مجموعة أدوات مفتوحة المصدر: مصفوفة الأقطاب الكهربائية الدقيقة من ألياف الكربون على الطاولة للتسجيل العصبي

Summary

هنا ، نصف منهجية التصنيع لمصفوفات أقطاب ألياف الكربون القابلة للتخصيص للتسجيل في الجسم الحي في الأعصاب والدماغ.

Abstract

يتم تصنيع مجسات الأعصاب الطرفية التقليدية في المقام الأول في غرف الأبحاث ، مما يتطلب استخدام العديد من الأدوات باهظة الثمن والمتخصصة للغاية. تقدم هذه الورقة عملية تصنيع "خفيفة" في غرف الأبحاث لمصفوفات الأقطاب الكهربائية العصبية المصنوعة من ألياف الكربون والتي يمكن تعلمها بسرعة من قبل مستخدم غرف الأبحاث عديم الخبرة. تتطلب عملية تصنيع مصفوفة قطب ألياف الكربون هذه أداة واحدة فقط في غرف الأبحاث ، وهي آلة ترسيب الباريلين C ، التي يمكن تعلمها بسرعة أو الاستعانة بمصادر خارجية إلى منشأة معالجة تجارية بتكلفة هامشية. تتضمن عملية التصنيع هذه أيضا لوحات الدوائر المطبوعة التي تملأ يدويا ، والعزل ، وتحسين الأطراف.

تؤدي تحسينات الأطراف الثلاثة المختلفة التي تم استكشافها هنا (ليزر Nd: YAG وموقد اللحام وليزر الأشعة فوق البنفسجية) إلى مجموعة من هندسات الطرف ومعاوقات 1 كيلو هرتز ، مع ألياف مشعلة تؤدي إلى أقل معاوقة. في حين أثبتت التجارب السابقة فعالية قطب الليزر وموقد اللحام ، تظهر هذه الورقة أيضا أن الألياف المقطوعة بالليزر بالأشعة فوق البنفسجية يمكنها تسجيل الإشارات العصبية في الجسم الحي. صفائف ألياف الكربون الحالية إما لا تحتوي على أقطاب كهربائية مخصصة لصالح الحزم أو تتطلب أدلة مصنعة في غرف الأبحاث للسكان والعزل. تستخدم المصفوفات المقترحة فقط الأدوات التي يمكن استخدامها على سطح الطاولة لسكان الألياف. تسمح عملية تصنيع مصفوفة الأقطاب الكهربائية المصنوعة من ألياف الكربون هذه بالتخصيص السريع لتصنيع الصفيف السائب بسعر مخفض مقارنة بالمجسات المتاحة تجاريا.

Introduction

يعتمد الكثير من أبحاث علم الأعصاب على تسجيل الإشارات العصبية باستخدام الفيزيولوجيا الكهربية (ePhys). هذه الإشارات العصبية ضرورية لفهم وظائف الشبكات العصبية والعلاجات الطبية الجديدة مثل آلة الدماغ والواجهات العصبية الطرفية1،²،³،^4،5،6. تتطلب الأبحاث المحيطة بالأعصاب الطرفية أقطاب تسجيل عصبية مخصصة أو متاحة تجاريا. تتطلب أقطاب التسجيل العصبية - وهي أدوات فريدة ذات أبعاد على نطاق ميكرون ومواد هشة - مجموعة متخصصة من المهارات والمعدات لتصنيعها. وقد وضعت مجموعة متنوعة من المجسات المتخصصة لاستخدامات نهائية محددة؛ ومع ذلك ، فإن هذا يعني أنه يجب تصميم التجارب حول المجسات التجارية المتاحة حاليا ، أو يجب على المختبر الاستثمار في تطوير مسبار متخصص ، وهي عملية طويلة. نظرا للتنوع الواسع في الأبحاث العصبية في الأعصاب الطرفية ، هناك طلب كبير على مسبار ePhys متعدد ^{الاستخدامات4}،^7،8. وسيضم مسبار ePhys المثالي موقعا صغيرا للتسجيل، ومقاومة ^{منخفضة9}، ونقطة سعر واقعية ماليا للتنفيذ في ^{النظام3}.

تميل الأقطاب الكهربائية التجارية الحالية إما إلى أن تكون أقطاب كهربائية خارج العصبون أو الكفة (Neural ^Cuff10 ، MicroProbes Nerve Cuff ^Electrode11) ، والتي تقع خارج العصب ، أو داخل اللفافة ، التي تخترق العصب وتجلس داخل اللفافة محل الاهتمام. ومع ذلك ، نظرا لأن أقطاب الكفة تجلس بعيدا عن الألياف ، فإنها تلتقط المزيد من الضوضاء من العضلات القريبة والكراسات الأخرى التي قد لا تكون الهدف. تميل هذه المجسات أيضا إلى انقباض العصب ، مما قد يؤدي إلى الحشف الحيوي - تراكم الخلايا الدبقية والأنسجة الندبية - في واجهة القطب الكهربائي أثناء شفاء الأنسجة. تضيف الأقطاب الكهربائية داخل اللفافة (مثل LIFE12 و ^TIME13 و Utah Arrays14) ميزة انتقائية الكراسة ولها نسب إشارة إلى ضوضاء جيدة ، وهو أمر مهم في تمييز الإشارات لتفاعل الآلات. ومع ذلك ، فإن هذه المجسات لديها مشاكل في التوافق الحيوي ، حيث تصبح الأعصاب مشوهة بمرور ^الوقت3،^15،16. عند شرائها تجاريا ، يكون لكل من هذه المجسات تصميمات ثابتة مع عدم وجود خيار للتخصيص الخاص بالتجربة وهي مكلفة للمختبرات الأحدث.

