Toolkit open source: array di microelettrodi in fibra di carbonio da banco per la registrazione nervosa

Riepilogo

Qui, descriviamo la metodologia di fabbricazione per array di elettrodi in fibra di carbonio personalizzabili per la registrazione in vivo nel nervo e nel cervello.

Abstract

Le sonde nervose periferiche convenzionali sono fabbricate principalmente in una camera bianca, che richiede l'uso di più strumenti costosi e altamente specializzati. Questo documento presenta un processo di fabbricazione "leggero" della camera bianca di array di elettrodi neurali in fibra di carbonio che possono essere appresi rapidamente da un utente inesperto della camera bianca. Questo processo di fabbricazione di array di elettrodi in fibra di carbonio richiede un solo strumento per camera bianca, una macchina di deposizione Parylene C, che può essere appresa rapidamente o esternalizzata a un impianto di lavorazione commerciale a costo marginale. Questo processo di fabbricazione include anche il popolamento manuale di circuiti stampati, l'isolamento e l'ottimizzazione della punta.

Le tre diverse ottimizzazioni della punta esplorate qui (laser Nd: YAG, fiamma ossidrica e laser UV) si traducono in una gamma di geometrie della punta e impedenze a 1 kHz, con fibre ossidrica che risultano nella più bassa impedenza. Mentre esperimenti precedenti hanno dimostrato l'efficacia dell'elettrodo laser e fiamma ossido, questo documento mostra anche che le fibre tagliate al laser UV possono registrare segnali neurali in vivo. Gli array in fibra di carbonio esistenti non hanno elettrodi individuati a favore dei fasci o richiedono guide fabbricate in camera bianca per la popolazione e l'isolamento. Gli array proposti utilizzano solo strumenti che possono essere utilizzati da un banco per la popolazione di fibre. Questo processo di fabbricazione dell'array di elettrodi in fibra di carbonio consente una rapida personalizzazione della fabbricazione di array sfusi a un prezzo ridotto rispetto alle sonde disponibili in commercio.

Introduzione

Gran parte della ricerca neuroscientifica si basa sulla registrazione di segnali neurali utilizzando l'elettrofisiologia (ePhys). Questi segnali neurali sono cruciali per comprendere le funzioni delle reti neurali e nuovi trattamenti medici come la macchina cerebrale e le interfacce nervose periferiche1,2,3,4,5,6. La ricerca che circonda i nervi periferici richiede elettrodi di registrazione neurale personalizzati o disponibili in commercio. Gli elettrodi di registrazione neurale, strumenti unici con dimensioni in scala micron e materiali fragili, richiedono un insieme specializzato di competenze e attrezzature da fabbricare. Una varietà di sonde specializzate sono state sviluppate per usi finali specifici; tuttavia, ciò implica che gli esperimenti devono essere progettati attorno a sonde commerciali attualmente disponibili, o un laboratorio deve investire nello sviluppo di una sonda specializzata, che è un processo lungo. A causa dell'ampia varietà di ricerche neurali nel nervo periferico, c'è una forte domanda di una sonda ePhys versatile4,7,8. Una sonda ePhys ideale sarebbe caratterizzata da un piccolo sito di registrazione, bassa impedenza9 e un prezzo finanziariamente realistico per l'implementazione in un ^sistema3.

Gli attuali elettrodi commerciali tendono ad essere elettrodi extraneurali o a bracciale (Neural ^Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff ^Electrode11), che si trovano all'esterno del nervo, o intrafascicolari, che penetrano nel nervo e si trovano all'interno del fascicolo di interesse. Tuttavia, poiché gli elettrodi del bracciale si trovano più lontano dalle fibre, raccolgono più rumore dai muscoli vicini e da altri fascicoli che potrebbero non essere il bersaglio. Queste sonde tendono anche a restringere il nervo, che può portare al biofouling - un accumulo di cellule gliali e tessuto cicatriziale - all'interfaccia dell'elettrodo mentre il tessuto guarisce. Gli elettrodi intrafascicolari (come ^LIFE12, ^TIME13 e Utah Arrays14) aggiungono il vantaggio della selettività del fascicolo e hanno un buon rapporto segnale-rumore, che è importante per discriminare i segnali per l'interfacciamento della macchina. Tuttavia, queste sonde hanno problemi di biocompatibilità, con i nervi che si deformano nel tempo3,15,16. Se acquistate commercialmente, entrambe queste sonde hanno design statici senza possibilità di personalizzazione specifica dell'esperimento e sono costose per i laboratori più recenti.

