Açık Kaynaklı Araç Seti: Sinir Kaydı için Tezgah Üstü Karbon Fiber Mikroelektoğr Dizisi

Özet

Burada, sinir ve beyinde in vivo kayıt için özelleştirilebilir karbon fiber elektrot dizileri için imalat metodolojisi açıklanmaktadır.

Özet

Geleneksel periferik sinir probları öncelikle birden fazla pahalı ve son derece özel aletlerin kullanılmasını gerektiren temiz bir odada üretilir. Bu makale, deneyimsiz bir temiz oda kullanıcısı tarafından hızlı bir şekilde öğrenilebilen karbon fiber nöral elektrot dizilerinin temiz bir oda "hafif" üretim sürecini sunun. Bu karbon fiber elektrot dizisi imalat işlemi, marjinal maliyetle ticari bir işleme tesisine hızlı veya dış kaynaklı olarak öğrenilebilen sadece bir temiz oda aracı, bir Parylene C biriktirme makinesi gerektirir. Bu imalat işlemi aynı zamanda el doldurma baskılı devre kartları, yalıtım ve uç optimizasyonu içerir.

Burada keşfedilen üç farklı uç optimizasyonu (Nd:YAG lazer, blowtorch ve UV lazer), bir dizi uç geometrisi ve 1 kHz empedans ile sonuçlanır ve üflemeli lifler en düşük empedansla sonuçlanır. Önceki deneyler lazer ve üflemeli elektrot etkinliğini kanıtlamış olsa da, bu makale ayrıca UV lazer kesim liflerinin nöral sinyalleri vivo olarak kaydedebileceğini göstermektedir. Mevcut karbon fiber dizileri ya demetler lehine bölünmemiş elektrotlara sahip değildir ya da popülasyon ve yalıtım için temiz oda fabrikasyon kılavuzları gerektirir. Önerilen diziler yalnızca fiber popülasyonu için bir tezgahta kullanılabilecek araçlar kullanır. Bu karbon fiber elektrot dizisi imalat işlemi, toplu dizi imalatının ticari olarak mevcut problara kıyasla daha düşük bir fiyata hızlı bir şekilde özelleştirilmesini sağlar.

Giriş

Nörobilim araştırmalarının çoğu elektrofizyoloji (ePhys) kullanarak sinir sinyallerinin kaydedilmelerine dayanır. Bu sinir sinyalleri, sinir ağlarının işlevlerini ve beyin makinesi ve periferik sinir arayüzleri gibi yeni tıbbi tedavileri anlamak için çok önemlidir1,2,3,4,5,6. Periferik sinirleri çevreleyen araştırmalar, özel yapım veya ticari olarak kullanılabilen nöral kayıt elektrotları gerektirir. Mikron ölçekli boyutlara ve kırılgan malzemelere sahip nöral kayıt elektrotlarına özgü aletler, imal etmek için özel bir beceri ve ekipman seti gerektirir. Belirli son kullanımlar için çeşitli özel problar geliştirilmiştir; ancak bu, deneylerin şu anda mevcut ticari problar etrafında tasarlanması veya bir laboratuvarın uzun bir süreç olan özel bir prob geliştirilmesine yatırım yapması gerektiği anlamına gelir. Periferik sinirdeki çok çeşitli sinir araştırmaları nedeniyle, çok yönlü bir ePhys probuna yüksek talep vardır4,7,8. İdeal bir ePhys probu, küçük bir kayıt sitesi, düşük empedans9 ve bir sistemde uygulama için finansal olarak gerçekçi bir fiyat ^{noktasına sahiptir3}.

Mevcut ticari elektrotlar, sinirin dışında oturan extraneural veya manşet elektrotları (Nöral ^Manşet10, MicroProbes Sinir Manşet ^Elektrodi11) veya sinire nüfuz eden ve ilgi alanı içinde oturan intrafassiküler olma eğilimindedir. Bununla birlikte, manşet elektrotları liflerden daha uzakta oturdukça, yakındaki kaslardan ve hedef olmayabilecek diğer fasiküllerden daha fazla gürültü alırlar. Bu problar aynı zamanda siniri daraltma eğilimindedir, bu da doku iyileşirken glial hücrelerin ve skar dokusunun elektrot arayüzünde biyofouling-birikmesine yol açabilir. İntrafastiküler elektrotlar (^LIFE12, ^TIME13 ve Utah Arrays14 gibi) fasikül seçiciliğinin faydasını ekler ve makine araları için sinyalleri ayırt etmede önemli olan iyi sinyal-gürültü oranlarına sahiptir. Bununla birlikte, bu probların biyouyumlulukla ilgili sorunları vardır ve sinirler zamanla deforme hale gelir3,15,16. Ticari olarak satın alındığında, her iki prob da deneye özgü özelleştirme seçeneği olmayan statik tasarımlara sahiptir ve daha yeni laboratuvarlar için maliyetlidir.

Diğer problar tarafından sunulan yüksek maliyet ve biyouyumluluk sorunlarına yanıt olarak, karbon fiber elektrotlar nörobilim laboratuvarlarının özel ekipmana ihtiyaç duymadan kendi problarını oluşturmaları için bir yol sunabilir. Karbon fiberler, düşük hasar yerleştirilmesine izin veren küçük bir form faktörüne sahip alternatif bir kayıt malzemesidir. Karbon fiberler, yoğun temiz oda işlemesi olmadan ^{silikon17,18,19'dan} daha iyi biyouyumbilite ve önemli ölçüde daha düşük skar tepkisi sağlar5,13,14. Karbon fiberler esnek, dayanıklı, diğer biyomalzemelerle kolayca entegre ^edilebilir19 ve sinirden nüfuz edebilir ve ^{kaydedebilir7,20}. Karbon fiberlerin birçok avantajına rağmen, birçok laboratuvar bu dizilerin manuel imalatını zorlu buluyor. Bazı ^gruplar21 karbon fiberleri toplu olarak daha büyük (~200 μm) bir çapa neden olan demetler halinde birleştirir; ancak, bizim bilgimize göre, bu demetler sinir olarak doğrulanmamıştır. Diğerleri, yöntemleri temiz oda fabrikasyon karbon fiber ^{kılavuzları22,23,24} ve dizilerini doldurmak için ekipman gerektirse de, kendi dizilerini doldurmak için individüated karbon fiber elektrot dizileri üretmiştir17,23,24. Bunu ele almak için, laboratuvar tezgahında gerçekleştirilebilecek ve doğaçlama değişikliklere izin veren bir karbon fiber dizisi imal etme yöntemi öneriyoruz. Elde edilen dizi, özel fiber doldurma araçları olmadan bölünmemiş elektrot uçlarını korur. Ayrıca, araştırma deneyinin ihtiyaçlarına uygun olarak birden fazla geometri sunulmaktadır. Önceki çalışmalardan 8,17,22,25 inşa eden bu makale, gerekli minimum temiz oda eğitim süresi ile çeşitli dizi stillerini manuel olarak oluşturmak ve değiştirmek için ayrıntılı metodolojiler sağlar.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Michigan Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi tarafından onaylandı.

1. Karbon fiber dizi seçimi

1. Şekil 1'de gösterilen üç tasarımdan birinden basılı bir devre kartı (PCB) seçin.
   NOT: Bu protokol için Flex Arrays odak noktası olacaktır.
   1. Chestek Lab web sitesindeki (https://chestekresearch.engin.umich.edu) PCB tasarımlarına ücretsiz olarak bakın ve bir PCB baskı evi aracılığıyla baskı için gönderilmeye ve siparişe hazır olun.
   2. Belirli deneysel kurulum için çalışacak bağlayıcıyı seçmenize yardımcı olmak için her pano için bağlayıcıların ve bunların belirtimlerinin bir özeti için Tablo 1'e bakın.

2. Konektörün devre kartına lehimlenerek

1. Bir lehim demirini 315 °C'ye (600 °F) ayarlayın.
2. PCB'deki tüm lehim pedlerine akı uygulayın.
   NOT: Bir tüp içindeki akı pedler boyunca sıkılabilirken, bir tenceredeki akı, akıyı tüm pedlere liberal olarak bulaştırarak pamuk uçlu bir aplikatörnün ahşap ucuyla uygulanabilir.
3. Flex Dizisinin arka pedlerinde küçük lehim höyükleri oluşturur (Şekil 2A).
4. Konnektör pimlerinin alt sırasını lehim pedlerinin arka sırasına lehimle (Şekil 2B).
   NOT: Chestek laboratuvarı tarafından sağlanan tüm kart tasarımları, konektörlerin belirlenen tahtalarla tam olarak eşleşeceği şekilde tasarlanmıştır.
   1. Bunu yapmak için, konektörün her iki tarafındaki pimleri lehim höyüklerine kolay erişimle lehimleyin. Güvenli hale döndükten sonra, arkadaki kalan bağlantıları lehimlemek için lehim demir ucunu ön pimler arasına hafifçe itin.
      NOT: Pimlerin arka satırı güvenli hale yüklendikten sonra, konektörün geri kalanı atanan lehim pedi üzerindeki her pim ile hizalanır.
5. Her pime az miktarda lehim uygulayarak ön pim sırasını tahtaya lehimler. Lehimleme hızlı bir şekilde gerçekleşmezse ek bir akı tabakası uygulayın.
   1. Fazla akıyı% 100 izopropil alkol (IPA) ve kısa bir kıl fırçası ile temizleyin.
6. Lehimli bağlantıları, pimlerin üzerine 23 G iğne ve 1 mL şırınga yerleştirilmiş şırınga kullanarak gecikmeli set epoksi (Şekil 2 C,D) ile kapsülle. Epoksiyi şırınnadan yavaşça geçirin, böylece bağlantılara ve bağlantılar boyunca akar.
   1. Tahtayı gece boyunca bırakın, böylece gecikmiş set epoksi tedavi edebilir.
      NOT: Gecikmeli set epoksisi için ürün kesici ucu 30 dakika içinde iyileştirdiğini belirtirken, bir gecede bırakılması daha kararlı bir bağlantı oluşmasını sağlar.
7. Tahtanın arka tarafına küçük bir gecikmeli set epoksi hattı döşeyerek ve bunu konektörün kenarlarına çekerek kartın arka tarafını konektörün kenarlarına sabitleyin.
   1. Tahtayı bir gecede tedaviye bırakın.
      NOT: Bu noktada, dizileri depolayın veya yapıya devam edin. Yapıda duraklatıyorsanız, dizileri oda sıcaklığında temiz ve kuru bir kutuda saklayın.

3. Lif popülasyonu

1. Ucu dizinin izleri arasına sığacak şekilde çekilmiş bir cam kılcal damar kesin (Şekil 3A).
   1. Cam çekme ve filament kullanarak aşağıdaki ayarları kullanarak kılcal damarlar yapın: Isı = 900, Çekme = 70, Hız = 35, Zaman = 200, Basınç = 900.
      NOT: Sayılar birikmez ve bu cihaza özgüdir ( Bkz. Malzeme Tablosu).
2. Plastik bir tabakta küçük, ~1:1 gümüş epoksi oranını kepçek ve kepçe için kullanılan çubukları kullanarak karıştırmak için iki pamuk uçlu aplikatörün ahşap uçlarını (gümüş epoksinin her bir parçası başına bir tane) kullanın. Karıştırdıktan sonra aplikatörleri atın.
3. Karbon fiber demetinin ucundan jilet kullanarak bir yazıcı kağıdı parçasına 2-4 mm kesin. Demetteki, birbirinden ayrılması zor olan lifleri kolayca ayırmak için, lamine bir kağıt parçasını demetin üstüne hafifçe çekin.
   NOT: Lamine kağıt parçası, statikleri liflere aktarır ve bu da kendiliğinden ayrılır.
4. Cam kılcal damar ile tahtanın bir tarafına diğer tüm iz çiftleri arasına gümüş epoksi uygulayın (Şekil 3B).
   1. Çekilen bir kılcal damarın ucuna küçük bir damla epoksi alın. Tahtanın ucundaki diğer tüm izler arasında yavaşça uygulayın ve boşluğu doldurun.
      NOT: Boşluk, komşu izlere dokunmak için taşmadan iki izlemenin üstüne doldurulmalıdır. Her izleme bir kanala bağlıdır. Bu epoksi popülasyonu yöntemi, her lifin ona bağlı iki kanala sahip olacağı anlamına gelir. Bunun nedeni, iki izlemenin daha iyi fiber hizalamaya izin vermesi ve kanaldaki artıklığın elektrik bağlantısının sağlanmasına yardımcı olmasıdır.
5. Her epoksi izine bir karbon fiber yerleştirmek için Teflon kaplı cımbız kullanın (Şekil 3C).
6. Karbon fiberleri ayarlamak için temiz çekilmiş bir kılcal damar kullanın, böylece Flex Array panosunun sonuna diktirler ve epoksinin altına gömülüdürler (Şekil 3D).
7. Dizileri, bloğun kenarına sarkan fiber uçlu ahşap bir bloğa yerleştirin.
   NOT: Arka ucun ağırlığı diziyi blokta tutacaktır.
8. Gümüş epoksiyi iyileştirmek ve lifleri yerine kilitlemek için ahşap bloğu ve dizileri 140 °C'de 20 dakika pişirin.
9. Panonun diğer tarafı için 3.4-3.8 adımlarını yineleyin.
   NOT: Diziler herhangi bir pişirme adımından sonra saklanabilir; ancak, depolama kutularından gelen statik, kartı doldururken çok az gümüş epoksi uygulanırsa liflerin tahtadan çekilmesine neden olabilir.
   1. Bir kutunun içinde yükseltilmiş bir yapışkan platformu oluşturun, böylece kartın büyük kısmı yapışkana yapışabilir ve fiber kırılmasını önlemek için kartın fiber uçlarının kutunun içinde askıya alınmasına izin verin. Oda sıcaklığında saklayın.
      NOT: Lifler depolama sırasında tahtadan çekilirse, epoksiyi temiz çekilmiş bir cam kılcal damarla izlerden kazıyın ve lifleri değiştirmek için 3.1-3.8 adımlarını tekrarlayın. Bu noktadan sonra, lif kırılmasını önlemek için diziler bu şekilde askıya alınmış liflerle saklanmalıdır.

4. Karbon fiberleri yalıtmak için ultra mor (UV) epoksi uygulamak

1. Temiz bir kılcal damar kullanın ve tahtanın bir tarafındaki açıkta kalan izlere küçük bir damlacık (~0,5 mm çapında UV epoksi) uygulayın (Şekil 4A). İzler tamamen kapatılana kadar UV epoksi damlacıkları eklemeye devam edin.
   NOT: UV epoksisinin pcb'nin ucundan geçen karbon fiberlere geçmesine izin vermeyin.
2. UV epoksisini UV kalem ışığı altında 2 dakika boyunca tedavi ettinin (Şekil 4B).
3. Panonun diğer tarafı için 4.1-4.2 adımlarını yineleyin.
4. Stereoskop retikül ve cerrahi makas kullanarak lifleri 1 mm'ye kesin.
   NOT: Diziler, sonraki adımlara devam etmeye hazır olana kadar bu noktada depolanabilir. Karbon fiberleri kutunun kendisinden uzaklaştıracak bir kutuda saklanmalıdırlar. Diziler süresiz olarak oda sıcaklığında saklanabilir.

5. 1 kHz empedans taramaları ile elektrik bağlantılarının kontrol edilmesi (Şekil 5)

1. Karbon liflerini 1 mm'lik fosfat tamponlu saline (PBS) batırın.
2. Devreyi tamamlamak için gümüş-gümüş klorür (Ag| AgCl) referans elektrodu ve paslanmaz çelik çubuk (karşı elektrot).
   1. Beher kelepçesi kullanarak Ag| 1x PBS'deki AgCl elektrot ve kullanılan empedans sisteminin referansı ile bağlayın.
   2. Bir beher kelepçesi kullanarak, paslanmaz çelik çubuğu 1x PBS'de askıya alın ve kullanılan empedans sisteminin karşı elektrot girişine bağlanın.
3. Tek bir sinüs dalga hızında 0,01 _Vrms'de 1 kHz tarama frekansı olarak ayarlanmış bir potentiostat kullanarak her fiber için 1 kHz empedans taraması çalıştırın. Kaydedilen sinyali stabilize etmek için her taramanın başında 5 sn için potentiostat'ı 0 V olarak ayarlayın. Ölçümleri potentiostat ile ilişkili yazılım aracılığıyla kaydedin.
   NOT: Ölçümler yapının herhangi bir noktasında yapılabilir; ancak, sadece yalıtımdan önce ve uç hazırlama sırasında gereklidirler. Tablo 2 , kullanıcının başvurusu için her yapı adımından sonra tipik empedans aralıklarını 1 kHz olarak listeler.
4. Lifleri üç kez küçük bir kabın içine batırarak deiyonize (DI) suda durulayın ve oda sıcaklığında kurumaya bırakın.
   NOT: Kullanıcı bir sonraki adıma geçinene kadar diziler depoda bırakılabilir.

6. Parylene C İzolasyonu

NOT: Parylene C, oda sıcaklığında diziler üzerinde biriktirilebildiği ve son derece konformel bir kaplama sağladığı için karbon fiberler için yalıtım malzemesi olarak seçilmiştir.

1. Çiftleşme bağlayıcısını kullanarak Flex Array bağlayıcısını maskele.
2. 8-12 diziden oluşan bir toplu işlemi, tek bir çalıştırmada yalıtılabilmeleri için yükseltilmiş yapışkan platformlu bir depolama kutusuna yerleştirin. Dizileri, dizinin bağlayıcı ucunun, liflerin yapıştırıcıya yapışmasını ve çekilmesini önlemek ve lifler üzerinde düzgün bir Parylene kaplaması sağlamak için dizinin fiberli ucu çıkıntılı yapışkan platformda olacak şekilde yerleştirin (Şekil 6).
3. Parylene C biriktirme sistemindeki dizileri, kullanılan bireysel temiz oda tarafından tanımlandığı şekilde uygun kişisel koruma ekipmanı (KKD) giyerek temiz bir odada 800 nm kalınlığa kadar kapla.
   NOT: Burada KKD temiz oda ayakkabıları, takım elbise, baş örtüsü, gözlük, maske ve lateks eldiven olarak tanımlanmıştır. Bunun temiz bir odaya girmek için standart KKD olduğu belirtilmelidir. Bu adım bir Ücret karşılığında bir Parylene kaplama şirketine dış kaynaklı olabilir; ancak, ticari bir hizmet aynı anda daha fazla diziyi kaplayabilir. Her Parylene C biriktirme sistemi farklı güvenlik önlemlerine sahip olabilir. Kullanıcı güvenliğini sağlamak için kullanmadan önce teknisyene başvurun.
4. Maske olarak kullanılan çiftleşme bağlayıcısını Flex Array'den çıkarın.
5. Dizileri kullanıma hazır olana kadar depolama için yeni bir kutuya yerleştirin.

7. Uç hazırlama yöntemleri

NOT: Bu bölümdeki iki uç hazırlığı lifleri kesmek için lazer kullanır. Kullanılan dalga boylarına dayanıklı gözlükler gibi uygun KKD, lazer kullanılırken her zaman giyilmeli ve lazerin çevresindeki diğer laboratuvar kullanıcıları da KKD'de olmalıdır. Bu adımlarda listelenen fiber uzunlukları önerilen uzunluklar olsa da, kullanıcılar ihtiyaçlarına uygun herhangi bir uzunluğu deneyebilirler. Tek başına makas kesimi ^elektrot25'i yeniden açığa çıkarmak için yeterli olmayacağından, kullanıcı aşağıdaki uç hazırlama yöntemlerinden birini seçmelidir.

1. Neodimyum kubbeli iyttrium alüminyum garnet (Nd:YAG) lazer kesim
   1. Lifleri cerrahi makasla 550 μm'ye kesin.
   2. Parylene C'nin altındaki karbonun yeniden açığa çıkması için liflerin ucundan 50 μm kesmek için 532nm Nd:YAG darbeli lazer (5 mJ / darbe, 5 ns süre, 900 mW) kullanın (genellikle 2-3 darbe alır).
      1. Bu lazer sistemiyle birlikte gelen dahili stereoskopu kullanarak fiber uçları hizalayın.
         NOT: Bu sistem, kullanıcının fiberin ucunu kapsayacak şekilde bir pencereyi hizalamasını sağlar (burada, 50 μm x 20 μm (yükseklik x genişlik)) kullanılmıştır.
      2. Doğru ve hassas bir kesim için stereoskopu 500x büyütmede fiberin ucuna odakla.
         NOT: Parilen C, uçtan hafifçe (<10 μm) alev alacak ve kör, silindirik bir uç bırakacaktır.
2. Blowtorch Bileme25,26,27
   1. Lifleri cerrahi makasla 300 μm'ye kesin.
   2. Diziyi deiyonize su kabına batırın, konektör tarafı aşağı doğru ve az miktarda macunla kabın dibine sabitlenin.
   3. Lifleri su yüzeyiyle hizalamak için bir kalem kamera kullanın, böylece lifler su yüzeyine zar zor dokunur.
   4. Bütane üflemeli bir alevi 3-5 mm'ye ayarlayın ve lifleri keskinleştirmek için ileri geri hareketle liflerin üstünden çalıştırın.
      NOT: Lif uçları, alev üzerlerinden geçtiğinde turuncu renkte parlayacaktır.
   5. Diziyi macundan çıkarın ve stereoskop altında 50x büyütmenin altındaki sivri uçlar için inceleyin.
      NOT: Sivri uçlara uyulursa, daha fazla pürmüze gerek yoktur. İpuçları künt görünüyorsa, 7.2.2-7.2.5 adımlarını yineleyin.
3. UV lazer ^kesim28
   NOT: UV Lazer, Flex Array karbon fiberlerinin perdesinden daha büyük olan UV Lazer'in geniş odak noktası nedeniyle şu anda sadece sıfır ekleme kuvveti (ZIF) ve Geniş Kart tasarımlarında kullanılabilir.
   1. Karbon fiberleri cerrahi makasla 1 mm'ye kesin.
   2. Ortogonal olarak yapılandırılmış üç motorlu aşamaya bir UV lazer yapıştır.
      NOT: UV lazer, 1,5 W çıkış gücüne ve 405 nm dalga boyuna sahip çok modelli bir Indium Galyum Nitrür (InGaN) yarı iletkenidir.
      1. Lazerin hızlı ve etkili hizalama ve kesme için sürekli bir ışına sahip olduğundan emin olun.
   3. Lazerin üzerinden geçmesi için elektrotların düzlemini sabit tutmak için diziyi yerinde sabitleyin. Dizinin lazerden uygun bir mesafede tutulmasını sağlayın, böylece lifler lazerin odak noktasıyla ışık alacaktır. Bunu yapmak için, lazere daha düşük bir güç sağlayın ve mesafeyi ^fiber28'e en iyi şekilde odaklanacak şekilde ayarlayın.
   4. Lifleri istenen uzunluğa kesmek için UV lazer odak noktasını fiber düzlem boyunca 25 μm/s hızında hareket ettirin (burada, tüm lifler 500 μm'ye kesilir).
      NOT: Lifler kesilmeden önce parlak bir ışık yayacaktır. Lifleri işlemden sonra iletken bir polimerle kaplanmaya hazır olana kadar saklayın.

8. Poli (3,4-etilenedoksithiophene):p-toluenesulfonat (PEDOT:pTS) düşük empedans için iletken kaplama

1. 50 mL DI suda 0,01 M 3,4-etilendioksithiophene ve 0,1 M sodyum p-toluenesulfonat çözeltilerini karıştırın ve bir karıştırma plakasında (~450 rpm) veya çözeltide partikül gözlenene kadar gece karıştırın.
   NOT: Çözeltiyi ışığa dayanıklı bir kapta saklayın. Çözeltiyi 30 güne kadar kullanılabilen tutmak için karıştırdıktan sonra çözeltiyi soğutun.
2. 1x PBS'de öncekiyle aynı parametreleri (5.2-5.3 adımları) kullanarak 1 kHz empedans taraması çalıştırın. Hangi liflerin iyi bir bağlantıya sahip olduğunu unutmayın (<1 MΩ, tipik olarak 16 lifin 14-16'sı).
3. Elektrotların empedansını azaltmak için PEDOT:pTS ile elektroplate.
   1. Fiber uçlarını PEDOT:pTS çözümüne batırın.
   2. PEDOT:pTS için 1x PBS çözümünü geçirerek ve karta olan tüm bağlantıları uygulanan geçerli kanala kısa devre yaptırarak 5.2 adımındaki adımları izleyin.
   3. Bir potentiostat kullanarak 600 s için iyi lif başına 600 pA uygulayın.
   4. Hücreyi kapatın ve çalıştırmanın sonunda 5 s dinlenmesine izin verin.
4. Lifleri çözeltiden çıkarın ve DI suyunda durulayın.
5. Liflerin başarıyla kaplandığını kontrol etmek için 1 kHz empedansları yeniden çekin (5.2-5.3 adımlarında listelenen parametreleri kullanın).
   NOT: İyi lifler, 110 kΩ'dan daha az empedansa sahip herhangi bir lif olarak belirlenir.

9. Bağlantı zemini ve referans telleri

1. Parylene C'yi yerden hafifçe kazıyın ve cımbız kullanarak tahtadaki referansları referans alın. Bu tahta tasarımında zemin ve referans via'ları çiftler halinde kısan.
   NOT: Zemin ve referans via'ları Flex dizisindeki konektörün yakınında bulunabilir ve konektörlerin yakınındaki dört küçük altın dairedir. Kullanıcıların ölçümler için parylene C'yi karbon fiberlere en yakın vialardan çıkarmaları yeterlidir.
2. Jiletle iki adet 5 cm uzunluğunda yalıtımlı gümüş tel kesin. Ameliyat sırasında daha kolay topraklama ve referans sağlamak için tellerin uçlarını Flex Dizisine tutturulacak bir uçtan 2-3 mm ve karşı uçlardan ~10 mm yalıtın.
3. Lehim demirini 600 °F'ye ısıtın. Via'lara az miktarda akı uygulayın.
4. Kart üzerindeki ePhys bağlantılarının her birine bir tel (2-3 mm açık uç) yerleştirin. Lehimleri viaların üstüne uygulayın (Şekil 7A). Probun soğumasına izin verin, ardından via'nın arka tarafına az miktarda lehim uygulamak için ters çevirin (Şekil 7A).
5. Cerrahi makas kullanarak, kayıtta görülen gürültüyü azaltmaya yardımcı olduğu için arka lehim höyüğünden yapışan açıkta kalan telleri kesin (Şekil 7B).
6. Dizileri, kabloları fiberden geri ve uzağa bükerek depolama kutusuna geri yerleştirin. Olası fiber tel etkileşimlerini önlemek için yapışkan bant üzerindeki telleri sabitleyin (Şekil 7C).

10. Cerrahi prosedür

NOT: Sıçan korteksi, daha önce ^7,20 olarak açıklandığı gibi UV Lazer tarafından hazırlanan liflerin etkinliğini test etmek için kullanılmıştır. Bu problar, benzer geometrileri ve empedans seviyeleri nedeniyle sinirde çalışacaktır. Bu ameliyat, UV lazerin elektrotların tepkisini değiştirmediğini doğrulamak için bol miktarda dikkatle gerçekleştirildi.

1. Yetişkin bir erkek Long Evans sıçanını ketamin (90 mg/kg) ve ksilazin (10 mg/kg) kombinasyonu kullanarak uyuşturun. Anesteziyi bir parmak sıkışma testi ile onaylayın. Ameliyat sırasında sıçanın gözlerinin kurumasını önlemek için gözlere merhem uygulayın.
2. Sağ yarımkürenin motor korteksinin üzerinde 2 mm x 2 mm kraniyotomi oluşturun. Kraniyotomi'nin sol alt köşesini 1 mm bregma ön ve 1 mm orta çizgi yan çizgisi ölçerek tanımlayın.
3. Diziyi stereotaksik bir enstrümana monte edin ve dura yüzeyine dokunana kadar lifleri hafifçe indirerek duradaki stereotaksik aleti sıfırlayın. Diziyi cerrahi bölgeden uzaklaştırın ve yerleştirmeye hazır olana kadar yana doğru hareket ettinin.
4. Dura'yı, ucu dikenli bir iğneyi doku yüzeyine hafifçe çekerek resect yapın. Dura'nın bir kısmı beyne açıldıktan sonra, dura'nın çekilmesine daha fazla yardımcı olmak için bir çift ince tokmak kullanın.
5. Lifleri kraniyotomiye ve 1,2 mm stereotaksik bir alet kullanarak beyne yerleştirin ve elle yavaşça 2007'de alçaltın.
6. ePhys'e özgü bir başlık ve önamplifier ile ePhys verilerini 10 dakika boyunca kaydedin.
   1. Sinyali 2,2 Hz, antialias'ı 7,5 kHz ve numuneyi 25 kHz'de işlemek için önbaklamlı yüksek geçiş filtresini ayarlayın.
      NOT: Bu ölçümlerde sadece spontan aktivite kaydedilir. Uyarıcı uygulanmaz.
7. Ötanazi
   1. Sıçanı izofluran altında 1 L / dk oksijenin altında% 5'te yaşam belirtileri sona erene kadar (20-30 dk) yerleştirin. Ötanaziyi kafa kesme ile onaylayın.

11. Ani sıralama

1. Daha önce bildirilen yöntemleri kullanarak verileri sıralamak ve analiz etmek için başak sıralama yazılımını ^kullanın8.
2. Tüm kanallarda (250 Hz köşe, 4^. sıra Butterworth) yüksek geçiş filtresi kullanın ve dalga biçimi algılama düzeyini RMS eşiği × -3,5 olarak ayarlayın.
   1. Benzer özelliklere sahip küme ve sivri uçlar için gauss modeli kullanın. Daha fazla analize dahil etmek için en az 10 dalga formu kümelerini birleştirin ve ortalama.
   2. Veri kümesinden ani olmayan tüm dalga biçimlerini ortadan kaldırın veya silin.
3. Tüm kanallar sıralandıktan sonra verileri dışa aktarın ve dalga formlarını çizmek ve daha fazla analiz etmek için analiz yazılımı kullanın.

12. Taramalı elektron mikroskobik (SEM) görüntüleme

NOT: Bu adım dizileri kullanılamaz hale getirir ve dizilerin düzgün işlendiğini denetlemek için yalnızca uç işlem sonuçlarını incelemek için kullanılmalıdır. Başarılı bir dizi oluşturmak için bu adımın yapılması gerekmez. Aşağıda özetlenen SEM sürecinin genel bir taslağıdır; ancak, daha önce SEM kullanmamış olan kullanıcılar eğitimli bir kullanıcıdan yardım almalıdır.

1. PCB'nin fiber uçunu kırpın ve karbon bant maskeli bir SEM saplağı üzerine monte edin. Karbon fiberlerin SEM saplağına yapışmasını önlemek için dizileri küçük bir yığılmış karbon bant platformuna (4-5 katman) yerleştirin.
2. Sputter- altın sputter kaplayıcı üreticisi tarafından belirtilen prosedürleri izleyerek altın (100-300 Å) ile dizileri kaplayın.
3. Uç işleme efektlerini incelemek için dizileri SEM'de 15 mm ve 20 kV ışın mukavemetli bir çalışma mesafesinde görüntüleyin.
   NOT: Diziler, UV lazer kesimli lifler için Şekil 8D'de gösterildiği gibi, düşük bir vakum altında sputter kaplama olmadan görüntülenebilir. Bu kurulum için 11-12 mm çalışma mesafesine ve 4 kV ışın mukavemetine sahip olmak önerilir.

Sonuçlar

İpucu doğrulaması: SEM görüntüleri
Önceki ^çalışma20 , makas kesiminin Parylene C kayıt sitesi boyunca katlandığında güvenilmez empedanslara neden olduğunu gösterdi. Makas kesimi burada sadece ek bir finiş kesme yöntemi ile işlemeden önce lifleri istenilen uzunluğa kesmek için kullanılır. Açıkta kalan karbon uzunluğu ve uç geometrisini belirlemek için uçların SEM görüntüleri kullanılmıştır (Şekil 8).

Tartışmalar

Malzeme ikameleri
Kullanılan tüm malzemeler Malzeme Tablosunda özetlenirken, malzemelerin çok azının belirli satıcılardan gelmesi gerekmektedir. Esnek kartı yazdırabilen tek şirket oldukları için Flex Array panosu listelenen satıcıdan gelmelidir. Flex Array bağlayıcısı, özel bir bağlayıcı olduğu için listelenen satıcıdan da sipariş edilmelidir. Parylene C, oda sıcaklığında in vivo ortama dayanabilecek güvenilir bir şekilde konformsal bir kapl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 prong clams	05-769-6Q	Fisher	Qty: 2 Unit Cost (USD): 20
3,4-ethylenedioxythiophene (25 g) (PEDOT)	96618	Sigma-Aldrich	Qty: 1 Unit Cost (USD): 102
353ND-T Epoxy (8oz)++ (ZIF and Wide Board Only)	353ND-T/8OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 48
Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3)	50-854-570	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 100
Autolab	PGSTAT12	Metrohm
Blowtorch	1WG61	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 36
Carbon Fibers	T-650/35 3K	Cytec Thornel	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Carbon tape	NC1784521	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 27
Cotton Tipped Applicator	WOD1002	MediChoice	Qty: 1 Unit Cost (USD): 0.57
Delayed Set Epoxy++	1FBG8	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
DI Water	n/a	n/a	Qty: n/a Unit Cost (USD): n/a
Dumont Tweezers #5	50-822-409	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 73
Flex Array**	n/a	MicroConnex	Qty: 1 Unit Cost (USD): 68
Flux	SMD291ST8CC	DigiKey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 13
Glass Capillaries (pack of 350)	50-821-986	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 60
Glass Dish	n/a	n/a	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Hirose Connector (ZIF Only)	H3859CT-ND	DigiKey	Qty: 2 Unit Cost (USD): 2
Light-resistant Glass Bottle	n/a	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Heating Filiment	FB315B	Sutter Instrument Co	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Puller	P-97	Sutter Instrument Co	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Nitrile Gloves (pack of 200)	19-041-171C	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 47
Offline Sorter software	n/a	Plexon	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Omnetics Connector* (Flex Array Only)	A79025-001	Omnetics Inc	Qty: 1 Unit Cost (USD): 35
Omnetics Connector* (Flex Array Only)	A79024-001	Omnetics Inc	Qty: 1 Unit Cost (USD): 35
Omnetics to ZIF connector	ZCA-OMN16	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Pin Terminal Connector (Wide Board Only)	ED11523-ND	DigiKey	Qty: 16 Unit Cost (USD): 10
Probe storage box	G2085	Melmat	Qty: 1 Unit Cost (USD): 2
Razor Blade	4A807	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 2
SEM post	16327	lnf	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
Silver Epoxy (1oz)++	H20E/1OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 125
Silver GND REF wires	50-822-122	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 423.2
Sodium p-toulenesulphonate(pTS)- 100g	152536	Sigma-Aldrich	Qty: 1 Unit Cost (USD): 59
Solder	24-6337-9703	DigiKey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 60
Soldering Iron Tip	T0054449899N-ND	Digikey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 13
Soldering Station	WD1002N-ND	Digikey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 374
SpotCure-B UV LED Cure System	n/a	FusionNet LLC	Qty: 1 Unit Cost (USD): 895
Stainless steel rod	n/a	n/a	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Stir Plate	n/a	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Surgical Scissors	08-953-1B	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 100
TDT Shroud (ZIF Only)	Z3_ZC16SHRD_RSN	TDT	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3.5
Teflon Tweezers	50-380-043	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 47
UV & Visible Light Safety Glassees	92522	Loctite	Qty: 1 Unit Cost (USD): 45
UV Epoxy (8oz)++ (Flex Array Only)	OG142-87/8OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 83
UV Laser	n/a	WER	Qty: 1 Unit Cost (USD): 30
Weigh boat (pack of 500)	08-732-112	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 58
Wide Board+	n/a	Advanced Circuits	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
ZIF Active Headstage	ZC16	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): 925
ZIF Passive Headstage	ZC16-P	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): 625
ZIF*	n/a	Coast to Coast Circuits	Qty: 1 Unit Cost (USD): 9