Инструментарий с открытым исходным кодом: настольный микроэлектрод из углеродного волокна для записи нервов

Резюме

Здесь мы описываем методологию изготовления настраиваемых электродных массивов из углеродного волокна для записи in vivo в нерве и мозге.

Аннотация

Обычные зонды периферических нервов в основном изготавливаются в чистой комнате, требующей использования нескольких дорогостоящих и узкоспециализированных инструментов. В этой статье представлен «легкий» процесс изготовления матриц нейронных электродов из углеродного волокна, который может быть быстро изучен неопытным пользователем чистой комнаты. Этот процесс изготовления электродных массивов из углеродного волокна требует только одного инструмента для чистых помещений, машины для осаждения парилена C, которая может быть быстро изучена или передана на аутсорсинг коммерческому перерабатывающему предприятию по предельным ценам. Этот процесс изготовления также включает в себя ручную установку печатных плат, изоляцию и оптимизацию наконечников.

Три различные оптимизации наконечников, рассмотренные здесь (лазер Nd: YAG, паяльная лампа и УФ-лазер), приводят к диапазону геометрии наконечника и импедансам 1 кГц, причем волокна паяльной лампы приводят к наименьшему импедансу. В то время как предыдущие эксперименты доказали эффективность электродов лазера и паяльной лампы, эта статья также показывает, что волокна ультрафиолетовой лазерной резки могут записывать нейронные сигналы in vivo. Существующие массивы из углеродного волокна либо не имеют индивидуализированных электродов в пользу пучков, либо требуют изготовленных в чистых помещениях направляющих для населения и изоляции. Предлагаемые массивы используют только инструменты, которые могут быть использованы на столешнице для популяции волокон. Этот процесс изготовления электродов из углеродного волокна позволяет быстро настраивать объемное изготовление массива по сниженной цене по сравнению с коммерчески доступными зондами.

Введение

Большая часть исследований в области неврологии опирается на запись нейронных сигналов с использованием электрофизиологии (ePhys). Эти нейронные сигналы имеют решающее значение для понимания функций нейронных сетей и новых медицинских методов лечения, таких как мозговая машина и периферические нервные интерфейсы1,2,3,4,5,6. Исследования, связанные с периферическими нервами, требуют изготовленных на заказ или коммерчески доступных нейронных регистрирующих электродов. Нейронные регистрирующие электроды — уникальные инструменты с микронными размерами и хрупкими материалами — требуют специализированного набора навыков и оборудования для изготовления. Были разработаны различные специализированные зонды для конкретных конечных целей; однако это означает, что эксперименты должны разрабатываться вокруг имеющихся в настоящее время коммерческих зондов, или лаборатория должна инвестировать в разработку специализированного зонда, что является длительным процессом. Из-за широкого разнообразия нейронных исследований в периферических нервах существует высокий спрос на универсальный зонд ePhys4,7,8. Идеальный зонд ePhys должен иметь небольшой сайт записи, низкое ^{сопротивление9} и финансово реалистичную цену для реализации в ^{системе3}.

Современные коммерческие электроды, как правило, являются либо вненейронными, либо манжетными электродами (Neural ^Cuff10, MicroProbes Nerve Cuff ^Electrode11), которые находятся вне нерва, либо внутрифасцикулярными, которые проникают в нерв и сидят внутри интересующей фасцикулы. Однако, поскольку манжеты электроды находятся дальше от волокон, они улавливают больше шума от близлежащих мышц и других фасцикул, которые могут не быть мишенью. Эти зонды также имеют тенденцию сжимать нерв, что может привести к биообрастанию - накоплению глиальных клеток и рубцовой ткани - на границе раздела электрода, в то время как ткань заживает. Внутрифасцикулярные электроды (такие как ^LIFE12, ^TIME13 и Utah Arrays14) добавляют преимущество селективности фасцикул и имеют хорошее отношение сигнал/шум, что важно для распознавания сигналов для взаимодействия машины. Тем не менее, эти зонды имеют проблемы с биосовместимостью, когда нервы деформируются с течением времени3,15,16. При покупке на коммерческой основе оба этих зонда имеют статические конструкции без возможности настройки для конкретного эксперимента и являются дорогостоящими для новых лабораторий.

