JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מחקר זה מדווח על גישה חדשנית למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים המבוססים על ציטומטריה של זרימה והכתמה כפולה עם שני מדווחים פלואורסצנטיים או נוגדנים כדי לזהות שינויים בנפח המיטוכונדריה, פוטנציאל קרום המיטוכונדריה, רמת מיני חמצן תגובתי, הרכב שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית ודנ"א מיטוכונדריאלי.

Abstract

מיטוכונדריה חשובים בפתופיזיולוגיה של מחלות נוירודגנרטיביות רבות. שינויים בנפח המיטוכונדריה, בפוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית (MMP), בייצור מיטוכונדריאלי של מיני חמצן תגובתי (ROS) ובמספר העתק הדנ"א המיטוכונדריאלי (mtDNA) הם לעתים קרובות מאפיינים של תהליכים אלה. דו"ח זה מפרט גישה חדשנית המבוססת על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. אסטרטגיה מבוססת זרימה זו משתמשת בתאים חיים למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP ורמות ROS, כמו גם בתאים קבועים כדי להעריך רכיבים של שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית (MRC) וחלבונים הקשורים ל-mtDNA כגון גורם שעתוק מיטוכונדריאלי A (TFAM).

על ידי צביעה משותפת עם כתבים פלואורסצנטיים, כולל MitoTracker Green (MTG), טטרה-מתילרהודאמין אתיל אסטר (TMRE) ו-MitoSox Red, ניתן לכמת שינויים בנפח המיטוכונדריה, ב-MMP וב-ROS המיטוכונדריאלי וקשורים לתכולת המיטוכונדריה. צביעה כפולה עם נוגדנים כנגד תת-יחידות מורכבות של MRC וטרנסלוקאז של קרום מיטוכונדריאלי חיצוני 20 (TOMM20) מאפשרת הערכה של ביטוי תת-יחידות MRC. מכיוון שכמות ה-TFAM פרופורציונלית למספר העותקים של mtDNA, המדידה של TFAM ל-TOMM20 נותנת מדידה עקיפה של mtDNA לכל נפח מיטוכונדריאלי. הפרוטוקול כולו יכול להתבצע תוך 2-3 שעות. חשוב לציין שפרוטוקולים אלה מאפשרים מדידה של פרמטרים מיטוכונדריאליים, הן ברמה הכוללת והן ברמה הספציפית לכל נפח מיטוכונדריאלי, באמצעות ציטומטריה של זרימה.

Introduction

מיטוכונדריה הם אברונים חיוניים הנמצאים כמעט בכל התאים האאוקריוטים. המיטוכונדריה אחראים על אספקת האנרגיה על ידי ייצור אדנוזין טריפוספט (ATP) באמצעות זרחון חמצוני ומשמשים כמתווכים מטבוליים לביוסינתזה ולחילוף חומרים. המיטוכונדריה מעורבת עמוקות בתהליכים תאיים חשובים רבים אחרים, כגון ייצור ROS, מוות של תאים וויסות תוך-תאישל Ca 2+. תפקוד לקוי של המיטוכונדריה נקשר למחלות נוירודגנרטיביות שונות, כולל מחלת פרקינסון (PD), מחלת אלצהיימר (AD), מחלת הנטינגטון (HD), אטקסיה של פרידריך (FRDA) וטרשת אמיוטרופית צידית (ALS)1. גם תפקוד לקוי מוגבר של המיטוכונדריה וחריגה ב-mtDNA נחשבים כתורמים להזדקנות האנושית 2,3.

סוגים שונים של תפקוד לקוי של המיטוכונדריה מתרחשים במחלות נוירודגנרטיביות, ושינויים בנפח המיטוכונדריה, דה-פולריזציה של MMP, ייצור ROS ושינויים במספר עותק mtDNA נפוצים 4,5,6,7. לכן, ליכולת למדוד תפקודים מיטוכונדריאליים אלה ואחרים יש חשיבות רבה כאשר חוקרים את מנגנוני המחלה ובודקים גורמים טיפוליים פוטנציאליים. יתר על כן, לאור היעדרם של מודלים חייתיים המשכפלים נאמנה מחלות נוירודגנרטיביות אנושיות, הקמת מערכות מודל in vitro מתאימות המשחזרות את המחלה האנושית בתאי המוח היא צעד חשוב לקראת הבנה טובה יותר של מחלות אלה ופיתוח טיפולים חדשים 2,3,8,9.