استجابة لقضايا التكلفة العالية والتوافق الحيوي التي تقدمها المجسات الأخرى ، قد توفر أقطاب ألياف الكربون وسيلة لمختبرات علم الأعصاب لبناء مجسات خاصة بها دون الحاجة إلى معدات متخصصة. ألياف الكربون هي مادة تسجيل بديلة ذات عامل شكل صغير يسمح بإدخال منخفض الضرر. توفر ألياف الكربون توافقا حيويا أفضل واستجابة ندبة أقل بكثير من ^{السيليكون17}،^18،19 بدون معالجة غرف الأبحاث المكثفة5،^13،14. ألياف الكربون مرنة ومتينة ومدمجة بسهولة مع المواد الحيوية ^{الأخرى19}، ويمكن أن تخترق وتسجل من ^{الأعصاب7,20}. على الرغم من المزايا العديدة لألياف الكربون ، تجد العديد من المختبرات أن التصنيع اليدوي لهذه المصفوفات شاق. تجمع بعض ^{المجموعات21} ألياف الكربون في حزم تؤدي مجتمعة إلى قطر أكبر (~ 200 ميكرومتر) ؛ ومع ذلك ، على حد علمنا ، لم يتم التحقق من هذه الحزم في الأعصاب. قام آخرون بتصنيع صفائف أقطاب ألياف الكربون الخاصة بهم ، على الرغم من أن أساليبهم تتطلب أدلة ألياف الكربون المصنعة في غرف الأبحاث ^22،23،24 والمعدات اللازمة لملء صفائفهم17،^23،24. لمعالجة هذا ، نقترح طريقة لتصنيع مصفوفة من ألياف الكربون يمكن إجراؤها على سطح المختبر تسمح بإجراء تعديلات مرتجلة. تحافظ المجموعة الناتجة على أطراف القطب الكهربائي الفردية دون أدوات متخصصة لتعبئة الألياف. بالإضافة إلى ذلك ، يتم تقديم أشكال هندسية متعددة لتتناسب مع احتياجات التجربة البحثية. بناء على العمل ^{السابق8}،^17،22،^{25 ،} توفر هذه الورقة منهجيات مفصلة لبناء وتعديل عدة أنماط من المصفوفات يدويا مع الحد الأدنى من وقت التدريب في غرف الأبحاث اللازمة.

Protocol

تمت الموافقة على جميع الإجراءات الحيوانية من قبل لجنة جامعة ميشيغان المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها.

1. اختيار مجموعة من ألياف الكربون

1. اختر لوحة دوائر مطبوعة (PCB) من أحد التصميمات الثلاثة الموضحة في الشكل 1.
   ملاحظة: بالنسبة لهذا البروتوكول، ستكون المصفوفات المرنة هي محور التركيز.
   1. ارجع إلى تصاميم ثنائي الفينيل متعدد الكلور على موقع Chestek Lab على الويب (https://chestekresearch.engin.umich.edu) ، مجانا وجاهزا للإرسال إلى مطبعة PCB وطلبها للطباعة من خلالها.
   2. راجع الجدول 1 للحصول على ملخص للموصلات لكل لوحة ومواصفاتها للمساعدة في اختيار الموصل الذي سيعمل مع الإعداد التجريبي المحدد.