В ответ на высокую стоимость и проблемы биосовместимости, представленные другими зондами, электроды из углеродного волокна могут предложить лабораториям неврологии возможность создавать свои собственные зонды без необходимости в специализированном оборудовании. Углеродные волокна являются альтернативным записывающим материалом с небольшим форм-фактором, который позволяет вставлять с низким уровнем повреждения. Углеродные волокна обеспечивают лучшую биосовместимость и значительно более низкий отклик рубцов, чем кремний17,18,19 без интенсивной обработки в чистых помещениях5,13,14. Углеродные волокна являются гибкими, долговечными, легко интегрируются с другими ^{биоматериалами19} и могут проникать и записывать из ^{нерва7,20}. Несмотря на многие преимущества углеродных волокон, многие лаборатории считают ручное изготовление этих массивов трудным. Некоторые ^{группы21} объединяют углеродные волокна в пучки, которые в совокупности приводят к большему (~200 мкм) диаметру; однако, насколько нам известно, эти пучки не были проверены в нервах. Другие изготовили индивидуальные электродные решетки из углеродного волокна, хотя их методы требуют изготовленных из чистых помещений направляющих из углеродного ^{волокна22,23,24} и оборудования для заполнения их массивов17,23,24. Чтобы решить эту проблему, мы предлагаем метод изготовления массива из углеродного волокна, который может быть выполнен на лабораторной столешнице, что позволяет проводить импровизированные модификации. Полученный массив поддерживает индивидуальные наконечники электродов без специализированных инструментов для заполнения волокон. Кроме того, представлены несколько геометрий, чтобы соответствовать потребностям исследовательского эксперимента. Основываясь на предыдущих работах8,17,22,25, в этом документе представлены подробные методологии построения и изменения нескольких стилей массивов вручную с минимальным временем обучения в чистых помещениях.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Мичиганского университета.

1. Выбор массива из углеродного волокна

1. Выберите печатную плату (PCB) из одной из трех конструкций, показанных на рисунке 1.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого протокола в центре внимания будут Flex Arrays.
   1. Обратитесь к дизайну печатных плат на веб-сайте Chestek Lab (https://chestekresearch.engin.umich.edu), бесплатно и готовых к отправке и заказу для печати через типографию печатных плат.
   2. В таблице 1 приведена сводка разъемов для каждой системной платы и их спецификаций, чтобы помочь выбрать разъем, который будет работать для конкретной экспериментальной установки.

2. Пайка разъема к печатной плате

1. Установите паяльник на 315 °C (600 °F).
2. Нанесите флюс на все паяльные прокладки на печатной плате.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Флюс внутри трубки может быть сжат поперек прокладок, в то время как флюс в горшке может быть нанесен деревянным концом аппликатора с хлопковым наконечником, обильно размазывая флюс по всем прокладкам.
3. Образуют небольшие насыпи припоя на задних подушечках Flex Array (рисунок 2А).
4. Припаяйте нижний ряд контактов разъема к заднему ряду паяльных колодок (рисунок 2B).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все конструкции плат, предоставленные лабораторией Chestek, были спроектированы таким образом, чтобы разъемы точно соединялись с обозначенной платой.
   1. Для этого припаяйте контакты по обе стороны от разъема с легким доступом к паяльным насыпям. После закрепления осторожно продвиньте наконечник паяльника между передними штифтами, чтобы припаять оставшиеся соединения сзади.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Как только задний ряд контактов будет закреплен, остальная часть разъема выровняется с каждым контактом над назначенной паяльной панелью.
5. Припаяйте передний ряд штифтов к плате, нанеся небольшое количество припоя на каждый штифт. Нанесите дополнительный слой флюса, если пайка происходит не быстро.
   1. Очистите лишний флюс 100% изопропиловым спиртом (IPA) и короткой щетиной щеткой.
6. Инкапсулируйте спаянные соединения в эпоксидную смолу с замедленным набором (рисунок 2 C, D) с помощью иглы 23 G и шприца 1 мл, размещенного конической стороной вниз на штифтах. Медленно проталкивайте эпоксидную смолу через шприц, чтобы она стекала в соединения и вдоль них.
   1. Оставьте доску на ночь, чтобы отсроченная эпоксидная смола могла затвердеть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как вставка продукта для отложенного набора эпоксидной смолы заявляет, что она отверждается за 30 минут, оставляя ее на ночь, она позволяет сформировать более стабильное соединение.
7. Закрепите заднюю сторону платы по бокам разъема, уложив небольшую линию эпоксидной смолы с задержкой поперек задней стороны платы и потянув ее на края разъема.
   1. Оставьте доску, чтобы вылечиться на ночь снова.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе либо сохраните массивы, либо продолжите сборку. При паузе в сборке храните массивы в чистом сухом ящике при комнатной температуре.