ניתן להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים כדי ליצור תאי מוח שונים, כולל תאים עצביים ולא עצביים (כלומר, תאי גליה), ונזק מיטוכונדריאלי הקשור למחלות נוירודגנרטיביות נמצא בשני סוגי התאים 3,10,11,12,13. שיטות מתאימות להתמיינות iPSC לשושלות עצביות וגליאליות זמינות14,15,16. תאים אלה מספקים פלטפורמה ייחודית לבני אדם/מטופלים למידול מחלות במבחנה ולבדיקת תרופות. יתר על כן, מכיוון שאלה נגזרים מחולים, נוירונים שמקורם ב- iPSC ותאי גליה מספקים מודלים של מחלות המשקפים את מה שקורה בבני אדם בצורה מדויקת יותר.

נכון להיום, קיימות מעט שיטות נוחות ואמינות למדידת פרמטרים תפקודיים מיטוכונדריאליים מרובים בתאי גזע פלוריפוטנטיים, במיוחד תאי עצב חיים ותאי גלייה. השימוש בציטומטריה של זרימה מספק למדען כלי רב עוצמה למדידת פרמטרים ביולוגיים, כולל תפקוד מיטוכונדריאלי, בתאים בודדים. פרוטוקול זה מספק פרטים ליצירת סוגים שונים של תאי מוח, כולל תאי גזע עצביים (תאי גזע עצביים), נוירונים ואסטרוציטים גליאליים מתאי גזע פלוריפוטנטיים, כמו גם גישות חדשניות המבוססות על ציטומטריה של זרימה למדידת פרמטרים מיטוכונדריאליים מרובים בסוגי תאים שונים, כולל iPSCs ותאי עצב וגליה שמקורם ב-iPSC. הפרוטוקול מספק גם אסטרטגיית צביעה משותפת לשימוש בציטומטריה של זרימה למדידת נפח המיטוכונדריה, MMP, רמת ROS מיטוכונדריאלית, מתחמי MRC ו- TFAM. על ידי שילוב מדדים של נפח או מסה מיטוכונדריאלית, פרוטוקולים אלה מאפשרים גם מדידה של הרמה הכוללת והרמה הספציפית לכל יחידת מיטוכונדריה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הערה: עיין בטבלת החומרים ובטבלה המשלימה S1 לקבלת מתכונים של כל המדיות והפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

1. התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים לתאי NCS, נוירונים דופמינרגיים (DA) ואסטרוציטים

