patel, P. R., et al. High density carbon fiber arrays for chronic electrophysiology, fast scan cyclic voltammetry, and correlative anatomy. Journal of Neural Engineering. 17 (5), 056029 (2020).
  22. Massey, T. L., et al. Open-source automated system for assembling a high-density microwire neural recording array. 2016 International Conference on Manipulation, Automation and Robotics at Small Scales (MARSS). , 1-7 (2016).
  23. Schwerdt, H. N., et al. Subcellular probes for neurochemical recording from multiple brain sites. Lab Chip. 17, 1104-1115 (2017).
  24. Welle, E. J., et al. Ultra-small carbon fiber electrode recording site optimization and improved in vivo chronic recording yield. Journal of Neural Engineering. 17 (2), 026037 (2020).
  25. Guitchounts, G., Markowitz, J. E., Liberti, W. A., Gardner, T. J. A carbon-fiber electrode array for long-term neural recording. Journal of Neural Engineering. 10 (4), 046016 (2013).
  26. Gillis, W. F., et al. Carbon fiber on polyimide ultra-microelectrodes. Journal of Neural Engineering. 15 (1), 016010 (2018).
  27. Dong, T., Chen, L., Shih, A. Laser sharpening of carbon fiber microelectrode arrays for brain recording. Journal of Micro and Nano-Manufacturing. 8 (4), 041013 (2020).
  28. Massey, T. L., et al. A high-density carbon fiber neural recording array technology. Journal of Neural Engineering. 16 (1), 016024 (2019).
  29. Romeni, S., Valle, G., Mazzoni, A., Micera, S. Tutorial: a computational framework for the design and optimization of peripheral neural interfaces. Nature Protocols. 15 (10), 3129-3153 (2020).
  30. Khani, H., Wipf, D. O. Fabrication of tip-protected polymer-coated carbon-fiber ultramicroelectrodes and pH ultramicroelectrodes. Journal of The Electrochemical Society. 166 (8), 673-679 (2019).
  31. El-Giar, E. E. D. M., Wipf, D. O. Preparation of tip-protected poly(oxyphenylene) coated carbon-fiber ultramicroelectrodes. Electroanalysis. 18 (23), 2281-2289 (2006).
  32. Venkatraman, S., et al. In vitro and in vivo evaluation of PEDOT microelectrodes for neural stimulation and recording. IEEE Transactions on Neural Systems and Rehabilitation Engineering. 19 (3), 307-316 (2011).
  33. Petrossians, A., et al. Electrodeposition and Characterization of Thin-Film Platinum-Iridium Alloys for Biological Interfaces. Journal of the Electrochemical Society. 158 (6), 269-276 (2011).
  34. Lee, C. D., Hudak, E. M., Whalen, J. J., Petrossians, A., Weiland, J. D. Low-impedance, high surface area Pt-Ir electrodeposited on cochlear implant electrodes. Journal of The Electrochemical Society. 165 (12), 3015-3017 (2018).
  35. Cassar, I. R., et al. Electrodeposited platinum-iridium coating improves in vivo recording performance of chronically implanted microelectrode arrays. Biomaterials. 205, 120-132 (2019).
  36. Taylor, I. M., et al. Enhanced dopamine detection sensitivity by PEDOT/graphene oxide coating on in vivo carbon fiber electrodes. Biosensors and Bioelectronics. 89, 400-410 (2017).
  37. Mohanaraj, S., et al. Gold nanoparticle modified carbon fiber microelectrodes for enhanced neurochemical detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (147), e59552 (2019).
  38. Pusch, J., Wohlmann, B. Chapter 2 - Carbon fibers. Inorganic and composite fibers. Production, properties, and applications. , 31-51 (2019).
  39. Budai, D., Hernádi, I., Mészáros, B., Bali, Z. K., Gulya, K. Electrochemical responses of carbon fiber microelectrodes to dopamine in vitro and in vivo. Acta Biologica Szegediensis. 54 (2), 155-160 (2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

176

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved