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Resumo

Aqui, descrevemos a metodologia de fabricação para matrizes de eletrodos de fibra de carbono personalizáveis para gravação in vivo no nervo e no cérebro.

Resumo

As sondas nervosas periféricas convencionais são fabricadas principalmente em uma sala de limpeza, exigindo o uso de múltiplas ferramentas caras e altamente especializadas. Este artigo apresenta um processo de fabricação "leve" de matrizes de eletrodos neurais de fibra de carbono que podem ser aprendidas rapidamente por um usuário de sala de limpeza inexperiente. Este processo de fabricação de matriz de eletrodos de fibra de carbono requer apenas uma ferramenta de limpeza, uma máquina de deposição Parylene C, que pode ser aprendida rapidamente ou terceirizada para uma instalação de processamento comercial a um custo marginal. Este processo de fabricação também inclui placas de circuito impresso de preenchimento manual, isolamento e otimização de ponta.

As três diferentes otimizações de ponta exploradas aqui (laser Nd:YAG, maçarico e laser UV) resultam em uma gama de geometrias de ponta e impedâncias de 1 kHz, com fibras maçaricos resultando na menor impedância. Embora experimentos anteriores tenham comprovado a eficácia do eletrodo de laser e maçarico, este artigo também mostra que fibras cortadas a laser UV podem registrar sinais neurais in vivo. Os arrays de fibra de carbono existentes não possuem eletrodos individuados em favor de pacotes ou exigem guias fabricadas para a população e isolamento. Os arrays propostos utilizam apenas ferramentas que podem ser usadas em um banco para a população de fibras. Este processo de fabricação de matriz de eletrodos de fibra de carbono permite a rápida personalização da fabricação de matriz a granel a um preço reduzido em comparação com as sondas disponíveis comercialmente.

Introdução

Grande parte da pesquisa em neurociência se baseia no registro de sinais neurais usando eletrofisiologia (ePhys). Esses sinais neurais são cruciais para entender as funções das redes neurais e novos tratamentos médicos, como máquina cerebral e interfaces nervosas periféricas1,2,3,4,5,6. Pesquisas em torno de nervos periféricos exigem eletrodos de gravação neural feitos sob medida ou comercialmente disponíveis. A gravação neural de eletrodos-ferramentas exclusivas com dimensões em escala de micron e materiais frágeis requer um conjunto especializado de habilidades e equipamentos para fabricar. Uma variedade de sondas especializadas foram desenvolvidas para usos finais específicos; no entanto, isso implica que os experimentos devem ser projetados em torno de sondas comerciais disponíveis atualmente, ou um laboratório deve investir no desenvolvimento de uma sonda especializada, que é um processo demorado. Devido à grande variedade de pesquisas neurais no nervo periférico, há alta demanda por uma sonda ePhys versátil4,7,8. Uma sonda ePhys ideal contaria com um pequeno site de gravação, baixo impedance9 e um ponto de preço financeiramente realista para implementação em um sistema3.

Os eletrodos comerciais atuais tendem a ser eletrodos extraneurais ou manguitos (Neural Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff Electrode11), que ficam fora do nervo, ou intrafasciculares, que penetram no nervo e se sentam dentro do fascículo de interesse. No entanto, à medida que os eletrodos de punho ficam mais longe das fibras, eles captam mais ruídos de músculos próximos e outros fascicles que podem não ser o alvo. Essas sondas também tendem a restringir o nervo, o que pode levar a um acúmulo de células gliais e tecido cicatricial na interface do eletrodo enquanto o tecido se cura. Eletrodos intrafasciculares (como LIFE12, TIME13 e Utah Arrays14) adicionam o benefício da seletividade de fascículos e têm boas relações sinal-ruído, o que é importante em sinais discriminadores para interligação de máquinas. No entanto, essas sondas têm problemas com a biocompatibilidade, com os nervos ficando deformados ao longo do tempo3,15,16. Quando compradas comercialmente, ambas as sondas têm designs estáticos sem opção de personalização específica de experimentos e são caras para laboratórios mais novos.