  1. הכינו צלחות מצופות מטריצה.
    1. להפשיר בקבוקון של 5 מ"ל של מטריקס על קרח לילה. יש לדלל 1 מ"ל של מטריצה עם 99 מ"ל של ה-F-12 של הנשר המתוקן של דולבקו (DMEM/F12 מתקדם) (ריכוז סופי של 1%). הפוך 1 מ"ל aliquots ולאחסן אותם ב -20 °C (70 °F).
    2. הפשירו את תמיסת המטריצה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס (שמרו על קור) וציפו 6 בארות (1 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
    3. מניחים את הלוח המצופה במטריצה באינקובטור אווירלח של 5% CO 2/95% בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת. הוציאו את הצלחת מהאינקובטור ותנו לה להתאזן לטמפרטורת החדר (RT).
      הערה: מומלץ להשתמש בצלחת תוך 3 ימים מיום הציפוי. עם זאת, צלחת מצופה ניתן לאחסן עד 2 שבועות ב 4 מעלות צלזיוס. רק זכרו להוציא אותו ולתת לו להתחמם ל-RT לפני השימוש. לאחסון ממושך, הוסיפו 1 מ"ל של מדיום תרבית iPSC לצלחת המצופה כדי למנוע ייבוש של המטריצה.
  2. הפשרת תאי גזע פלוריפוטנטיים
    1. מחממים את הלוחות המצופים במטריצה ב-RT או באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. יש לחמם מראש את הכמות הנדרשת של מדיום תרבות iPSC ב-RT.
    2. יש לערבב 6 מ"ל של מדיום תרבית iPSC שחומם מראש עם 12 μL של מעכב Y-27632 ROCK כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מיקרומטר.
    3. הפשירו חלקית את הבקבוקון הקפוא של iPSCs בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט מים עד שתישאר חתיכת קרח קטנה.
    4. הוסיפו באיטיות 1 מ"ל של תרבית iPSC שחוממה מראש עם 12 μL של מעכב ROCK טיפה לתאים. העבירו את תכולת הנוזל של הבקבוקון באמצעות iPSCs לבאר אחת של צלחת מצופה מראש בגודל 6 מ"ל באמצעות פיפטה של 5 מ"ל.
    5. הזיזו את הצלחת בכיוונים מאונכים כדי לערבב את תכולת הבאר והחזירו את הצלחת לאינקובטור. החליפו את מדיום תרבית ה-iPSC לאחר 24 שעות לאחר שטיפה עם תמיסת מלח (DPBS) של דולבקו (1x) (Ca 2+/Mg2+-free ) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
      הערה: אין להוסיף מעכב ROCK להאכלות הבאות. שנה את מדיום תרבות ה- iPSC מדי יום.
  3. תת-תרבות של iPSCs
    1. מחממים את הלוחות המצופים במטריצה ב-RT או באינקובטור ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות. יש לחמם מראש את הכמות הנדרשת של מדיום תרבות iPSC ב-RT.
    2. שאפו את מדיום התרבית מהצלחות המכילות את התאים. שטפו את תאי ה-iPSCs עם DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free ) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות).
    3. מוסיפים EDTA (0.5 מ"מ) (1 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). דוגרים את הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס עד ששולי המושבות מתחילים להתרומם מהבאר (בדרך כלל 3-5 דקות). שאפו את ה- EDTA.
    4. הוסיפו מדיום תרבית iPSC שחומם מראש (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ונתקו בכוח את מושבות ה-iPSC באמצעות פיפטה סטרילית של 10 מ"ל פעם אחת. אין לבצע פיפטה למעלה ולמטה מכיוון שהדבר עלול לשבור גושים של תאים לתאים בודדים.
    5. מעבירים את תכולת כל באר לשתי בארות נפרדות בצלחת 6 בארות מצופה מטריצה (2 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. אין ליצור בועות בהשעיה בזמן הפיפטציה.
      הערה: נערו את הצלחת בעדינות לפני שתשמרו אותה באינקובטור. יחס הפיצול יכול להיות 1:2 (באר אחת ל-2 בארות חדשות) ל-1:4 (אחת ל-4 בארות חדשות).
    6. החליפו את המדיום מדי יום עד שהמושבות יגיעו למפגש של 60% עם גודל וחיבורים טובים.
  4. אינדוקציה עצבית ויצירת אבות עצביים
    1. הכן 500 מ"ל של מדיום מוגדר כימית (CDM), 500 מ"ל של מדיום אינדוקציה עצבית (NIM), ו-500 מ"ל של מדיום ללא סרום תאי גזע עצביים (NSC SF).
    2. יש לשטוף את התאים עם DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ולהוסיף NIM (3 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). מוגדר כיום 0.
    3. החלף את ה- NIM (3 מ"ל לבאר בלוח של 6 בארות) ביום 1, יום 3 ויום 4 והתבונן מתחת למיקרוסקופיה מדי יום.
    4. ביום החמישי, נתקו את הרוזטות העצביות לתרבית מתלים כמתואר להלן.
      1. יש לשטוף פעם אחת בעדינות עם DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). מוסיפים קולגן IV (1 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ושומרים באינקובטור למשך דקה אחת. שאפו את הקולגן IV ושטפו פעם אחת עם DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) בעדינות.
      2. יש להוסיף 2 מ"ל של NSC SF Medium לכל באר לצלחת של 6 בארות. נתק את התאים על ידי גירוד תחתית הבארות על ידי ציור רשתות באמצעות קצה פיפטה של 200 μL.
      3. אספו את מתלה התאים מצלחת 6 הבארות לצלחת של 10 ס"מ שאינה דבקה. השלם את עוצמת הקול ל-12 מ"ל עם NSC SF Medium.
      4. יש לנער את המנה הלא דבקה ב-65-85 סל"ד על שייקר אורביטלי באינקובטור כדי למנוע צבירה.
  5. דיפרנציאציה של תאי עצב DA
    1. ביום 7, הוסיפו 12 מ"ל של CDM בתוספת 100 ng/mL גורם גדילה פיברובלסטי-8b (FGF-8b) והניחו את המנה על השייקר האורביטלי באינקובטור.