3. Популяция волокон

1. Вырежьте натянутый стеклянный капилляр так, чтобы его кончик поместился между следами массива (рисунок 3А).
   1. Используя стеклянный съемник и нить накаливания, сделайте капилляры, используя следующие настройки: Тепло = 900, Тяга = 70, Скорость = 35, Время = 200, Давление = 900.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Номера не имеют единиц измерения и специфичны для данного устройства (см. Таблицу материалов).
2. Используйте деревянные концы двух аппликаторов с хлопковыми наконечниками (по одному на каждую часть серебряной эпоксидной смолы), чтобы зачерпнуть небольшое соотношение серебряной эпоксидной смолы ~1: 1 в пластиковой посуде и смешать, используя те же палочки, которые использовались для зачерпывания. Выбросьте аппликаторы после перемешивания.
3. Отрежьте 2-4 мм от конца пучка углеродного волокна на листе бумаги для принтера лезвием бритвы. Чтобы легко отделить волокна в пучке, которые трудно разделить, аккуратно потяните ламинированный лист бумаги поверх пучка.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Ламинированный лист бумаги переносит статику в волокна, которые будут отделяться сами по себе.
4. Нанесите серебряную эпоксидную смолу между каждой другой парой следов на одной стороне доски с помощью стеклянного капилляра (рисунок 3B).
   1. Возьмите небольшую каплю эпоксидной смолы на конец вытянутого капилляра. Аккуратно нанесите между всеми остальными следами на конце доски, заполняя зазор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Зазор должен быть заполнен до верхушки двух следов, не переполняясь, чтобы коснуться соседних следов. Каждая трассировка подключена к одному каналу. Этот метод эпоксидной популяции означает, что каждое волокно будет иметь два канала, подключенных к нему. Это связано с тем, что две трассировки обеспечивают лучшее выравнивание волокон, а избыточность в канале помогает обеспечить электрическое соединение.
5. Используйте пинцет с тефлоновым покрытием, чтобы поместить одно углеродное волокно в каждый эпоксидный след (рисунок 3C).
6. Используйте чистый вытянутый капилляр для регулировки углеродных волокон, чтобы они были перпендикулярны концу платы Flex Array и похоронены под эпоксидной смолой (рисунок 3D).
7. Поместите массивы на деревянный блок с волокнистыми концами, нависающими над краем блока.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вес серверной части будет удерживать массив на блоке.
8. Выпекайте деревянный блок и массивы при 140 °C в течение 20 минут, чтобы вылечить серебряную эпоксидную смолу и зафиксировать волокна на месте.
9. Повторите шаги 3.4-3.8 для другой стороны платы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Массивы могут храниться после любого этапа выпечки; однако статичность из ящиков для хранения может привести к отрыву волокон от платы, если при заполнении платы было применено слишком мало серебряной эпоксидной смолы.
   1. Создайте приподнятую клеевую платформу внутри коробки, чтобы основная часть доски могла быть приклеена к клею, позволяя подвешивать волокнистые концы доски внутри коробки, чтобы предотвратить разрыв волокна. Хранить при комнатной температуре.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если волокна отрываются от платы во время хранения, соскоблите эпоксидную смолу из следов чистым натянутым стеклянным капилляром и повторите шаги 3.1-3.8 для замены волокон. С этого момента массивы должны храниться с волокнами, взвешенными таким образом, чтобы предотвратить разрыв волокна.