In risposta ai problemi di costo elevato e biocompatibilità presentati da altre sonde, gli elettrodi in fibra di carbonio possono offrire una strada per i laboratori di neuroscienze per costruire le proprie sonde senza la necessità di attrezzature specializzate. Le fibre di carbonio sono un materiale di registrazione alternativo con un fattore di forma ridotto che consente un basso inserimento di danni. Le fibre di carbonio forniscono una migliore biocompatibilità e una risposta cicatriziale notevolmente inferiore rispetto al ^{silicio17,18,19} senza l'intensa lavorazione in camera bianca5,13,14. Le fibre di carbonio sono flessibili, durevoli, facilmente integrabili con altri ^{biomateriali19} e possono penetrare e registrare da ^nerve7,20. Nonostante i numerosi vantaggi delle fibre di carbonio, molti laboratori trovano ardua la fabbricazione manuale di questi array. Alcuni ^gruppi21 combinano fibre di carbonio in fasci che collettivamente si traducono in un diametro maggiore (~ 200 μm); tuttavia, per quanto ne sappiamo, questi fasci non sono stati verificati nel nervo. Altri hanno fabbricato array di elettrodi in fibra di carbonio individuati, sebbene i loro metodi richiedano guide in fibra di carbonio fabbricate in camera ^{bianca22,23,24} e apparecchiature per popolare i loro ^{array17,23,24}. Per risolvere questo problema, proponiamo un metodo per fabbricare un array in fibra di carbonio che può essere eseguito al banco del laboratorio che consente modifiche estemporanee. L'array risultante mantiene le punte degli elettrodi individuate senza strumenti specializzati per il popolamento delle fibre. Inoltre, vengono presentate più geometrie per soddisfare le esigenze dell'esperimento di ricerca. Basandosi su lavori precedenti8,17,22,25, questo documento fornisce metodologie dettagliate per costruire e modificare manualmente diversi stili di array con il minimo tempo di formazione in camera bianca necessario.

Protocollo

Tutte le procedure per gli animali sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali dell'Università del Michigan.

1. Scegliere un array in fibra di carbonio

1. Scegliere un circuito stampato (PCB) da uno dei tre progetti mostrati nella Figura 1.
   NOTA: per questo protocollo, gli array Flex saranno al centro dell'attenzione.
   1. Fare riferimento ai progetti PCB sul sito Web di Chestek Lab (https://chestekresearch.engin.umich.edu), gratuitamente e pronti per essere inviati e ordinati per la stampa tramite una tipografia PCB.
   2. Vedere la Tabella 1 per un riepilogo dei connettori per ogni scheda e le relative specifiche per facilitare la scelta del connettore che funzionerà per la configurazione sperimentale specifica.

2. Saldatura del connettore al circuito stampato

1. Impostare un saldatore a 315 °C (600 °F).
2. Applicare il flusso a tutti i pad di saldatura sul PCB.
   NOTA: il flusso all'interno di un tubo può essere schiacciato attraverso i cuscinetti, mentre il flusso in una pentola può essere applicato con l'estremità in legno di un applicatore con punta di cotone spalmando liberamente il flusso su tutti i cuscinetti.
3. Formare piccoli cumuli di saldatura sui cuscinetti posteriori del Flex Array (Figura 2A).
4. Saldare la fila inferiore di pin del connettore alla fila posteriore di pad di saldatura (Figura 2B).
   NOTA: tutti i progetti di schede forniti dal laboratorio Chestek sono stati progettati in modo che i connettori si accoppiassero esattamente con la scheda designata.
   1. Per fare ciò, saldare i pin su entrambi i lati del connettore con un facile accesso ai tumuli di saldatura. Una volta fissato, spingere delicatamente la punta del saldatore tra i perni anteriori per saldare le connessioni rimanenti nella parte posteriore.
      NOTA: una volta fissata la fila posteriore di pin, il resto del connettore si allineerà con ciascun pin sopra il pad di saldatura assegnato.
5. Saldare la prima fila di perni alla scheda applicando una piccola quantità di saldatura a ciascun pin. Applicare un ulteriore strato di flusso se la saldatura non avviene rapidamente.
   1. Pulire il flusso in eccesso con alcool isopropilico al 100% (IPA) e una spazzola a setole corte.
6. Incapsulare le connessioni saldate in resina epossidica ritardata (Figura 2 C,D) utilizzando un ago da 23 G e una siringa da 1 mL posizionata con smussata lateralmente verso il basso sui perni. Spingere lentamente la resina epossidica attraverso la siringa in modo che scorra dentro e lungo le connessioni.
   1. Lasciare la scheda durante la notte in modo che la resina epossidica ritardata possa polimerizzare.
      NOTA: Mentre l'inserto del prodotto per il set epossidico ritardato afferma che polimerizza in 30 minuti, lasciarlo durante la notte consente di formare una connessione più stabile.
7. Fissare il retro della scheda ai lati del connettore posando una piccola linea di resina epossidica ritardata sul lato posteriore della scheda e tirandola sui bordi del connettore.
   1. Lascia la tavola per curare di nuovo durante la notte.
      Nota : a questo punto, archiviare le matrici o continuare la compilazione. Se si ferma nella build, conservare gli array in una scatola pulita e asciutta a temperatura ambiente.