2. لحام الموصل إلى لوحة الدوائر

1. اضبط مكواة لحام على 315 درجة مئوية (600 درجة فهرنهايت).
2. تطبيق التدفق على جميع منصات لحام على ثنائي الفينيل متعدد الكلور.
   ملاحظة: يمكن ضغط التدفق داخل الأنبوب عبر الفوط ، بينما يمكن تطبيق التدفق في وعاء مع الطرف الخشبي لقضيب ذو رأس قطني عن طريق تلطيخ التدفق عبر جميع الفوط بحرية.
3. شكل تلال صغيرة من اللحام على الوسادات الخلفية للمصفوفة المرنة (الشكل 2A).
4. قم بلحام الصف السفلي من دبابيس الموصل بالصف الخلفي من منصات اللحام (الشكل 2B).
   ملاحظة: تم تصميم جميع تصميمات الألواح التي يوفرها مختبر Chestek بحيث يتم إقران الموصلات بدقة مع اللوحة المخصصة لها.
   1. للقيام بذلك ، قم بلحام المسامير الموجودة على جانبي الموصل مع سهولة الوصول إلى تلال اللحام. بمجرد تأمينه ، ادفع طرف حديد اللحام برفق بين المسامير الأمامية لحام الوصلات المتبقية في الخلف.
      ملاحظة: بمجرد تأمين الصف الخلفي من الدبابيس، ستتم محاذاة بقية الموصل مع كل دبوس أعلى لوحة اللحام المعينة له.
5. قم بلحام الصف الأمامي من المسامير على اللوحة عن طريق تطبيق كمية صغيرة من اللحام على كل دبوس. ضع طبقة إضافية من التدفق إذا لم يحدث اللحام بسرعة.
   1. نظف التدفق الزائد باستخدام كحول الأيزوبروبيل 100٪ (IPA) وفرشاة ذات شعيرات قصيرة.
6. قم بتغليف التوصيلات الملحومة في مجموعة إيبوكسي متأخرة (الشكل 2 C ، D) باستخدام إبرة 23 G ومحقنة 1 مل موضوعة على جانب مشطوف لأسفل على المسامير. ادفع الإيبوكسي عبر المحقنة ببطء بحيث يتدفق إلى وعلى طول الاتصالات.
   1. اترك اللوحة بين عشية وضحاها حتى يتمكن الإيبوكسي المتأخر من العلاج.
      ملاحظة: في حين أن إدراج المنتج للإيبوكسي المتأخر ينص على أنه يشفى في غضون 30 دقيقة، فإن تركه بين عشية وضحاها يسمح بتكوين اتصال أكثر استقرارا.
7. قم بتأمين الجانب الخلفي من اللوحة على جانبي الموصل عن طريق وضع خط صغير من الإيبوكسي المتأخر عبر الجانب الخلفي من اللوحة وسحبه على حواف الموصل.
   1. اترك اللوحة للعلاج بين عشية وضحاها مرة أخرى.
      ملاحظة: في هذه المرحلة، إما تخزين المصفوفات أو متابعة الإنشاء. في حالة التوقف المؤقت في البنية ، قم بتخزين المصفوفات في صندوق نظيف وجاف في درجة حرارة الغرفة.

3. سكان الألياف

1. قم بقص شعرية زجاجية مسحوبة بحيث يتناسب طرفها بين آثار الصفيف (الشكل 3A).
   1. باستخدام مجتذب الزجاج والخيوط ، اصنع الشعيرات الدموية باستخدام الإعدادات التالية: الحرارة = 900 ، السحب = 70 ، السرعة = 35 ، الوقت = 200 ، الضغط = 900.
      ملاحظة: الأرقام غير موحدة ومحددة لهذا الجهاز (انظر جدول المواد).
2. استخدم الأطراف الخشبية لاثنين من أدوات القضيب ذات الرؤوس القطنية (واحد لكل جزء من الإيبوكسي الفضي) لأخذ نسبة صغيرة من الإيبوكسي الفضي بنسبة ~ 1: 1 في طبق بلاستيكي واخلطها باستخدام نفس العصي المستخدمة في المغرفة. تخلص من أدوات التطبيق بعد الخلط.
3. قم بقطع 2-4 مم من نهاية حزمة ألياف الكربون على قطعة من ورق الطابعة باستخدام شفرة حلاقة. لفصل الألياف الموجودة في الحزمة بسهولة ، والتي يصعب فصلها عن بعضها البعض ، اسحب قطعة ورق مغلفة بلطف فوق الجزء العلوي من الحزمة.
   ملاحظة: تنقل قطعة الورق الرقائقية الثابتة إلى الألياف ، والتي ستفصل من تلقاء نفسها.
4. ضع الإيبوكسي الفضي بين كل زوج آخر من الآثار على جانب واحد من اللوحة باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية (الشكل 3B).
   1. خذ قطرة صغيرة من الإيبوكسي على نهاية الشعيرات الدموية المسحوبة. ضع بلطف بين كل أثر آخر على نهاية اللوحة ، واملأ الفجوة.
      ملاحظة: يجب ملء الفجوة إلى أعلى الأثرين دون أن تفيض للمس الآثار المجاورة. يتم توصيل كل تتبع بقناة واحدة. هذه الطريقة في تعداد الايبوكسي تعني أن كل ألياف سيكون لها قناتان متصلتان بها. وذلك لأن اثنين من الآثار تسمح بمحاذاة الألياف بشكل أفضل ، ويساعد التكرار في القناة على ضمان الاتصال الكهربائي.
5. استخدم ملاقط مغلفة بالتفلون لوضع ألياف كربون واحدة في كل أثر من آثار الإيبوكسي (الشكل 3C).
6. استخدم شعيرة شعرية نظيفة مسحوبة لضبط ألياف الكربون ، بحيث تكون عمودية على نهاية لوحة Flex Array ومدفونة تحت الإيبوكسي (الشكل 3D).
7. ضع المصفوفات على كتلة خشبية ذات نهايات ليفية متدلية على حافة الكتلة.
   ملاحظة: سيحافظ وزن الواجهة الخلفية على الصفيف على الكتلة.
8. تخبز الكتلة الخشبية والمصفوفات على حرارة 140 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة لعلاج الإيبوكسي الفضي وقفل الألياف في مكانها.
9. كرر الخطوات من 3.4 إلى 3.8 للجانب الآخر من اللوحة.
   ملاحظة: يمكن تخزين المصفوفات بعد أي خطوة خبز. ومع ذلك ، قد يتسبب الثبات من صناديق التخزين في سحب الألياف بعيدا عن اللوحة إذا تم تطبيق القليل جدا من الإيبوكسي الفضي عند ملء اللوحة.
   1. قم بإنشاء منصة لاصقة مرتفعة داخل صندوق بحيث يمكن لصق الجزء الأكبر من اللوحة بالمادة اللاصقة مما يسمح بتعليق الأطراف الليفية لللوح داخل الصندوق لمنع كسر الألياف. يخزن في درجة حرارة الغرفة.
      ملاحظة: إذا انسحبت الألياف بعيدا عن اللوحة أثناء التخزين ، فقم بكشط الإيبوكسي من الآثار باستخدام شعيرات شعرية زجاجية نظيفة مسحوبة وكرر الخطوات 3.1-3.8 لاستبدال الألياف. من هذه النقطة فصاعدا ، يجب تخزين المصفوفات مع تعليق الألياف بهذه الطريقة لمنع كسر الألياف.