4. Применение ультрафиолетовой (УФ) эпоксидной смолы для изоляции углеродных волокон

1. Используйте чистый капилляр и нанесите небольшую каплю (~0,5 мм в диаметре УФ-эпоксидной смолы на открытые следы на одной стороне доски (рисунок 4A). Продолжайте добавлять капли УФ-эпоксидной смолы до тех пор, пока следы не будут полностью покрыты.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте УФ-эпоксидной смоле проникать на углеродные волокна через конец печатной платы, чтобы обеспечить плавное введение позже.
2. Отверните УФ-эпоксидную смолу под ультрафиолетовым пером в течение 2 мин (рисунок 4B).
3. Повторите шаги 4.1-4.2 для другой стороны платы.
4. Разрежьте волокна до 1 мм с помощью стереоскопа сетки и хирургических ножниц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Массивы могут храниться на этом этапе до тех пор, пока они не будут готовы перейти к следующим шагам. Их следует хранить в коробке, которая поднимет углеродные волокна от самой коробки. Массивы могут храниться при комнатной температуре неограниченное время.

5. Проверка электрических соединений с помощью сканирования импеданса 1 кГц (рисунок 5)

1. Погрузите углеродные волокна на 1 мм в 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
2. Чтобы завершить схему, используйте серебро-серебристый хлорид (Ag| AgCl) опорный электрод и стержень из нержавеющей стали (встречный электрод).
   1. Используя зажим для стакана, подвешивайте Ag| Электрод AgCl в 1x PBS и подключите его к эталону используемой импедансной системы.
   2. Используя зажим стакана, подвешивайте стержень из нержавеющей стали в 1x PBS и подключайте к входу контрэлектрода используемой импедансной системы.
3. Запустите сканирование импеданса 1 кГц для каждого волокна с помощью потенциостата, установленного на частоту сканирования 1 кГц при 0,01 _Вrms в одной синусоидальной форме сигнала. Установите потенциостат на 0 В в начале каждого сканирования в течение 5 с, чтобы стабилизировать записанный сигнал. Записывайте измерения с помощью программного обеспечения, связанного с потенциостатом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерения могут быть сделаны в любой точке сборки; однако они необходимы только перед изоляцией и во время подготовки наконечника. В таблице 2 перечислены типичные диапазоны импедансов после каждого шага сборки на частоте 1 кГц для справки пользователя.
4. Промойте волокна в деионизированной (DI) воде, окунув их в небольшой стакан три раза и оставьте их сохнуть при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Массивы могут быть оставлены в хранилище до тех пор, пока пользователь не сможет перейти к следующему шагу.

6. Парилен C Изоляция

ПРИМЕЧАНИЕ: Парилен С был выбран в качестве изоляционного материала для углеродных волокон, поскольку он может быть нанесен при комнатной температуре на партии массивов и обеспечивает высококонформное покрытие.

1. Замаскируйте разъем Flex Array с помощью соединяющегося разъема.
2. Поместите партию из 8-12 массивов в ящик для хранения с приподнятой клеевой платформой, чтобы их можно было изолировать за один прогон. Поместите массивы так, чтобы соединительный конец массива находился на клеевой платформе с нависающим волокнистым концом массива (рисунок 6), чтобы волокна не прилипали к клею и не отрывались, а также чтобы обеспечить равномерное париленовое покрытие на волокнах.
3. Покрытие массивов в системе осаждения Parylene C до толщины 800 нм в чистом помещении с использованием соответствующих средств индивидуальной защиты (СИЗ), как определено в отдельной используемой чистой комнате.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь СИЗ были определены как обувь для чистых помещений, костюм, головной убор, очки, маска и латексные перчатки. Следует отметить, что это стандартные СИЗ для входа в чистое помещение. Этот шаг может быть передан на аутсорсинг компании по нанесению покрытий Parylene за определенную плату; однако коммерческая служба может быть в состоянии покрыть больше массивов за один раз. Каждая система осаждения парилена С может иметь различные меры предосторожности. Свяжитесь с техническим специалистом перед использованием, чтобы обеспечить безопасность пользователя.
4. Удалите соединительный разъем, используемый в качестве маски, из массива Flex.
5. Поместите массивы в новый ящик для хранения до готовности к использованию.