3. Popolazione di fibre

1. Tagliare un capillare di vetro tirato in modo che la sua punta si inserisca tra le tracce dell'array (Figura 3A).
   1. Usando un estrattore di vetro e un filamento, crea capillari usando le seguenti impostazioni: Calore = 900, Pull = 70, Velocità = 35, Tempo = 200, Pressione = 900.
      NOTA: i numeri sono senza unità e specifici per questo dispositivo (vedere la Tabella dei materiali).
2. Utilizzare le estremità in legno di due applicatori con punta di cotone (uno per ogni parte di resina epossidica d'argento) per raccogliere un piccolo rapporto ~ 1: 1 di resina epossidica d'argento in un piatto di plastica e mescolare usando gli stessi bastoncini usati per raccogliere. Scartare gli applicatori dopo la miscelazione.
3. Tagliare 2-4 mm dall'estremità del fascio in fibra di carbonio su un pezzo di carta per stampanti usando una lama di rasoio. Per separare facilmente le fibre nel fascio, che sono difficili da separare, tirare delicatamente un pezzo di carta laminato sopra la parte superiore del fascio.
   NOTA: Il pezzo di carta laminato trasferisce la statica nelle fibre, che si separeranno da sole.
4. Applicare resina epossidica d'argento tra ogni altra coppia di tracce su un lato della tavola con il capillare di vetro (Figura 3B).
   1. Prendi una piccola goccia di resina epossidica all'estremità di un capillare tirato. Applicare delicatamente tra ogni altra traccia all'estremità della scheda, riempiendo lo spazio.
      NOTA: lo spazio deve essere riempito fino alla parte superiore delle due tracce senza traboccare per toccare le tracce vicine. Ogni traccia è collegata a un canale. Questo metodo di popolazione epossidica significa che ogni fibra avrà due canali collegati ad essa. Questo perché due tracce consentono un migliore allineamento della fibra e la ridondanza nel canale aiuta a garantire la connessione elettrica.
5. Utilizzare pinzette rivestite in teflon per posizionare una fibra di carbonio in ogni traccia epossidica (Figura 3C).
6. Utilizzare un capillare tirato pulito per regolare le fibre di carbonio, in modo che siano perpendicolari all'estremità della scheda Flex Array e sepolte sotto la resina epossidica (Figura 3D).
7. Posizionare gli array su un blocco di legno con estremità in fibra a strapiombo sul bordo del blocco.
   NOTA: il peso del back-end manterrà l'array sul blocco.
8. Cuocere il blocco di legno e le matrici a 140 °C per 20 minuti per polimerizzare la resina epossidica d'argento e bloccare le fibre in posizione.
9. Ripetere i passaggi da 3,4 a 3,8 per l'altro lato della scheda.
   NOTA: gli array possono essere memorizzati dopo qualsiasi fase di cottura; tuttavia, la statica dalle scatole di stoccaggio può causare l'allontanamento delle fibre dalla scheda se è stata applicata troppo poca resina epossidica d'argento durante il popolamento della scheda.
   1. Creare una piattaforma adesiva rialzata all'interno di una scatola in modo che la maggior parte della scheda possa essere attaccata all'adesivo consentendo alle estremità in fibra della scheda di essere sospese all'interno della scatola per evitare la rottura della fibra. Conservare a temperatura ambiente.
      NOTA: se le fibre si allontanano dalla scheda durante lo stoccaggio, raschiare la resina epossidica dalle tracce con un capillare di vetro tirato pulito e ripetere i passaggi 3.1-3.8 per sostituire le fibre. Da questo punto in poi, gli array devono essere conservati con le fibre sospese in questo modo per evitare la rottura della fibra.

4. Applicazione di resina epossidica ultravioletta (UV) per isolare le fibre di carbonio

1. Utilizzare un capillare pulito e applicare una piccola goccia (~ 0,5 mm di diametro di resina epossidica UV sulle tracce esposte su un lato della scheda (Figura 4A). Continuare ad aggiungere goccioline epossidiche UV fino a quando le tracce non sono completamente coperte.
   NOTA: non lasciare che la resina epossidica UV penetri sulle fibre di carbonio oltre l'estremità del PCB per garantire un inserimento regolare in seguito.
2. Polimerizzare la resina epossidica UV sotto una pen light UV per 2 minuti (Figura 4B).
3. Ripetere i passaggi 4.1-4.2 per l'altro lato della scheda.
4. Tagliare le fibre a 1 mm usando un reticolo stereoscopico e forbici chirurgiche.
   NOTA: le matrici possono essere memorizzate a questo punto fino a quando non sono pronte per procedere ai passaggi successivi. Dovrebbero essere conservati in una scatola che eleverà le fibre di carbonio lontano dalla scatola stessa. Gli array possono essere conservati a temperatura ambiente a tempo indeterminato.

5. Controllo dei collegamenti elettrici con scansioni di impedenza a 1 kHz (Figura 5)

1. Immergere le fibre di carbonio di 1 mm in 1x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS).
2. Per completare il circuito, utilizzare un cloruro argento-argento (Ag| AgCl) elettrodo di riferimento e un'asta in acciaio inossidabile (controelettrodo).
   1. Utilizzando un morsetto per becher, sospendere l'Ag| Elettrodo AgCl nel PBS 1x e collegarlo al riferimento del sistema di impedenza in uso.
   2. Utilizzando un morsetto per becher, sospendere l'asta di acciaio inossidabile nel PBS 1x e collegarsi all'ingresso del controelettrodo del sistema di impedenza utilizzato.
3. Eseguire una scansione dell'impedenza di 1 kHz per ogni fibra utilizzando un potenziostato impostato su una frequenza di scansione di 1 kHz a 0,01 Vrms in una singola forma d'onda _sinusoidale . Impostare il potenziostato su 0 V all'inizio di ogni scansione per 5 s per stabilizzare il segnale registrato. Registrare le misurazioni tramite il software associato al potenziostato.
   NOTA: le misurazioni possono essere effettuate in qualsiasi punto della costruzione; tuttavia, sono necessari solo prima dell'isolamento e durante la preparazione della punta. La tabella 2 elenca gli intervalli tipici di impedenze dopo ogni fase di costruzione a 1 kHz per riferimento dell'utente.
4. Risciacquare le fibre in acqua deionizzata (DI) immergendole in un piccolo becher tre volte e lasciarle asciugare a temperatura ambiente.
   NOTA: gli array possono essere lasciati in archivio fino a quando l'utente non può continuare con il passaggio successivo.

6. Isolamento Parylene C

NOTA: Parylene C è stato scelto come materiale isolante per le fibre di carbonio in quanto può essere depositato a temperatura ambiente su lotti di array e fornisce un rivestimento altamente conforme.

1. Mascherare il connettore Flex Array utilizzando il connettore di accoppiamento.
2. Posizionare un lotto di 8-12 array in una scatola di stoccaggio con una piattaforma adesiva rialzata in modo che possano essere isolati in un'unica corsa. Posizionare gli array in modo che l'estremità del connettore dell'array si trovi sulla piattaforma adesiva con l'estremità in fibra dell'array sporgente (Figura 6) per evitare che le fibre si attacchino all'adesivo e si stacchino e per garantire un rivestimento parylene uniforme sulle fibre.
3. Rivestire gli array in un sistema di deposizione Parylene C a uno spessore di 800 nm in una camera bianca, indossando adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI) come definito dalla singola camera bianca utilizzata.
   NOTA: Qui, i DPI sono stati definiti come scarpe da camera bianca, tuta, copricapo, occhiali, maschera e guanti in lattice. Va notato che questo è un DPI standard per entrare in una camera bianca. Questo passaggio può essere esternalizzato a un'azienda di rivestimento Parylene a pagamento; tuttavia, un servizio commerciale può essere in grado di rivestire più array contemporaneamente. Ogni sistema di deposizione di Parylene C può avere diverse precauzioni di sicurezza. Contattare il tecnico prima dell'uso per garantire la sicurezza dell'utente.
4. Rimuovere il connettore di accoppiamento utilizzato come maschera dal Flex Array.
5. Posizionare gli array in una nuova scatola per l'archiviazione fino al momento dell'uso.

7. Metodi di preparazione della punta

NOTA: due preparazioni di punta in questa sezione utilizzano laser per tagliare le fibre. I DPI adeguati, come gli occhiali resistenti alle lunghezze d'onda utilizzate, dovrebbero sempre essere indossati quando si utilizza il laser e anche altri utenti di laboratorio nelle vicinanze del laser dovrebbero essere in DPI. Sebbene le lunghezze delle fibre elencate in questi passaggi siano lunghezze consigliate, gli utenti possono provare qualsiasi lunghezza adatta alle loro esigenze. L'utente deve scegliere uno dei seguenti metodi di preparazione della punta poiché il taglio a forbice da solo non sarà sufficiente per riesporre l'elettrodo25.

1. Granato di alluminio di ittrio drogato al neodimio (Nd: YAG) tagliato al laser
   1. Tagliare le fibre a 550 μm con le forbici chirurgiche.
   2. Utilizzare un laser pulsato Nd:YAG da 532 nm (5 mJ/impulso, durata 5 ns, 900 mW) per tagliare 50 μm dalla punta delle fibre per riesporre il carbonio sotto il Parylene C (di solito richiede 2-3 impulsi).
      1. Allineare le punte in fibra utilizzando lo stereoscopio integrato fornito con questo sistema laser.
         NOTA: Questo sistema consente all'utente di allineare una finestra (qui, 50 μm x 20 μm (altezza x larghezza)) è stata utilizzata per comprendere l'estremità della fibra.
      2. Focalizza lo stereoscopio sull'estremità della fibra con un ingrandimento di 500x per un taglio accurato e preciso.
         NOTA: Parylene C si abla leggermente (<10 μm) dalla punta lasciando una punta smussata e cilindrica.
2. Affilatura fiamma ossidrica25,26,27
   1. Tagliare le fibre a 300 μm con le forbici chirurgiche.
   2. Immergere l'array in un piatto di acqua deionizzata, il connettore verso il basso e fissato al fondo del piatto con una piccola quantità di stucco.
   3. Utilizzare una fotocamera a penna per allineare le fibre con la superficie dell'acqua in modo che le fibre tocchino a malapena la superficie dell'acqua.
   4. Regolare una fiamma della fiamma della fiamma ossidrica a butano a 3-5 mm e farla scorrere sulla parte superiore delle fibre in un movimento avanti e indietro per affilare le fibre.
      NOTA: le punte in fibra si illuminano di arancione quando la fiamma passa sopra di esse.
   5. Rimuovere l'array dallo stucco e ispezionarlo sotto uno stereoscopio per punte appuntite con ingrandimento 50x.
      NOTA: se si osservano punte appuntite, non è necessaria alcuna ulteriore fiamma ossidrica. Se le punte appaiono smussate, ripetere i passaggi 7.2.2-7.2.5.
3. Taglio laser ^UV28
   NOTA: il laser UV può essere utilizzato solo su progetti a forza di inserimento zero (ZIF) e Wide Board al momento a causa del grande punto focale del laser UV utilizzato che è più grande del passo delle fibre di carbonio Flex Array.
   1. Tagliare le fibre di carbonio a 1 mm con le forbici chirurgiche.
   2. Applicare un laser UV a tre stadi motorizzati configurati ortogonalmente.
      NOTA: Il laser UV è un semiconduttore multimodale al nitruro di indio gallio (InGaN) con potenza di uscita di 1,5 W e lunghezza d'onda di 405 nm.
      1. Assicurarsi che il laser abbia un raggio continuo per un allineamento e un taglio rapidi ed efficaci.
   3. Fissare l'array in posizione per mantenere un piano fermo e livellato di elettrodi in modo che il laser possa passare sopra. Assicurarsi che l'array sia tenuto a una distanza appropriata dal laser in modo che le fibre siano in luce con il punto focale del laser. Per fare ciò, fornire una potenza inferiore al laser e regolare la distanza per concentrarsi al meglio sulla ^fibra28.
   4. Spostare il punto focale del laser UV sul piano della fibra ad una velocità di 25 μm/s per tagliare le fibre alla lunghezza desiderata (qui, tutte le fibre vengono tagliate a 500 μm).
      NOTA: le fibre emetteranno una luce intensa prima di essere tagliate. Conservare le fibre dopo il trattamento fino a quando non sono pronte per essere rivestite con un polimero conduttivo.