4. تطبيق الأشعة فوق البنفسجية (UV) الايبوكسي لعزل ألياف الكربون

1. استخدم شعيرة شعرية نظيفة وقم بتطبيق قطرة صغيرة (قطرها ~ 0.5 مم من الإيبوكسي فوق البنفسجي على الآثار المكشوفة على جانب واحد من اللوحة (الشكل 4A). استمر في إضافة قطرات الايبوكسي فوق البنفسجية حتى يتم تغطية الآثار بالكامل.
   ملاحظة: لا تسمح للإيبوكسي بالأشعة فوق البنفسجية بالحصول على ألياف الكربون بعد نهاية ثنائي الفينيل متعدد الكلور لضمان الإدخال السلس لاحقا.
2. علاج الايبوكسي الأشعة فوق البنفسجية تحت ضوء قلم الأشعة فوق البنفسجية لمدة 2 دقيقة (الشكل 4B).
3. كرر الخطوات من 4.1 إلى 4.2 للجانب الآخر من اللوحة.
4. قطع الألياف إلى 1 مم باستخدام شبكة ستيروسكوب ومقص جراحي.
   ملاحظة: يمكن تخزين المصفوفات في هذه المرحلة حتى تصبح جاهزة للمتابعة إلى الخطوات التالية. يجب تخزينها في صندوق من شأنه أن يرفع ألياف الكربون بعيدا عن الصندوق نفسه. يمكن تخزين المصفوفات في درجة حرارة الغرفة إلى أجل غير مسمى.

5. التحقق من التوصيلات الكهربائية باستخدام عمليات مسح مقاومة 1 كيلو هرتز (الشكل 5)

1. غمر ألياف الكربون 1 مم في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
2. لإكمال الدائرة ، استخدم كلوريد الفضة والفضة (Ag| AgCl) القطب المرجعي وقضيب الفولاذ المقاوم للصدأ (القطب المضاد).
   1. باستخدام مشبك دورق ، قم بتعليق Ag| قطب AgCl في PBS 1x وتوصيله بمرجع نظام المعاوقة المستخدم.
   2. باستخدام مشبك دورق ، قم بتعليق قضيب الفولاذ المقاوم للصدأ في 1x PBS وقم بالاتصال بإدخال القطب المضاد لنظام المعاوقة المستخدم.
3. قم بإجراء مسح ضوئي للمعاوقة بسرعة 1 كيلو هرتز لكل ألياف باستخدام جهد جهد كهربائي تم ضبطه على تردد مسح ضوئي 1 كيلو هرتز عند 0.01 _Vrms في شكل موجة جيبية واحدة. اضبط الجهد على 0 فولت في بداية كل فحص لمدة 5 ثوان لتثبيت الإشارة المسجلة. سجل القياسات عبر البرنامج المرتبط ب potentiostat.
   ملاحظة: يمكن إجراء القياسات في أي مرحلة من مراحل البناء. ومع ذلك ، فهي ضرورية فقط قبل العزل وأثناء إعداد الطرف. يسرد الجدول 2 نطاقات نموذجية من المعاوقات بعد كل خطوة إنشاء عند 1 كيلو هرتز للرجوع إليها من قبل المستخدم.
4. اشطف الألياف في ماء منزوع الأيونات (DI) عن طريق غمسها في كوب صغير ثلاث مرات واتركها لتجف في درجة حرارة الغرفة.
   ملاحظة: يمكن ترك المصفوفات في التخزين حتى يتمكن المستخدم من المتابعة إلى الخطوة التالية.

6. عزل الباريلين C

ملاحظة: تم اختيار الباريلين C كمادة عازلة لألياف الكربون حيث يمكن ترسيبه في درجة حرارة الغرفة على دفعات من المصفوفات ويوفر طبقة مطابقة للغاية.

1. قم بإخفاء موصل الصفيف المرن باستخدام موصل التزاوج.
2. ضع مجموعة من 8-12 صفائف في صندوق تخزين مع منصة لاصقة مرتفعة بحيث يمكن عزلها في تشغيل واحد. ضع المصفوفات بحيث يكون طرف الموصل للصفيف على المنصة اللاصقة مع الطرف الليفي للصفيف المتدلي (الشكل 6) لمنع الألياف من الالتصاق بالمادة اللاصقة وسحبها ولضمان طلاء باريلين موحد على الألياف.
3. قم بتغطية المصفوفات في نظام ترسيب Parylene C بسماكة 800 نانومتر في غرفة الأبحاث ، مرتديا معدات الحماية الشخصية المناسبة (PPE) على النحو المحدد في غرفة الأبحاث الفردية المستخدمة.
   ملاحظة: هنا ، تم تعريف معدات الوقاية الشخصية على أنها أحذية غرف الأبحاث ، والبدلة ، وغطاء الرأس ، والنظارات الواقية ، والقناع ، وقفازات اللاتكس. تجدر الإشارة إلى أن هذا هو معدات الوقاية الشخصية القياسية لدخول غرفة الأبحاث. يمكن الاستعانة بمصادر خارجية لهذه الخطوة لشركة طلاء باريلين مقابل رسوم. ومع ذلك ، قد تكون الخدمة التجارية قادرة على تغطية المزيد من المصفوفات في وقت واحد. قد يكون لكل نظام ترسيب باريلين C احتياطات سلامة مختلفة. اتصل بالفني قبل الاستخدام لضمان سلامة المستخدم.
4. قم بإزالة موصل التزاوج المستخدم كقناع من الصفيف المرن.
5. ضع المصفوفات في صندوق جديد للتخزين حتى تصبح جاهزة للاستخدام.

7. طرق إعداد تلميح

ملاحظة: يستخدم اثنان من مستحضرات الطرف في هذا القسم الليزر لقطع الألياف. يجب دائما ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة ، مثل النظارات الواقية المقاومة للأطوال الموجية المستخدمة ، عند استخدام الليزر ، ويجب أن يكون مستخدمو المختبر الآخرون بالقرب من الليزر أيضا في معدات الوقاية الشخصية. على الرغم من أن أطوال الألياف المدرجة في هذه الخطوات هي أطوال موصى بها ، يمكن للمستخدمين تجربة أي طول يناسب احتياجاتهم. يجب على المستخدم اختيار إحدى طرق إعداد الطرف التالية لأن القطع بالمقص وحده لن يكفي لإعادة فضح القطب ^{الكهربائي25}.

1. النيوديميوم المنشط إيتريوم العقيق الألومنيوم (Nd: YAG) قطع الليزر
   1. قطع الألياف إلى 550 ميكرومتر باستخدام مقص جراحي.
   2. استخدم ليزر نبضي 532nm Nd: YAG (5 mJ / pulse ، مدة 5 نانو ثانية ، 900 mW) لقطع 50 ميكرومتر من طرف الألياف لإعادة تعريض الكربون تحت Parylene C (عادة ما يأخذ 2-3 نبضات).
      1. قم بمحاذاة أطراف الألياف باستخدام المنظار المجسم المدمج الذي يأتي مع نظام الليزر هذا.
         ملاحظة: يسمح هذا النظام للمستخدم بمحاذاة نافذة (هنا ، تم استخدام 50 ميكرومتر × 20 ميكرومتر (الارتفاع × العرض)) لتشمل نهاية الألياف.
      2. ركز المنظار المجسم على نهاية الألياف عند التكبير بمعدل 500 مرة للحصول على قطع دقيق ودقيق.
         ملاحظة: سوف يزول الباريلين C قليلا (<10 ميكرومتر) من الطرف تاركا طرفا أسطوانيا حادا.
2. موقد اللحام25,26,27
   1. قطع الألياف إلى 300 ميكرومتر باستخدام مقص جراحي.
   2. اغمر الصفيف في طبق من الماء منزوع الأيونات ، وجانب الموصل لأسفل ، وتثبيته في الجزء السفلي من الطبق بكمية صغيرة من المعجون.
   3. استخدم كاميرا قلم لمحاذاة الألياف مع سطح الماء بحيث لا تلمس الألياف سطح الماء إلا بالكاد.
   4. اضبط لهب موقد لحام البوتان إلى 3-5 مم وقم بتشغيله فوق الجزء العلوي من الألياف في حركة ذهابا وإيابا لشحذ الألياف.
      ملاحظة: سوف تتوهج أطراف الألياف باللون البرتقالي عندما يمر اللهب فوقها.
   5. قم بإزالة الصفيف من المعجون وافحصه تحت منظار مجسم بحثا عن أطراف مدببة تحت تكبير 50x.
      ملاحظة: إذا لوحظت نصائح مدببة ، فلن تكون هناك حاجة إلى مزيد من اللحام. إذا ظهرت التلميحات حادة، فكرر الخطوات 7.2.2-7.2.5.
3. قطع الأشعة فوق ^{البنفسجية28}
   ملاحظة: لا يمكن استخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية إلا في تصميمات قوة الإدخال الصفرية (ZIF) واللوحة الواسعة في الوقت الحالي نظرا لأن النقطة البؤرية الكبيرة لليزر فوق البنفسجي المستخدم أكبر من درجة ألياف الكربون في مصفوفة فليكس.
   1. قطع ألياف الكربون إلى 1 ملم مع مقص جراحي.
   2. قم بلصق ليزر الأشعة فوق البنفسجية على ثلاث مراحل آلية متعامدة التكوين.
      ملاحظة: الليزر فوق البنفسجي هو أشباه موصلات متعددة الأوضاع من نيتريد الغاليوم الإنديوم (InGaN) بقوة خرج 1.5 واط وطول موجي 405 نانومتر.
      1. تأكد من أن الليزر لديه شعاع مستمر للمحاذاة والقطع بسرعة وفعالية.
   3. قم بتأمين الصفيف في مكانه للحفاظ على مستوى ثابت من الأقطاب الكهربائية ليمر الليزر فوقه. تأكد من الاحتفاظ بالمصفوفة على مسافة مناسبة من الليزر بحيث تكون الألياف في ضوء مع النقطة البؤرية لليزر. للقيام بذلك ، قم بتوفير طاقة أقل لليزر واضبط المسافة لأفضل تركيز على ^{الألياف28}.
   4. حرك النقطة البؤرية لليزر فوق البنفسجي عبر مستوى الألياف بسرعة 25 ميكرومتر / ثانية لقطع الألياف إلى الطول المطلوب (هنا ، يتم قطع جميع الألياف إلى 500 ميكرومتر).
      ملاحظة: سوف تنبعث الألياف من ضوء ساطع قبل قطعها. تخزين الألياف بعد العلاج حتى تصبح جاهزة للطلاء مع البوليمر الموصل.