7. Способы приготовления чаевых

ПРИМЕЧАНИЕ: Два наконечника в этом разделе используют лазеры для резки волокон. Правильные СИЗ, такие как очки, устойчивые к используемым длинам волн, всегда следует носить при использовании лазера, и другие лабораторные пользователи в непосредственной близости от лазера также должны быть в СИЗ. Хотя длины волокон, перечисленные в этих шагах, являются рекомендуемыми длинами, пользователи могут попробовать любую длину, которая соответствует их потребностям. Пользователь должен выбрать один из следующих методов подготовки наконечника, так как одной ножничной резки будет недостаточно для повторного обнажения ^{электрода25}.

1. Неодимовая легированная иттрием алюминиевая гранатовая (Nd:YAG) лазерная резка
   1. Нарежьте волокна до 550 мкм хирургическими ножницами.
   2. Используйте импульсный лазер 532 нм Nd: YAG (5 мДж / импульс, длительность 5 нс, 900 мВт), чтобы отрезать 50 мкм от кончика волокон, чтобы повторно обнажить углерод под париленом C (обычно требуется 2-3 импульса).
      1. Выровняйте наконечники волокон с помощью встроенного стереоскопа, который поставляется с этой лазерной системой.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система позволяет пользователю выровнять окно (здесь 50 мкм х 20 мкм (высота х ширина)) использовалось для охвата конца волокна.
      2. Сфокусируйте стереоскоп на конце волокна с 500-кратным увеличением для точного и точного разреза.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Парилен С будет слегка удаляться (<10 мкм) от кончика, оставляя тупой цилиндрический наконечник.
2. Заточка паяльной ^{лампы25,26,27}
   1. Нарежьте волокна до 300 мкм хирургическими ножницами.
   2. Погрузите массив в тарелку с деионизированной водой, соедините стороной вниз и закрепите на дне тарелки небольшим количеством шпаклевки.
   3. Используйте камеру пера, чтобы выровнять волокна с поверхностью воды так, чтобы волокна едва касались поверхности воды.
   4. Отрегулируйте пламя бутановой паяльной лампы до 3-5 мм и проведите им по верхней части волокон движением вперед-назад для заточки волокон.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Наконечники волокон будут светиться оранжевым цветом, когда пламя проходит над ними.
   5. Извлеките массив из шпаклевки и осмотрите его под стереоскопом на предмет заостренных наконечников при 50-кратном увеличении.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если соблюдаются заостренные наконечники, то дальнейшая паяльная лампа не требуется. Если подсказки кажутся тупыми, повторите шаги 7.2.2-7.2.5.
3. УФ лазерная ^резка28
   ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящее время УФ-лазер может использоваться только на конструкциях с нулевой силой вставки (ZIF) и wide Board из-за того, что большая фокусная точка используемого УФ-лазера больше, чем шаг углеродных волокон Flex Array.
   1. Нарежьте углеродные волокна до 1 мм хирургическими ножницами.
   2. Прикрепите УФ-лазер к трем ортогонально сконфигурированным моторизованным ступеням.
      ПРИМЕЧАНИЕ: УФ-лазер представляет собой многомодовый полупроводник нитрида индия-галлия (InGaN) с выходной мощностью 1,5 Вт и длиной волны 405 нм.
      1. Убедитесь, что лазер имеет непрерывный луч для быстрого и эффективного выравнивания и резки.
   3. Закрепите массив на месте, чтобы сохранить неподвижную, ровную плоскость электродов для прохождения лазера. Убедитесь, что массив удерживается на соответствующем расстоянии от лазера, чтобы волокна были в свете с фокусной точкой лазера. Для этого обеспечьте меньшую мощность лазера и отрегулируйте расстояние, чтобы наилучшим образом сфокусироваться на ^{волокне28}.
   4. Перемещайте фокусную точку УФ-лазера через плоскость волокна со скоростью 25 мкм/с, чтобы разрезать волокна на нужную длину (здесь все волокна разрезаются до 500 мкм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Волокна будут излучать яркий свет перед разрезанием. Храните волокна после обработки до тех пор, пока они не будут готовы к покрытию проводящим полимером.