8. Rivestimento conduttivo poli(3,4-etilendiossitiofene):p-toluensolfonato (PEDOT:pTS) per impedenza ridotta

1. Mescolare soluzioni di 0,01 M 3,4-etilendiossitiofene e 0,1 M sodio p-toluensolfonato in 50 mL di acqua DI e mescolare per una notte su una piastra di agitazione (~ 450 rpm) o fino a quando non si possono osservare particelle nella soluzione.
   NOTA: Conservare la soluzione in un contenitore resistente alla luce. Conservare in frigorifero la soluzione dopo la miscelazione per mantenere la soluzione utilizzabile per un massimo di 30 giorni.
2. Eseguire una scansione dell'impedenza a 1 kHz utilizzando gli stessi parametri di prima (passaggi 5.2-5.3) in 1x PBS. Si noti quali fibre hanno una buona connessione (<1 MΩ, in genere 14-16 di 16 fibre).
3. Piastra elettrolitica con PEDOT:pTS per abbassare l'impedenza degli elettrodi.
   1. Immergere le punte in fibra nella soluzione PEDOT:pTS.
   2. Seguire i passaggi superati nel passaggio 5.2, commutando la soluzione PBS 1x per PEDOT:pTS e accorciando tutte le connessioni alla scheda al canale corrente applicato.
   3. Applicare 600 pA per buona fibra per 600 s utilizzando un potenziostato.
   4. Spegnere la cella e lasciarla riposare per 5 s alla fine della corsa.
4. Rimuovere le fibre dalla soluzione e sciacquarle in acqua DI.
5. Riprendere le impedenze a 1 kHz per verificare che le fibre siano state rivestite correttamente (utilizzare gli stessi parametri elencati nei passaggi 5.2-5.3).
   NOTA: le fibre buone sono designate come qualsiasi fibra con un'impedenza inferiore a 110 kΩ.

9. Collegamento di fili di terra e di riferimento

1. Raschiare delicatamente Via Parylene C da terra e le vie di riferimento sulla scheda usando una pinzetta. Accorciare il terreno e le vie di riferimento insieme in coppia su questo design della scheda.
   NOTA: le vie di terra e di riferimento si trovano vicino al connettore sull'array Flex e sono i quattro piccoli cerchi dorati vicino ai connettori. Gli utenti dovranno solo rimuovere Parylene C dalle vie più vicine alle fibre di carbonio per le misurazioni.
2. Tagliare due lunghezze di 5 cm di filo d'argento isolato con una lama di rasoio. Deinsulare le estremità dei fili a 2-3 mm da un'estremità da fissare al Flex Array e ~ 10 mm dalle estremità opposte per consentire una più facile messa a terra e referenziazione durante l'intervento chirurgico.
3. Riscaldare il saldatore a 600 ° F. Applicare una piccola quantità di flusso alle vie.
4. Inserire un filo (estremità esposta da 2-3 mm) in ciascuna delle vie ePhys sulla scheda. Applicare la saldatura sulla parte superiore delle vie (Figura 7A). Lasciare raffreddare la sonda, quindi capovolgerla per applicare una piccola quantità di saldatura sul retro della via (Figura 7A).
5. Utilizzando le forbici chirurgiche, tagliare via qualsiasi filo esposto che sporge dal tumulo di saldatura posteriore in quanto ciò aiuta a ridurre il rumore visto nella registrazione (Figura 7B).
6. Riposizionare gli array nella scatola di stoccaggio, piegando i fili all'indietro e lontano dalla fibra. Fissare i fili sul nastro adesivo per evitare potenziali interazioni fibra-filo (Figura 7C).

10. Procedura chirurgica

NOTA: La corteccia di ratto è stata utilizzata per testare l'efficacia delle fibre preparate al laser UV come descritto in ^{precedenza7,20}. Queste sonde funzioneranno in nervo a causa della loro geometria e dei livelli di impedenza simili alle fibre preparate con fiamma ossidrica. Questo intervento chirurgico è stato eseguito con molta cautela per convalidare che il laser UV non ha cambiato la risposta degli elettrodi.