8. بولي (3،4-إيثيلين ديوكسي ثيوفين):p-تولوين سلفونات (PEDOT: pTS) طلاء موصل لانخفاض المعاوقة

1. امزج محاليل 0.01 M 3,4-ethylenedioxythiophene و 0.1 M صوديوم p-toluenesulfonate في 50 مل من ماء DI وحرك بين عشية وضحاها على صفيحة تحريك (~ 450 دورة في الدقيقة) أو حتى لا يمكن ملاحظة أي جسيمات في المحلول.
   ملاحظة: قم بتخزين المحلول في حاوية مقاومة للضوء. ضعي المحلول في الثلاجة بعد الخلط للحفاظ على المحلول قابلا للاستخدام لمدة تصل إلى 30 يوما.
2. قم بتشغيل فحص معاوقة 1 كيلو هرتز باستخدام نفس المعلمات كما كان من قبل (الخطوات 5.2-5.3) في 1x PBS. لاحظ الألياف التي لها اتصال جيد (<1 MΩ ، عادة 14-16 من 16 ألياف).
3. لوحة كهربائية مع PEDOT: pTS لخفض مقاومة الأقطاب الكهربائية.
   1. غمر نصائح الألياف في محلول PEDOT: pTS.
   2. اتبع الخطوات الموضحة في الخطوة 5.2 ، وقم بتبديل حل PBS 1x ل PEDOT: pTS واختصار جميع الاتصالات باللوحة إلى القناة الحالية المطبقة.
   3. تطبيق 600 pA لكل ألياف جيدة لمدة 600 ثانية باستخدام potentiostat.
   4. قم بإيقاف تشغيل الخلية واتركها ترتاح لمدة 5 ثوان في نهاية التشغيل.
4. قم بإزالة الألياف من المحلول وشطفها في ماء DI.
5. أعد استخدام معاوقات 1 كيلو هرتز للتحقق من أن الألياف قد تم طلاؤها بنجاح (استخدم نفس المعلمات المدرجة في الخطوات 5.2-5.3).
   ملاحظة: يتم تعيين الألياف الجيدة على أنها أي ألياف لها مقاومة أقل من 110 kΩ.

9. توصيل الأسلاك الأرضية والمرجعية

1. قم بكشط الباريلين C بلطف من الأرض والرجوع إلى اللوحات باستخدام ملاقط. اختصار الأرض و vias المرجع معا في أزواج على هذا التصميم اللوحة.
   ملاحظة: يمكن العثور على الأرضية والأرضية والمرجعية بالقرب من الموصل الموجود في صفيف Flex وهي الدوائر الذهبية الأربعة الصغيرة بالقرب من الموصلات. سيحتاج المستخدمون فقط إلى إزالة الباريلين C من المنافذ الأقرب إلى ألياف الكربون لإجراء القياسات.
2. قطع اثنين من طول 5 سم من الأسلاك الفضية المعزولة مع شفرة الحلاقة. قم بفصل نهايات الأسلاك 2-3 مم من أحد طرفيها ليتم توصيلها بمصفوفة Flex و ~ 10 مم من الأطراف المقابلة للسماح بسهولة التأريض والرجوع أثناء الجراحة.
3. سخني مكواة اللحام مرة أخرى إلى 600 درجة فهرنهايت. ضع كمية صغيرة من التدفق على الفياس.
4. أدخل سلكا واحدا (نهاية مكشوفة 2-3 مم) في كل من مداخل ePhys على اللوحة. ضع اللحام على الجزء العلوي من الحواف (الشكل 7A). اترك المسبار يبرد ، ثم اقلبه لتطبيق كمية صغيرة من اللحام على الجانب الخلفي من العبور (الشكل 7A).
5. باستخدام المقص الجراحي ، قم بقص أي سلك مكشوف يخرج من تل اللحام الخلفي لأن هذا يساعد على تقليل الضوضاء التي تظهر في التسجيل (الشكل 7B).
6. ضع المصفوفات مرة أخرى في صندوق التخزين ، مع ثني الأسلاك للخلف وبعيدا عن الألياف. قم بتأمين الأسلاك الموجودة على الشريط اللاصق لمنع التفاعلات المحتملة بين أسلاك الألياف (الشكل 7C).