8. Поли(3,4-этилендиокситиофен):p-толуолсульфонатное (PEDOT:pTS) проводящее покрытие для пониженного импеданса

1. Смешайте растворы 0,01 М 3,4-этилендиокситиофена и 0,1 М п-толуолсульфоната натрия в 50 мл воды DI и перемешивайте в течение ночи на перемешивающей пластине (~450 об/мин) или до тех пор, пока в растворе не будет наблюдаться твердых частиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Храните раствор в светостойком контейнере. Охладите раствор после смешивания, чтобы сохранить раствор пригодным для использования в течение 30 дней.
2. Запустите сканирование импеданса 1 кГц, используя те же параметры, что и раньше (шаги 5.2-5.3) в 1x PBS. Обратите внимание, какие волокна имеют хорошее соединение (<1 МОм, обычно 14-16 из 16 волокон).
3. Гальваническая пластина с PEDOT:pTS для снижения импеданса электродов.
   1. Погрузите волокнистые наконечники в раствор PEDOT:pTS.
   2. Выполните действия, описанные в шаге 5.2, переключив решение 1x PBS для PEDOT:pTS и сократьте все подключения к плате в прилагаемый токовый канал.
   3. Наносите 600 пА на хорошую клетчатку в течение 600 с с использованием потенциостата.
   4. Выключите ячейку и дайте ей отдохнуть в течение 5 с в конце пробега.
4. Удалите волокна из раствора и промойте их в воде DI.
5. Переснимайте сопротивление 1 кГц, чтобы убедиться, что волокна были успешно покрыты (используйте те же параметры, которые перечислены в шагах 5.2-5.3).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошие волокна обозначаются как любое волокно, имеющее сопротивление менее 110 кОм.

9. Подключение заземляющих и опорных проводов

1. Аккуратно соскоблите Парилен С с земли и эталонные виазы на доске с помощью пинцета. Короткая земля и эталонные виа виа вместе парами на этой конструкции платы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Заземление и опорные проходы находятся рядом с разъемом на массиве Flex и представляют собой четыре небольших золотых круга рядом с разъемами. Пользователям нужно будет только удалить Parylene C из vias, ближайших к углеродным волокнам для измерений.
2. Вырежьте два 5 см изолированного серебряного провода лезвием бритвы. Деиншуляция концов проводов на 2-3 мм от одного конца, который должен быть прикреплен к Flex Array, и ~ 10 мм от противоположных концов, чтобы облегчить заземление и привязку во время операции.
3. Нагрейте паяльник до 600 °F. Нанесите небольшое количество флюса на виасу.
4. Вставьте один провод (открытый конец 2-3 мм) в каждую из антенн ePhys на плате. Нанесите припой на верхнюю часть виакса (рисунок 7А). Дайте зонду остыть, затем переверните его, чтобы нанести небольшое количество припоя на заднюю сторону через (рисунок 7A).
5. Используя хирургические ножницы, отрежьте любую открытую проволоку, торчащую из задней паяльной насыпи, так как это помогает уменьшить шум, наблюдаемый при записи (рисунок 7B).
6. Поместите массивы обратно в ящик для хранения, согнув провода назад и подальше от волокна. Закрепите провода на клейкой ленте, чтобы предотвратить потенциальное взаимодействие волокон и проволоки (рисунок 7C).

10. Хирургическая процедура

ПРИМЕЧАНИЕ: Кора головного мозга крыс использовалась для проверки эффективности волокон, подготовленных УФ-лазером, как это было описано ^{ранее7,20}. Эти зонды будут работать в нерве из-за их аналогичной геометрии и уровней импеданса с волокнами, подготовленными паяльной лампой. Эта операция была выполнена с большой осторожностью, чтобы подтвердить, что УФ-лазер не изменил реакцию электродов.

1. Обезболить взрослого самца крысы Лонг Эванс, используя комбинацию кетамина (90 мг/кг) и ксилазина (10 мг/кг). Подтвердите анестезию с помощью теста на щипки пальцев ног. Нанесите мазь на глаза, чтобы предотвратить высыхание глаз крысы во время операции.
2. Создайте трепанацию краниотомии размером 2 мм x 2 мм над моторной корой правого полушария. Определите нижний левый угол трепанации черепа, измерив 1 мм передней части брегмы и 1 мм боковой средней линии.
3. Установите массив в стереотаксический инструмент и обнулите стереотаксический инструмент на твердой мозговой оболочке, осторожно опуская волокна, пока они не коснутся поверхности твердой мозговой оболочки. Поднимите массив подальше от места операции и переместите его в сторону, пока он не будет готов к введению.
4. Резецируйте твердую мозговую оболочку, осторожно потянув иглу колючим концом по поверхности ткани. Как только часть твердой мозговой оболочки откроется мозгу, используйте пару тонких щипцов, чтобы еще больше помочь в удалении твердой мозговой оболочки.
5. Вставьте волокна в трепанацию черепа и 1,2 мм в мозг с помощью стереотаксического инструмента, медленно опускаясь вручную.
6. Записывайте данные ePhys в течение 10 минут с помощью специальной для ePhys головной ступени и предусилителя.
   1. Установите фильтр высоких частот предусилителя для обработки сигнала на частоте 2,2 Гц, сглаживания на частоте 7,5 кГц и отбора проб на частоте 25 кГц.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этих измерений регистрируется только спонтанная активность. Стимул не применяется.
7. Эвтаназия
   1. Поместите крысу под изофлуран на 5% менее 1 л/мин кислорода до тех пор, пока признаки жизни не прекратятся (20-30 мин). Подтвердите эвтаназию обезглавливанием.

11. Сортировка шипов

1. Используйте программное обеспечение для сортировки и анализа данных с использованием ранее сообщенных ^{методов8}.
2. Используйте фильтр высоких частот на всех каналах (угол 250 Гц, Баттерворт ^4-го порядка) и установите уровень обнаружения формы сигнала на -3,5 × порогового значения RMS.
   1. Используйте модель Гаусса для группировки и пиков с аналогичными характеристиками. Комбинируйте и усредняйте кластеры не менее 10 осциллограмм для включения в дальнейший анализ.
   2. Удалите или удалите из набора данных все формы сигналов, которые не являются пиками.
3. Экспортируйте данные после того, как все каналы были отсортированы, и используйте аналитическое программное обеспечение для построения и дальнейшего анализа форм сигналов.

12. Сканирующая электронно-микроскопическая (SEM) визуализация

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг сделает массивы непригодными для использования и должен использоваться только для проверки результатов обработки наконечников, чтобы убедиться, что массивы обрабатываются правильно. Этот шаг не нужно выполнять для успешного построения массива. Ниже кратко излагаются общие сведения о процессе СЭМ; однако пользователи, которые ранее не использовали SEM, должны получать помощь от обученного пользователя.

1. Отрежьте волокнистый конец печатной платы и установите его на заглушку SEM с углеродной лентой. Поместите массивы на небольшую платформу из уложенной углеродной ленты (4-5 слоев), чтобы углеродные волокна не прилипали к заглушке SEM.
2. Напыляйте массивы золотом (100-300 Å) в соответствии с процедурами, изложенными производителем золотого напыляющего слоя.
3. Чтобы проверить эффекты обработки наконечника, изобразите массивы в SEM на рабочем расстоянии 15 мм и прочности луча 20 кВ.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Массивы могут быть изображены без напыления при низком вакууме, как показано на рисунке 8D для волокон УФ-лазерной резки. Для такой установки рекомендуется иметь рабочее расстояние 11-12 мм и прочность луча 4 кВ.

Результаты

Проверка советов: изображения SEM
Предыдущая ^{работа20} показала, что ножничная резка привела к ненадежным импедансам, поскольку Parylene C складывался по всему месту записи. Ножничная резка используется здесь только для резки волокон до нужной длины перед обработкой д?...