1. Anestetizzare un ratto Long Evans maschio adulto utilizzando una combinazione di ketamina (90 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg). Confermare l'anestesia con un test del pizzico della punta. Applicare un unguento sugli occhi per evitare che gli occhi del ratto si secchino durante l'intervento chirurgico.
2. Creare una craniotomia di 2 mm x 2 mm sopra la corteccia motoria dell'emisfero destro. Identificare l'angolo inferiore sinistro della craniotomia misurando 1 mm anteriore di bregma e 1 mm laterale della linea mediana.
3. Montare l'array in uno strumento stereotassico e azzerare lo strumento stereotassico sulla dura abbassando delicatamente le fibre fino a quando non toccano la superficie della dura. Sollevare l'array lontano dal sito chirurgico e spostarlo di lato fino a quando non è pronto per l'inserimento.
4. Resettare la dura tirando delicatamente un ago con un'estremità spinata sulla superficie del tessuto. Una volta che una parte della dura si apre al cervello, usa un paio di pinze sottili per aiutare ulteriormente a tirare via la dura.
5. Inserire le fibre nella craniotomia e 1,2 mm nel cervello utilizzando uno strumento stereotassico, abbassando lentamente a mano.
6. Registra i dati ePhys per 10 minuti con un headstage e un preamplificatore specifici per ePhys.
   1. Impostare il filtro passa-alto del preamplificatore per elaborare il segnale a 2,2 Hz, le antialie a 7,5 kHz e il campione a 25 kHz.
      NOTA: per queste misurazioni, viene registrata solo l'attività spontanea. Non viene applicato alcuno stimolo.
7. Eutanasia
   1. Posizionare il ratto sotto isoflurano al 5% sotto 1 L/min di ossigeno fino a quando i segni di vita non sono cessati (20-30 min). Confermare l'eutanasia con decapitazione.

11. Ordinamento dei picchi

1. Utilizzare un software di ordinamento spike per ordinare e analizzare i dati utilizzando metodi precedentemente ^segnalati8.
2. Utilizzare un filtro passa-alto su tutti i canali (angolo a 250 Hz, Butterworth di 4^° ordine) e impostare il livello di rilevamento della forma d'onda su -3,5 × soglia RMS.
   1. Utilizzare un modello gaussiano per raggruppare e picchi con caratteristiche simili. Combinare e mediare cluster di almeno 10 forme d'onda da includere in ulteriori analisi.
   2. Eliminare o eliminare tutte le forme d'onda che non sono picchi dal set di dati.
3. Esporta i dati una volta che tutti i canali sono stati ordinati e utilizza un software di analisi per tracciare e analizzare ulteriormente le forme d'onda.

12. Imaging a scansione al microscopio elettronico (SEM)

NOTA: questo passaggio renderà le matrici inutilizzabili e deve essere utilizzato solo per ispezionare i risultati del trattamento della punta per verificare che le matrici vengano elaborate correttamente. Non è necessario eseguire questo passaggio per creare una matrice di successo. Di seguito è riassunta una descrizione generale del processo SEM; tuttavia, gli utenti che non hanno precedentemente utilizzato SEM dovrebbero ricevere aiuto da un utente addestrato.

1. Tagliare l'estremità in fibra del PCB e montarlo su uno stub SEM mascherato con nastro di carbonio. Posizionare gli array su una piccola piattaforma di nastro di carbonio impilato (4-5 strati) per evitare che le fibre di carbonio si attacchino allo stub SEM.
2. Sputter-rivestire le matrici con oro (100-300 Å) seguendo le procedure descritte dal produttore del rivestimento sputter d'oro.
3. Per ispezionare gli effetti del trattamento della punta, visualizzare gli array in un SEM a una distanza di lavoro di 15 mm e una resistenza del fascio di 20 kV.
   NOTA: le matrici possono essere visualizzate senza sputter-coating sotto un basso vuoto, come mostrato nella Figura 8D per le fibre tagliate al laser UV. Per questa configurazione, si consiglia di avere una distanza di lavoro di 11-12 mm e una resistenza del fascio di 4 kV.

Risultati

Convalida del suggerimento: immagini SEM
Lavori ^precedenti20 hanno dimostrato che il taglio a forbice ha provocato impedenze inaffidabili poiché Parylene C si è piegato attraverso il sito di registrazione. Il taglio a forbice viene utilizzato qui solo per tagliare le fibre alla lunghezza desiderata prima della lavorazione con un metodo di taglio di finitura aggiuntivo. Le immagini SEM delle punte sono state utilizzate per determinare la lunghezza del carbonio esposto e la geo...