10. الإجراء الجراحي

ملاحظة: تم استخدام قشرة الفئران لاختبار فعالية الألياف المحضرة بالليزر فوق البنفسجي كما تم وصفها ^{سابقا7,20}. ستعمل هذه المجسات في العصب بسبب هندستها المتشابهة ومستويات معاوقتها للألياف المعدة لموقد اللحام. تم إجراء هذه الجراحة بحذر شديد للتحقق من أن ليزر الأشعة فوق البنفسجية لم يغير استجابة الأقطاب الكهربائية.

1. تخدير ذكر الفئران لونغ إيفانز البالغ باستخدام مزيج من الكيتامين (90 ملغم / كغ) و xylazine (10 ملغ / كغ). تأكيد التخدير مع اختبار قرصة إصبع القدم. ضع مرهما على العينين لمنع عيون الفئران من الجفاف أثناء الجراحة.
2. قم بإنشاء بضع القحف 2 مم × 2 مم فوق القشرة الحركية لنصف الكرة الأيمن. حدد الزاوية السفلية اليسرى من بضع القحف عن طريق قياس 1 مم أمامي من بريجما و 1 مم جانبي من خط الوسط.
3. قم بتركيب الصفيف في أداة مجسمة ، وقم بتصفير الأداة المجسمة في الجافية عن طريق خفض الألياف بلطف حتى تلمس سطح الجافية. ارفع الصفيف بعيدا عن موقع الجراحة وانقله إلى الجانب حتى يصبح جاهزا للإدخال.
4. استئصال الجافية عن طريق سحب إبرة بلطف مع نهاية شائكة على سطح الأنسجة. بمجرد فتح جزء من الجافية للدماغ ، استخدم زوجا من الملقط الناعم للمساعدة بشكل أكبر في سحب الجافية.
5. أدخل الألياف في بضع القحف و 1.2 مم في الدماغ باستخدام أداة مجسمة ، مع خفضها ببطء باليد.
6. سجل بيانات ePhys لمدة 10 دقائق باستخدام مضخم صوت ومكبر صوت خاص ب ePhys.
   1. اضبط مرشح التمرير العالي لمضخم الصوت المسبق لمعالجة الإشارة عند 2.2 هرتز، والأضلاع عند 7.5 كيلو هرتز، والعينة عند 25 كيلو هرتز.
      ملاحظة: بالنسبة لهذه القياسات، يتم تسجيل النشاط التلقائي فقط. لا يتم تطبيق أي حافز.
7. القتل الرحيم
   1. ضع الفئران تحت الأيزوفلوران بنسبة 5٪ تحت 1 لتر / دقيقة من الأكسجين حتى تتوقف علامات الحياة (20-30 دقيقة). تأكيد القتل الرحيم مع قطع الرأس.

11. فرز سبايك

1. استخدم برنامج فرز السنبلة لفرز البيانات وتحليلها باستخدام الطرق التي تم الإبلاغ عنها ^مسبقا8.
2. استخدم مرشحا عالي التمرير على جميع القنوات (زاوية 250 هرتز ، Butterworth ^{من الدرجة} الرابعة) ، واضبط مستوى اكتشاف الشكل الموجي على -3.5 × عتبة RMS.
   1. استخدم نموذجا غاوسي للتجمع والمسامير ذات الخصائص المماثلة. الجمع بين مجموعات من 10 أشكال موجية على الأقل ومتوسطها لتضمينها في مزيد من التحليل.
   2. قم بإزالة أو حذف جميع الأشكال الموجية التي ليست طفرات من مجموعة البيانات.
3. تصدير البيانات بمجرد فرز جميع القنوات واستخدام برامج التحليل لرسم الأشكال الموجية وتحليلها بشكل أكبر.

12. التصوير المجهري الإلكتروني الماسح (SEM)

ملاحظة: ستجعل هذه الخطوة المصفوفات غير قابلة للاستخدام ويجب استخدامها فقط لفحص نتائج معالجة التلميحات للتحقق من معالجة المصفوفات بشكل صحيح. لا يلزم القيام بهذه الخطوة لإنشاء صفيف ناجح. ويرد أدناه موجز عام لعملية إدارة مصائد الأسماك؛ ومع ذلك ، يجب أن يتلقى المستخدمون الذين لم يستخدموا SEM سابقا مساعدة من مستخدم مدرب.