Обсуждение

Замены материалов
Хотя все используемые материалы обобщены в Таблице материалов, очень немногие из материалов должны поступать от конкретных поставщиков. Плата Flex Array должна поступать от указанного поставщика, поскольку они являются единственной компанией, котора...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3 prong clams	05-769-6Q	Fisher	Qty: 2 Unit Cost (USD): 20
3,4-ethylenedioxythiophene (25 g) (PEDOT)	96618	Sigma-Aldrich	Qty: 1 Unit Cost (USD): 102
353ND-T Epoxy (8oz)++ (ZIF and Wide Board Only)	353ND-T/8OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 48
Ag/AgCl (3M NaCl) Reference Electrode (pack of 3)	50-854-570	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 100
Autolab	PGSTAT12	Metrohm
Blowtorch	1WG61	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 36
Carbon Fibers	T-650/35 3K	Cytec Thornel	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Carbon tape	NC1784521	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 27
Cotton Tipped Applicator	WOD1002	MediChoice	Qty: 1 Unit Cost (USD): 0.57
Delayed Set Epoxy++	1FBG8	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
DI Water	n/a	n/a	Qty: n/a Unit Cost (USD): n/a
Dumont Tweezers #5	50-822-409	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 73
Flex Array**	n/a	MicroConnex	Qty: 1 Unit Cost (USD): 68
Flux	SMD291ST8CC	DigiKey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 13
Glass Capillaries (pack of 350)	50-821-986	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 60
Glass Dish	n/a	n/a	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Hirose Connector (ZIF Only)	H3859CT-ND	DigiKey	Qty: 2 Unit Cost (USD): 2
Light-resistant Glass Bottle	n/a	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Heating Filiment	FB315B	Sutter Instrument Co	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Micropipette Puller	P-97	Sutter Instrument Co	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Nitrile Gloves (pack of 200)	19-041-171C	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 47
Offline Sorter software	n/a	Plexon	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Omnetics Connector* (Flex Array Only)	A79025-001	Omnetics Inc	Qty: 1 Unit Cost (USD): 35
Omnetics Connector* (Flex Array Only)	A79024-001	Omnetics Inc	Qty: 1 Unit Cost (USD): 35
Omnetics to ZIF connector	ZCA-OMN16	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Pin Terminal Connector (Wide Board Only)	ED11523-ND	DigiKey	Qty: 16 Unit Cost (USD): 10
Probe storage box	G2085	Melmat	Qty: 1 Unit Cost (USD): 2
Razor Blade	4A807	Grainger	Qty: 1 Unit Cost (USD): 2
SEM post	16327	lnf	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
Silver Epoxy (1oz)++	H20E/1OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 125
Silver GND REF wires	50-822-122	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 423.2
Sodium p-toulenesulphonate(pTS)- 100g	152536	Sigma-Aldrich	Qty: 1 Unit Cost (USD): 59
Solder	24-6337-9703	DigiKey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 60
Soldering Iron Tip	T0054449899N-ND	Digikey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 13
Soldering Station	WD1002N-ND	Digikey	Qty: 1 Unit Cost (USD): 374
SpotCure-B UV LED Cure System	n/a	FusionNet LLC	Qty: 1 Unit Cost (USD): 895
Stainless steel rod	n/a	n/a	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Stir Plate	n/a	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): n/a
Surgical Scissors	08-953-1B	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 100
TDT Shroud (ZIF Only)	Z3_ZC16SHRD_RSN	TDT	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3.5
Teflon Tweezers	50-380-043	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 47
UV & Visible Light Safety Glassees	92522	Loctite	Qty: 1 Unit Cost (USD): 45
UV Epoxy (8oz)++ (Flex Array Only)	OG142-87/8OZ	Epoxy Technology	Qty: 1 Unit Cost (USD): 83
UV Laser	n/a	WER	Qty: 1 Unit Cost (USD): 30
Weigh boat (pack of 500)	08-732-112	Fisher	Qty: 1 Unit Cost (USD): 58
Wide Board+	n/a	Advanced Circuits	Qty: 1 Unit Cost (USD): 3
ZIF Active Headstage	ZC16	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): 925
ZIF Passive Headstage	ZC16-P	Tucker-Davis Technologies	Qty: 1 Unit Cost (USD): 625
ZIF*	n/a	Coast to Coast Circuits	Qty: 1 Unit Cost (USD): 9