Discussione

Sostituzioni di materiali
Mentre tutti i materiali utilizzati sono riassunti nella Tabella dei materiali, pochissimi dei materiali devono provenire da fornitori specifici. La scheda Flex Array deve provenire dal fornitore elencato in quanto è l'unica azienda in grado di stampare la scheda flessibile. Anche il connettore Flex Array deve essere ordinato dal fornitore elencato in quanto si tratta di un connettore proprietario. Il parylene C è altamente raccomandato come materiale isola...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 prong clams	05-769-6Q	Fisher	Qty: 2 Unit Cost (USD): 20
3,4-ethylenedioxythiophene (25 g) (PEDOT)	96618	Sigma-Aldrich	Qty: 1 Unit Cost (USD): 102
353ND-T Epoxy (8oz)++ (ZIF and Wide Board Only)	353ND-T/8OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 48
Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3)	50-854-570	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 100
Autolab	PGSTAT12	Metrohm
Blowtorch	1WG61	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 36
Carbon Fibers	T-650/35 3K	Cytec Thornel	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Carbon tape	NC1784521	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 27
Cotton Tipped Applicator	WOD1002	MediChoice	Qty: 1 Unit Cost (USD): 0.57
Delayed Set Epoxy++	1FBG8	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
DI Water	n/a	n/a	Qty: n/a Unit Cost (USD): n/a
Dumont Tweezers #5	50-822-409	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 73
Flex Array**	n/a	MicroConnex	Qty: 1 Unit Cost (USD): 68
Flux	SMD291ST8CC	DigiKey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 13
Glass Capillaries (pack of 350)	50-821-986	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 60
Glass Dish	n/a	n/a	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Hirose Connector (ZIF Only)	H3859CT-ND	DigiKey	Qty: 2 Unit Cost (USD): 2
Light-resistant Glass Bottle	n/a	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Heating Filiment	FB315B	Sutter Instrument Co	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Puller	P-97	Sutter Instrument Co	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Nitrile Gloves (pack of 200)	19-041-171C	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 47
Offline Sorter software	n/a	Plexon	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Omnetics Connector* (Flex Array Only)	A79025-001	Omnetics Inc	Qty: 1 Unit Cost (USD): 35
Omnetics Connector* (Flex Array Only)	A79024-001	Omnetics Inc	Qty: 1 Unit Cost (USD): 35
Omnetics to ZIF connector	ZCA-OMN16	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Pin Terminal Connector (Wide Board Only)	ED11523-ND	DigiKey	Qty: 16 Unit Cost (USD): 10
Probe storage box	G2085	Melmat	Qty: 1 Unit Cost (USD): 2
Razor Blade	4A807	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 2
SEM post	16327	lnf	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
Silver Epoxy (1oz)++	H20E/1OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 125
Silver GND REF wires	50-822-122	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 423.2
Sodium p-toulenesulphonate(pTS)- 100g	152536	Sigma-Aldrich	Qty: 1 Unit Cost (USD): 59
Solder	24-6337-9703	DigiKey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 60
Soldering Iron Tip	T0054449899N-ND	Digikey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 13
Soldering Station	WD1002N-ND	Digikey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 374
SpotCure-B UV LED Cure System	n/a	FusionNet LLC	Qty: 1 Unit Cost (USD): 895
Stainless steel rod	n/a	n/a	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Stir Plate	n/a	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Surgical Scissors	08-953-1B	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 100
TDT Shroud (ZIF Only)	Z3_ZC16SHRD_RSN	TDT	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3.5
Teflon Tweezers	50-380-043	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 47
UV & Visible Light Safety Glassees	92522	Loctite	Qty: 1 Unit Cost (USD): 45
UV Epoxy (8oz)++ (Flex Array Only)	OG142-87/8OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 83
UV Laser	n/a	WER	Qty: 1 Unit Cost (USD): 30
Weigh boat (pack of 500)	08-732-112	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 58
Wide Board+	n/a	Advanced Circuits	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
ZIF Active Headstage	ZC16	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): 925
ZIF Passive Headstage	ZC16-P	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): 625
ZIF*	n/a	Coast to Coast Circuits	Qty: 1 Unit Cost (USD): 9