1. قص الطرف الليفي من ثنائي الفينيل متعدد الكلور وتثبيته على كعب SEM مقنع بشريط كربوني. ضع المصفوفات على منصة صغيرة من شريط الكربون المكدس (4-5 طبقات) لمنع ألياف الكربون من الالتصاق بكعب SEM.
2. قم بتغطية المصفوفات بالذهب (100-300 Å) باتباع الإجراءات التي حددتها الشركة المصنعة لمعطف الثرثرة الذهبية.
3. لفحص تأثيرات معالجة الطرف ، قم بتصوير المصفوفات في SEM على مسافة عمل تبلغ 15 مم وقوة شعاع 20 كيلو فولت.
   ملاحظة: يمكن تصوير المصفوفات بدون طلاء بالرذاذ تحت فراغ منخفض، كما هو موضح في الشكل 8D للألياف المقطوعة بالليزر بالأشعة فوق البنفسجية. بالنسبة لهذا الإعداد ، يوصى بمسافة عمل تتراوح بين 11 و 12 مم وقوة شعاع 4 كيلو فولت.

النتائج

التحقق من صحة النصيحة: صور SEM
أظهر العمل ^{السابق20} أن القطع بالمقص أدى إلى معاوقات غير موثوقة حيث تم طي الباريلين C عبر موقع التسجيل. يستخدم القطع المقصي هنا فقط لقطع الألياف إلى الطول المطلوب قبل المعالجة باستخدام طريقة قطع نهائية إضافية. تم استخدام صور SEM للأطراف لتح?...

Discussion

بدائل المواد
وفي حين أن جميع المواد المستخدمة ملخصة في جدول المواد، فإن عددا قليلا جدا من المواد مطلوب أن يأتي من بائعين محددين. يجب أن تأتي لوحة Flex Array من البائع المدرج لأنها الشركة الوحيدة التي يمكنها طباعة اللوحة المرنة. يجب أيضا طلب موصل Flex Array من المورد المدرج لأنه م...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 prong clams	05-769-6Q	Fisher	Qty: 2 Unit Cost (USD): 20
3,4-ethylenedioxythiophene (25 g) (PEDOT)	96618	Sigma-Aldrich	Qty: 1 Unit Cost (USD): 102
353ND-T Epoxy (8oz)++ (ZIF and Wide Board Only)	353ND-T/8OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 48
Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3)	50-854-570	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 100
Autolab	PGSTAT12	Metrohm
Blowtorch	1WG61	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 36
Carbon Fibers	T-650/35 3K	Cytec Thornel	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Carbon tape	NC1784521	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 27
Cotton Tipped Applicator	WOD1002	MediChoice	Qty: 1 Unit Cost (USD): 0.57
Delayed Set Epoxy++	1FBG8	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
DI Water	n/a	n/a	Qty: n/a Unit Cost (USD): n/a
Dumont Tweezers #5	50-822-409	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 73
Flex Array**	n/a	MicroConnex	Qty: 1 Unit Cost (USD): 68
Flux	SMD291ST8CC	DigiKey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 13
Glass Capillaries (pack of 350)	50-821-986	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 60
Glass Dish	n/a	n/a	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Hirose Connector (ZIF Only)	H3859CT-ND	DigiKey	Qty: 2 Unit Cost (USD): 2
Light-resistant Glass Bottle	n/a	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Heating Filiment	FB315B	Sutter Instrument Co	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Puller	P-97	Sutter Instrument Co	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Nitrile Gloves (pack of 200)	19-041-171C	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 47
Offline Sorter software	n/a	Plexon	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Omnetics Connector* (Flex Array Only)	A79025-001	Omnetics Inc	Qty: 1 Unit Cost (USD): 35
Omnetics Connector* (Flex Array Only)	A79024-001	Omnetics Inc	Qty: 1 Unit Cost (USD): 35
Omnetics to ZIF connector	ZCA-OMN16	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Pin Terminal Connector (Wide Board Only)	ED11523-ND	DigiKey	Qty: 16 Unit Cost (USD): 10
Probe storage box	G2085	Melmat	Qty: 1 Unit Cost (USD): 2
Razor Blade	4A807	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 2
SEM post	16327	lnf	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
Silver Epoxy (1oz)++	H20E/1OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 125
Silver GND REF wires	50-822-122	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 423.2
Sodium p-toulenesulphonate(pTS)- 100g	152536	Sigma-Aldrich	Qty: 1 Unit Cost (USD): 59
Solder	24-6337-9703	DigiKey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 60
Soldering Iron Tip	T0054449899N-ND	Digikey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 13
Soldering Station	WD1002N-ND	Digikey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 374
SpotCure-B UV LED Cure System	n/a	FusionNet LLC	Qty: 1 Unit Cost (USD): 895
Stainless steel rod	n/a	n/a	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Stir Plate	n/a	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Surgical Scissors	08-953-1B	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 100
TDT Shroud (ZIF Only)	Z3_ZC16SHRD_RSN	TDT	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3.5
Teflon Tweezers	50-380-043	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 47
UV & Visible Light Safety Glassees	92522	Loctite	Qty: 1 Unit Cost (USD): 45
UV Epoxy (8oz)++ (Flex Array Only)	OG142-87/8OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 83
UV Laser	n/a	WER	Qty: 1 Unit Cost (USD): 30
Weigh boat (pack of 500)	08-732-112	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 58
Wide Board+	n/a	Advanced Circuits	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
ZIF Active Headstage	ZC16	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): 925
ZIF Passive Headstage	ZC16-P	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): 625
ZIF*	n/a	Coast to Coast Circuits	Qty: 1 Unit Cost (USD): 9