Em resposta aos problemas de alto custo e biocompatibilidade apresentados por outras sondas, os eletrodos de fibra de carbono podem oferecer uma avenida para os laboratórios de neurociência construirem suas próprias sondas sem a necessidade de equipamentos especializados. As fibras de carbono são um material de gravação alternativo com um pequeno fator de forma que permite a inserção de baixo dano. As fibras de carbono proporcionam melhor biocompatibilidade e resposta de cicatriz consideravelmente menor do que o silício17,18,19 sem o processamento intensivo da sala de limpeza5,13,14. As fibras de carbono são flexíveis, duráveis, facilmente integradas com outros biomateriais19, e podem penetrar e registrar a partir de nervos7,20. Apesar das muitas vantagens das fibras de carbono, muitos laboratórios acham a fabricação manual dessas matrizes árdua. Alguns grupos21 combinam fibras de carbono em feixes que, coletivamente, resultam em um diâmetro maior (~200 μm); no entanto, para nosso conhecimento, esses feixes não foram verificados em nervos. Outros fabricaram matrizes de eletrodos de fibra de carbono não evidenciadas, embora seus métodos exijam guias de fibra de carbono fabricados em sala de limpeza22,23,24 e equipamentos para povoar suas matrizes17,23,24. Para lidar com isso, propomos um método de fabricação de uma matriz de fibra de carbono que possa ser realizada no banco de banco de laboratório que permita modificações improvisadas. A matriz resultante mantém pontas de eletrodos individuadas sem ferramentas especializadas de preenchimento de fibras. Além disso, várias geometrias são apresentadas para corresponder às necessidades do experimento de pesquisa. Construído a partir de trabalhos anteriores8,17,22,25, este artigo fornece metodologias detalhadas para construir e modificar vários estilos de matrizes manualmente com o mínimo de tempo de treinamento de sala de limpeza necessário.

Protocolo

Todos os procedimentos animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Michigan.

1. Escolher uma matriz de fibra de carbono

  1. Escolha uma placa de circuito impresso (PCB) de um dos três desenhos mostrados na Figura 1.
    NOTA: Para este protocolo, Flex Arrays será o foco.
    1. Consulte os projetos de PCB no site do Chestek Lab (https://chestekresearch.engin.umich.edu), gratuitamente e pronto para ser enviado e encomendado para impressão através de uma gráfica PCB.
    2. Consulte a Tabela 1 para obter um resumo dos conectores para cada placa e suas especificações para ajudar a escolher o conector que funcionará para a configuração experimental específica.

2. Soldar o conector para a placa de circuito

  1. Coloque um ferro de solda a 315 °C (600 °F).
  2. Aplique fluxo em todas as almofadas de solda no PCB.
    NOTA: O fluxo dentro de um tubo pode ser espremido através das almofadas, enquanto o fluxo em uma panela pode ser aplicado com a extremidade de madeira de um aplicador de ponta de algodão manchando o fluxo em todas as almofadas liberalmente.
  3. Formar pequenos montes de solda nas almofadas traseiras do Flex Array (Figura 2A).
  4. Soldar a linha inferior dos pinos do conector para a linha de trás das almofadas de solda (Figura 2B).
    NOTA: Todos os projetos de placa fornecidos pelo laboratório Chestek foram projetados para que os conectores emparelhem precisamente com sua placa designada.
    1. Para isso, solde os pinos de ambos os lados do conector com fácil acesso aos montes de solda. Uma vez seguro, empurre suavemente a ponta de ferro de solda entre os pinos dianteiros para soldar as conexões restantes na parte de trás.
      NOTA: Uma vez que a linha de trás dos pinos esteja segura, o resto do conector se alinhará com cada pino acima da almofada de solda atribuída.
  5. Solde a primeira fila de pinos na placa aplicando uma pequena quantidade de solda em cada pino. Aplique uma camada adicional de fluxo se a solda não estiver acontecendo rapidamente.
    1. Limpe o fluxo de excesso com álcool isopropílico 100% (IPA) e uma escova de cerdas curtas.
  6. Encapsular as conexões soldadas em epóxi de conjunto atrasado (Figura 2 C,D) usando uma agulha de 23 G e uma seringa de 1 mL colocada lado de bipe para baixo nos pinos. Empurre epóxi através da seringa lentamente para que ela flua para dentro e ao longo das conexões.
    1. Deixe o tabuleiro durante a noite para que o epóxi atrasado possa curar.
      NOTA: Enquanto a inserção do produto para o conjunto atrasado epóxi afirma que ele cura em 30 minutos, deixá-lo durante a noite permite que uma conexão mais estável se forme.
  7. Fixar a parte traseira da placa para os lados do conector, colocando uma pequena linha de epóxi de conjunto atrasado através do lado de trás da placa e puxando-o para as bordas do conector.
    1. Deixe o tabuleiro para curar durante a noite de novo.
      NOTA: Neste momento, ou armazene as matrizes ou continue a compilação. Se parar na compilação, armazene as matrizes em uma caixa limpa e seca à temperatura ambiente.

3. População de fibras

  1. Corte um capilar de vidro puxado para que sua ponta se encaixe entre os traços da matriz (Figura 3A).
    1. Usando um puxador de vidro e filamento, faça capilares usando as seguintes configurações: Calor = 900, Puxar = 70, Velocidade = 35, Tempo = 200, Pressão = 900.
      NOTA: Os números são unitários e específicos para este dispositivo (veja a Tabela de Materiais).
  2. Use as extremidades de madeira de dois aplicadores de ponta de algodão (um por cada parte de epóxi prateado) para colher uma pequena proporção de epóxi prateado de ~1:1 em um prato plástico e misture usando as mesmas varas usadas para colher. Descarte os aplicadores após a mistura.
  3. Corte 2-4 mm da extremidade do feixe de fibra de carbono em um pedaço de papel de impressora usando uma lâmina de barbear. Para separar facilmente as fibras do pacote, que são difíceis de separar, puxe um pedaço de papel laminado suavemente sobre a parte superior do pacote.
    NOTA: O pedaço de papel laminado transfere estática para as fibras, que se separarão por si só.
  4. Aplique epóxi prateado entre todos os outros pares de traços de um lado da placa com o capilar de vidro (Figura 3B).
    1. Leve uma pequena gota de epóxi na ponta de um capilar puxado. Aplique suavemente entre todos os outros traços na extremidade do tabuleiro, preenchendo a lacuna.
      NOTA: A lacuna deve ser preenchida até o topo dos dois traços sem transbordar para tocar traços vizinhos. Cada traço está conectado a um canal. Este método de população epóxi significa que cada fibra terá dois canais conectados a ela. Isso porque dois traços permitem um melhor alinhamento de fibras, e a redundância no canal ajuda a garantir a conexão elétrica.
  5. Use pinças revestidas de Teflon para colocar uma fibra de carbono em cada traço epóxi (Figura 3C).
  6. Use um capilar limpo puxado para ajustar as fibras de carbono, de modo que elas sejam perpendiculares até o final da placa Flex Array e enterradas sob o epóxi (Figura 3D).
  7. Coloque as matrizes em um bloco de madeira com extremidades de fibra suspensas na borda do bloco.
    NOTA: O peso da extremidade traseira manterá a matriz no bloco.
  8. Asse o bloco de madeira e os arrays a 140 °C por 20 minutos para curar o epóxi prateado e travar as fibras no lugar.
  9. Repita as etapas 3.4-3.8 para o outro lado da placa.
    NOTA: Os arrays podem ser armazenados após qualquer etapa de cozimento; no entanto, estática das caixas de armazenamento pode fazer com que as fibras se afastem da placa se muito pouco epóxi prateado for aplicado ao preencher a placa.
    1. Crie uma plataforma de adesivo levantada dentro de uma caixa para que a maior parte da placa possa ficar presa ao adesivo permitindo que as extremidades fibras da placa sejam suspensas dentro da caixa para evitar a quebra de fibras. Armazene em temperatura ambiente.
      NOTA: Se as fibras se afastarem da placa durante o armazenamento, raspe o epóxi dos traços com um capilar de vidro puxado limpo e repita as etapas 3.1-3.8 para substituir as fibras. A partir deste ponto, as matrizes devem ser armazenadas com as fibras suspensas desta forma para evitar a quebra de fibras.

4. Aplicar epóxi ultravioleta (UV) para isolar as fibras de carbono

  1. Use um capilar limpo e aplique uma pequena gota (~0,5 mm de diâmetro de epóxi UV nos traços expostos em um lado da placa (Figura 4A). Continue adicionando gotículas UV epóxi até que os traços estejam completamente cobertos.
    NOTA: Não permita que o epóxi UV entre nas fibras de carbono além da extremidade do PCB para garantir uma inserção suave mais tarde.
  2. Cure o epóxi UV sob uma luz de caneta UV por 2 min (Figura 4B).
  3. Repita os passos 4.1-4.2 para o outro lado da placa.
  4. Corte as fibras para 1 mm usando um tique-sítipo e uma tesoura cirúrgica.
    NOTA: Os arrays podem ser armazenados neste momento até que estejam prontos para prosseguir para os próximos passos. Eles devem ser armazenados em uma caixa que elevará as fibras de carbono para longe da própria caixa. As matrizes podem ser armazenadas à temperatura ambiente indefinidamente.

5. Verificando conexões elétricas com escaneamentos de impedância de 1 kHz (Figura 5)

  1. Submergir fibras de carbono 1 mm em 1x salina tamponada com fosfato (PBS).
  2. Para completar o circuito, use um cloreto prata-prata (Ag| AgCl) eletrodo de referência e uma haste de aço inoxidável (eletrodo de contador).
    1. Usando um grampo de béquer, suspenda o Ag| Eletrodo agCl no PBS 1x e conectá-lo à referência do sistema de impedância que está sendo utilizado.
    2. Usando um grampo de béquer, suspenda a haste de aço inoxidável no PBS 1x e conecte-se à entrada do eletrodo do sistema de impedância que está sendo utilizado.
  3. Execute uma varredura de impedância de 1 kHz para cada fibra usando um conjunto de potencialização para uma frequência de varredura de 1 kHz a 0,01 Vrms em uma única forma de onda seno. Defina o potencialiostat para 0 V no início de cada varredura para 5 s para estabilizar o sinal gravado. Registo as medições através do software associado ao potencialiostat.
    NOTA: As medidas podem ser tomadas em qualquer ponto da compilação; no entanto, eles só são necessários antes do isolamento e durante a preparação da ponta. A Tabela 2 lista faixas típicas de impedâncias após cada etapa de construção a 1 kHz para a referência do usuário.
  4. Enxágüe as fibras em água deionizada (DI) mergulhando-as em um pequeno béquer três vezes e deixe-as secas à temperatura ambiente.
    NOTA: Os arrays podem ser deixados em armazenamento até que o usuário possa continuar na próxima etapa.

6. Isolamento de Parileno C

NOTA: O parileno C foi escolhido como o material de isolamento para as fibras de carbono, pois pode ser depositado à temperatura ambiente sobre lotes de matrizes e fornece um revestimento altamente conformal.

  1. Mascarar o conector Flex Array usando o conector de acasalamento.
  2. Coloque um lote de 8-12 arrays em uma caixa de armazenamento com uma plataforma de adesivo elevada para que eles possam ser isolados em uma única corrida. Coloque as matrizes para que a extremidade do conector da matriz esteja na plataforma adesiva com a extremidade fibrada da matriz pendente (Figura 6) para evitar que as fibras grudem no adesivo e se retirem e garantam um revestimento parileno uniforme sobre as fibras.
  3. Cubra as matrizes em um sistema de deposição Parylene C até uma espessura de 800 nm em uma sala de limpeza, usando equipamentos de proteção individual (EPI) apropriados, conforme definido pela sala de limpeza individual que está sendo usada.
    NOTA: Aqui, o EPI foi definido como sapatos de limpeza, terno, cobertura da cabeça, óculos, máscara e luvas de látex. Deve-se notar que este é um EPI padrão para entrar em uma sala de limpeza. Esta etapa pode ser terceirizada para uma empresa de revestimento parileno por uma taxa; no entanto, um serviço comercial pode ser capaz de revestir mais matrizes ao mesmo tempo. Cada sistema de deposição parileno C pode ter diferentes precauções de segurança. Entre em contato com o técnico antes de usar para garantir a segurança do usuário.
  4. Remova o conector de acasalamento usado como máscara do Flex Array.
  5. Coloque as matrizes em uma nova caixa para armazenamento até que estejam prontos para uso.

7. Métodos de preparação de ponta

NOTA: Duas preparações de ponta nesta seção usam lasers para cortar fibras. Epi adequado, como óculos resistentes aos comprimentos de onda utilizados, devem ser sempre usados ao usar o laser, e outros usuários de laboratório nas proximidades do laser também devem estar em EPI. Embora os comprimentos de fibra listados nestas etapas sejam comprimentos recomendados, os usuários podem tentar qualquer comprimento que se adapte às suas necessidades. O usuário deve escolher um dos seguintes métodos de preparação de ponta, pois o corte da tesoura sozinho não será suficiente para re-expor o eletrode25.

  1. Corte de alumínio de ítrio dotado de neodímio (Nd:YAG) corte a laser
    1. Corte as fibras para 550 μm com tesoura cirúrgica.
    2. Use um laser pulsado de 532nm Nd:YAG (5 mJ/pulse, 5 ns de duração, 900 mW) para cortar 50 μm da ponta das fibras para re-expor o carbono sob o Parileno C (geralmente leva 2-3 pulsos).
      1. Alinhe as pontas de fibra usando o estereoscópio embutido que vem com este sistema laser.
        NOTA: Este sistema permite que o usuário alinhe uma janela (aqui, 50 μm x 20 μm (altura x largura)) foi usado para abranger a extremidade da fibra.
      2. Concentre o estereoscópio na extremidade da fibra em ampliação de 500x para um corte preciso e preciso.
        NOTA: Parileno C vai ablular ligeiramente (<10 μm) da ponta deixando uma ponta cíndrica e contundente.
  2. Maçarico Afiando25,26,27
    1. Corte as fibras para 300 μm com tesoura cirúrgica.
    2. Submergir a matriz em um prato de água deionizada, lado do conector para baixo, e preso ao fundo do prato com uma pequena quantidade de massa.
    3. Use uma câmera de caneta para alinhar as fibras com a superfície da água para que as fibras mal toquem a superfície da água.
    4. Ajuste uma chama de maçarico butano para 3-5 mm e execute-a sobre a parte superior das fibras em um movimento de ida e volta para afiar fibras.
      NOTA: As pontas de fibra brilharão laranja quando a chama passar por cima delas.
    5. Remova a matriz da massa e inspecione-a sob um estereoscópio para pontas pontiagudos sob ampliação de 50x.
      NOTA: Se forem observadas pontas pontiagudas, então não é necessário mais maçarico. Se as pontas parecerem contundentes, repita as etapas 7.2.2-7.2.5.
  3. Corte de laser UV28
    NOTA: O laser UV só pode ser usado em sistemas de força de inserção zero (ZIF) e Wide Board no momento devido ao grande ponto focal do laser UV usado ser maior que o tom das fibras de carbono Flex Array.
    1. Corte as fibras de carbono para 1 mm com uma tesoura cirúrgica.
    2. Fixar um laser UV a três estágios motorizados configurados ortogonicamente.
      NOTA: O laser UV é um semicondutor de nitrito de gálio de 405 nm multimode (InGaN) com potência de saída de 1,5 W e comprimento de onda de 405 nm.
      1. Certifique-se de que o laser tenha um feixe contínuo para alinhamento e corte rápidos e eficazes.
    3. Proteja a matriz no lugar para manter um plano de eletrodos ainda nivelado para que o laser passe. Certifique-se de que a matriz seja mantida a uma distância apropriada do laser para que as fibras estejam em luz com o ponto focal do laser. Para isso, forneça uma potência menor ao laser e ajuste a distância para melhor foco na fibra28.
    4. Mova o ponto focal laser UV através do plano de fibra a uma velocidade de 25 μm/s para cortar as fibras ao comprimento desejado (aqui, todas as fibras são cortadas para 500 μm).
      NOTA: As fibras emitirão uma luz brilhante antes de serem cortadas. Armazene as fibras após o tratamento até que estejam prontas para serem revestidas com um polímero condutor.

8. Poly (3,4-ethylenedioxythiophene):p-toluenesulfonato (PEDOT:pTS) revestimento condutor para impedância baixada

  1. Misture soluções de 0,01 M 3,4-etilenodioxilofene e 0,1 M de sódio p-toluenesulfonate em 50 mL de água DI e mexa durante a noite em uma placa de mexida (~450 rpm) ou até que nenhuma particulada possa ser observada na solução.
    NOTA: Armazene a solução em um recipiente resistente à luz. Leve à geladeira a solução após a mistura para manter a solução útil por até 30 dias.
  2. Execute uma digitalização de impedância de 1 kHz usando os mesmos parâmetros de antes (etapas 5.2-5.3) em 1x PBS. Note quais fibras têm uma boa conexão (<1 MΩ, tipicamente 14-16 de 16 fibras).
  3. Eletroplaca com PEDOT:pTS para diminuir a impedância dos eletrodos.
    1. Submergir as pontas de fibra na solução PEDOT:pTS.
    2. Siga os passos levantados na etapa 5.2, mudando a solução PBS 1x para PEDOT:pTS e curtando todas as conexões à placa para o canal atual aplicado.
    3. Aplique 600 pA por fibra boa para 600 s usando um potencialiostat.
    4. Desligue a célula e deixe descansar por 5 s no final da corrida.
  4. Remova as fibras da solução e enxágue-as em água DI.
  5. Retome impedâncias de 1 kHz para verificar se as fibras foram revestidas com sucesso (use os mesmos parâmetros listados nas etapas 5.2-5.3).
    NOTA: Boas fibras são designadas como qualquer fibra com uma impedância inferior a 110 kΩ.

9. Conectando fios de terra e referência

  1. Raspe suavemente Parylene C do chão e faça referência à placa usando pinças. Curta o solo e as vias de referência em pares neste design de placa.
    NOTA: As vias de terra e referência podem ser encontradas perto do conector na matriz Flex e são os quatro pequenos círculos dourados próximos aos conectores. Os usuários só precisarão remover o Parileno C das vias mais próximas das fibras de carbono para medições.
  2. Corte dois comprimentos de 5 cm de fio de prata isolado com uma lâmina de barbear. Desinsula as extremidades dos fios 2-3 mm de uma extremidade para serem anexadas ao Flex Array e ~10 mm das extremidades opostas para permitir um aterramento e referência mais fácil durante a cirurgia.
  3. Aqueça o ferro de solda de volta a 600 °F. Aplique uma pequena quantidade de fluxo nas vias.
  4. Insira um fio (extremidade exposta de 2-3 mm) em cada uma das vias ePhys na placa. Aplique solda na parte superior das vias (Figura 7A). Deixe a sonda esfriar e, em seguida, vire-a para aplicar uma pequena quantidade de solda na parte traseira da via (Figura 7A).
  5. Usando uma tesoura cirúrgica, corte qualquer fio exposto saindo do monte de solda traseira, pois isso ajuda a reduzir o ruído visto na gravação (Figura 7B).
  6. Coloque as matrizes de volta na caixa de armazenamento, dobrando os fios para trás e para longe da fibra. Fixar os fios na fita adesiva para evitar possíveis interações entre fios de fibra (Figura 7C).

10. Procedimento cirúrgico

NOTA: O córtex de rato foi usado para testar a eficácia das fibras preparadas a laser UV, pois esta foi descrita anteriormente 7,20. Estas sondas trabalharão no nervo devido à sua geometria semelhante e níveis de impedância às fibras preparadas pelo maçarico. Esta cirurgia foi realizada com muita cautela para validar que o laser UV não alterou a resposta dos eletrodos.

  1. Anestesia um rato long evans masculino adulto usando uma combinação de cetamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Confirme anestesia com um teste de beliscão do dedo do dedo. Aplique pomada nos olhos para evitar que os olhos do rato sequem durante a cirurgia.
  2. Crie uma craniotomia de 2 mm x 2 mm acima do córtex motor do hemisfério direito. Identifique o canto inferior esquerdo da craniotomia medindo 1 mm anterior de bregma e 1 mm lateral de linha média.
  3. Monte a matriz em um instrumento estereotaxico, e zero o instrumento estereotaxic na dura baixa suavemente as fibras até que toquem a superfície da dura. Levante a matriz para longe do local cirúrgico e mova-a para o lado até que esteja pronta para inserção.
  4. Ressesse o dura puxando suavemente uma agulha com uma extremidade farpada sobre a superfície do tecido. Uma vez que uma parte da dura se abra ao cérebro, use um par de fórceps finos para ajudar ainda mais a afastar a dura.
  5. Insira as fibras na craniotomia e 1,2 mm no cérebro usando um instrumento estereotaxico, baixando lentamente à mão.
  6. Registos de ePhys para 10 min com um headstage e preamplifier específico para ePhys.
    1. Defina o filtro de passagem alta do pré-amplificador para processar o sinal a 2,2 Hz, antialias a 7,5 kHz e amostra de 25 kHz.
      NOTA: Para estas medidas, apenas a atividade espontânea é registrada. Nenhum estímulo é aplicado.
  7. Eutanásia
    1. Coloque o rato sob isoflurane a 5% abaixo de 1 L/min de oxigênio até que os sinais de vida tenham cessado (20-30 min). Confirme a eutanásia com decapitação.

11. Classificação de picos

  1. Use software de classificação de picos para classificar e analisar os dados usando métodos relatados anteriormente8.
  2. Use um filtro de alta passagem em todos os canais (canto de 250 Hz, 4ª ordem Butterworth) e defina o nível de detecção de forma de onda para -3,5 × limite RMS.
    1. Use um modelo gaussiano para agrupar e espigões com características semelhantes. Combine e os clusters médios de pelo menos 10 formas de onda para incluir em análises posteriores.
    2. Elimine ou exclua todas as formas de onda que não são picos do conjunto de dados.
  3. Exportar dados uma vez que todos os canais tenham sido classificados e usar software de análise para traçar e analisar ainda mais as formas de onda.

12. Escaneamento de imagens microscópicas eletrônicas (SEM)

NOTA: Esta etapa tornará os arrays inutilizáveis e deve ser usado apenas para inspecionar os resultados do tratamento de ponta para verificar se as matrizes estão sendo processadas corretamente. Esta etapa não precisa ser feita para construir uma matriz de sucesso. Resumido abaixo está um esboço geral do processo SEM; no entanto, os usuários que não utilizaram o SEM anteriormente devem receber ajuda de um usuário treinado.

  1. Corte a extremidade fibra do PCB e monte-a em um stub SEM mascarado de fita de carbono. Coloque as matrizes em uma pequena plataforma de fita de carbono empilhada (4-5 camadas) para evitar que as fibras de carbono grudem no stub SEM.
  2. Sputter-coat as matrizes com ouro (100-300 Å) seguindo procedimentos descritos pelo fabricante do revestimento de sputter dourado.
  3. Para inspecionar os efeitos do tratamento da ponta, imagem as matrizes em um SEM a uma distância de trabalho de 15 mm e 20 kV de resistência ao feixe.
    NOTA: Os arrays podem ser imagens sem revestimento de sputter sob um vácuo baixo, como mostrado na Figura 8D para fibras cortadas a laser UV. Para esta configuração, recomenda-se ter uma distância de trabalho de 11-12 mm e uma resistência ao feixe de 4 kV.

Resultados

Validação da dica: Imagens SEM
Trabalhos anteriores20 mostraram que o corte da tesoura resultou em impedâncias não confiáveis como Parileno C dobrado em todo o local de gravação. O corte da tesoura é usado aqui apenas para cortar fibras ao comprimento desejado antes de processar com um método adicional de corte de acabamento. Foram utilizadas imagens SEM das pontas para determinar o comprimento de carbono exposto e a geometria da ponta (Figura 8

Discussão

Substituições de materiais
Embora todos os materiais utilizados sejam resumidos na Tabela de Materiais, muito poucos dos materiais são necessários para vir de fornecedores específicos. O quadro Flex Array deve vir do fornecedor listado, pois eles são a única empresa que pode imprimir a placa flexível. O conector Flex Array também deve ser encomendado do fornecedor listado por ser um conector proprietário. O parileno C é altamente recomendado como o material de isolamento pa...

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado financeiramente pelos Institutos Nacionais de Distúrbios Neurológicos e AVC (UF1NS107659 e UF1NS115817) e pela Fundação Nacional de Ciência (1707316). Os autores reconhecem o apoio financeiro da Faculdade de Engenharia da Universidade de Michigan e o apoio técnico do Michigan Center for Materials Characterization e do Van Vlack Undergraduate Laboratory. Os autores agradecem ao Dr. Khalil Najafi pelo uso de seu laser Nd:YAG e da Lurie Nanofabrication Facility pelo uso de sua máquina de deposição Parylene C. Também gostaríamos de agradecer à Specialty Coating Systems (Indianápolis, IN) por sua ajuda no estudo de comparação de revestimento comercial.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
3 prong clams05-769-6QFisherQty: 2
Unit Cost (USD): 20
3,4-ethylenedioxythiophene (25 g)
(PEDOT)		96618Sigma-AldrichQty: 1
Unit Cost (USD): 102
353ND-T Epoxy (8oz)++
(ZIF and Wide Board Only)		353ND-T/8OZEpoxy TechnologyQty: 1
Unit Cost (USD): 48
Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3)50-854-570FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 100
AutolabPGSTAT12Metrohm
Blowtorch1WG61GraingerQty: 1
Unit Cost (USD): 36
Carbon FibersT-650/35 3KCytec ThornelQty: 1
Unit Cost (USD): n/a
Carbon tapeNC1784521FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 27
Cotton Tipped ApplicatorWOD1002MediChoiceQty: 1
Unit Cost (USD): 0.57
Delayed Set Epoxy++1FBG8GraingerQty: 1
Unit Cost (USD): 3
DI Watern/an/aQty: n/a
Unit Cost (USD): n/a
Dumont Tweezers #550-822-409FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 73
Flex Array**n/aMicroConnexQty: 1
Unit Cost (USD): 68
FluxSMD291ST8CCDigiKeyQty: 1
Unit Cost (USD): 13
Glass Capillaries (pack of 350)50-821-986FisherQty: 1
Unit Cost (USD): 60
Glass Dishn/an/aQty: 1
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Hirose Connector
(ZIF Only)		H3859CT-NDDigiKeyQty: 2
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Light-resistant Glass Bottlen/aFisherQty: 1
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Micropipette Heating FilimentFB315BSutter Instrument CoQty: 1
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Micropipette PullerP-97Sutter Instrument CoQty: 1
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Nitrile Gloves (pack of 200)19-041-171CFisherQty: 1
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Offline Sorter softwaren/aPlexonQty: 1
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Omnetics Connector*
(Flex Array Only)		A79025-001Omnetics IncQty: 1
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Omnetics to ZIF connectorZCA-OMN16Tucker-Davis TechnologiesQty: 1
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Pin Terminal Connector
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Probe storage boxG2085MelmatQty: 1
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Razor Blade4A807GraingerQty: 1
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Solder24-6337-9703DigiKeyQty: 1
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(Flex Array Only)		OG142-87/8OZEpoxy TechnologyQty: 1
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Weigh boat
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Referências

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