    2. בימים 8-13, לשנות את המדיום כל 2 ימים ולהתבונן תחת מיקרוסקופיה מדי יום.
    3. ביום ה-14, יש להוסיף 12 מ"ל של CDM בתוספת 100 ננוגרם/מ"ל FGF-8b ו-1 μM פורמורפמין (PM). מניחים את המנה על השייקר האורביטלי באינקובטור.
    4. בימים 15-20, לשנות את המדיום כל 2 ימים ולבחון את התאים תחת מיקרוסקופיה מדי יום.
    5. מעבר מכני של הספירות באמצעות 1000 קצוות μL כדי לפרק את הספירות הגדולות יותר.
      הערה: היחס יכול להיות 1:2 (מנה אחת לתוך 2 מנות חדשות).
  6. הפסקת ההבחנה
    1. מצפים צלחת בת 6 בארות או מכסים בפולי-ל-אורניתין (אש"ף) ולמינין כמתואר להלן.
      1. מצפים צלחת של 6 בארות עם 1 מ"ל אש"ף לכל באר, ומדגרים את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לשאוף לפתרון אש"ף.
      2. יש לעקר את הצלחת תחת UV למשך 20 דקות. שטפו את הבארות פעמיים עם DPBS (1x) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות).
      3. יש להוסיף תמיסת למינין של 5 מיקרוגרם/מ"ל (1 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ולדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעתיים. שאפו את הלמינין ושטפו את הבארות לזמן קצר עם DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) פעם אחת לפני הציפוי.
    2. אסוף את כל הכדורים (משלב 1.5.5) בצינורות של 50 מ"ל ומלא DPBS (1x). סובבו ב-300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופר-נטנט.
    3. דגירה עם 2 מ"ל של מגיב דיסוציאציה של תאים (ראו טבלת חומרים) במשך 10 דקות ב-37 מעלות צלזיוס באמבט מים ואחריו טריטורציה עדינה עם פיפטה של 200 μL (20-50 פעמים בהתאם לגודל הכדורים, הימנעות מהיווצרות בועות).
    4. נטרול מגיב הדיסוציאציה של התאים עם 2 מ"ל של מדיום הנשר המתוקן (DMEM) של דולבקו עם 10% סרום בקר עוברי (FBS) וצנטריפוגה של 50 מ"ל חרוטית המכילה את התאים ב-300 × גרם למשך 5 דקות ב-RT. שאפו את הסופר-נט.
    5. הוסף 1 מ"ל של CDM בתוספת 10 ng/mL גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF) ו-10 ng/mL גורם נוירוטרופי שמקורו בקו תאי גליה (GDNF) כדי להשהות מחדש את כדורי התא על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה כדי לקבל תרחיפים חד-תאיים.
    6. שאפו את תמיסת הלמינין מהצלחת (שלב 1.6.1.3), שטפו לזמן קצר ב-DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות), וזרעו את התאים (משלב 1.6.5) בלוחות המצופים מראש או בכיסויים ב-3 מ"ל CDM בתוספת 10 ננוגרם/מ"ל BDNF ו-10 ננוגרם/מ"ל GDNF. להאכיל את התאים כל 4 ימים.
      הערה: ניתן לשמור על תרבויות מבדילות במשך שבועות רבים עד 3 חודשים. המורפולוגיה העצבית מופיעה בדרך כלל לאחר שבועיים של סיום וניתן להשתמש בה לניתוחים במורד הזרם מנקודה זו ואילך. BDNF ו- GDNF אינם נחוצים לגידול לתחזוקה ארוכה יותר (עד חודשיים).
  7. דור המל"ל
    1. צלחות מטריצת מעיל.
    2. אסוף את כל הכדורים העצביים (שנוצרו משלב 1.4) בצינורות של 50 מ"ל ומלא DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free). סובבו ב-300 × גרם למשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטים.
    3. לדגום את הכדורים עם 2 מ"ל של מגיב דיסוציאציה התא במשך 10 דקות ב 37 מעלות צלזיוס באמבט מים, ואחריו טריטורציה עדינה עם פיפטה 200 μL (20-50 פעמים בהתאם לגודל של כדורים, הימנעות היווצרות בועה).
    4. נטרל עם 2 מ"ל של DMEM עם 10% FBS וצנטריפוגה של 50 מ"ל צינורות חרוטיים המכילים את התאים ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב RT. לשאוף את supernatants. השהה את כדורי התא על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה כדי לקבל מתלים חד-תאיים.
    5. שאפו את תמיסת המטריצה מצלחת מצופה מראש וזרעו את התאים בלוחות המצופים מראש ב- NSC SF Medium (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות). מזינים את התאים כל 2-3 ימים ומפצלים את התאים כאשר הם נפגשים.
      הערה: משלב זה ואילך, ניתן להרחיב ולהקפיא תאי גזע עצביים כלפי מטה.
  8. הבחנה של גליה אסטרוציטים
    1. התמיינות אסטרוציטים מ- NSCs
      1. הכן 500 מ"ל של מדיום הבחנה אסטרוציטים.
      2. זרעים של NSCs על צלחות/כיסויים מצופים פולי-D-ליזין (PDL) עם מדיום NSC SF.
      3. למחרת, יש לשטוף את התאים ב-DPBS (1x) (Ca 2+/Mg2+-free) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות) ולהוסיף מדיום התמיינות אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות). מוגדר כיום 0.
      4. התבונן ב- NSCs מתחת למיקרוסקופ מדי יום והחלף את מדיום ההבחנה של אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בלוח 6 בארות) כל יומיים מימים 1 עד 27.
    2. הבשלת אסטרוציטים
      1. הכן מדיום התבגרות אסטרוציטים.
      2. ביום 28, יש לשטוף את התאים ב-DPBS (1x) (4 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) ולהוסיף מדיום התבגרות אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות).
      3. ביום 29 ואילך, התבונן בתאים שמתחת למיקרוסקופ מדי יום והחלף את מדיום ההבשלה של אסטרוציטים (3 מ"ל לבאר בצלחת של 6 בארות) כל יומיים.
      4. לאחר חודש של התבגרות, הרחיבו את התאים והקפיאו אותם משלב זה ואילך.
        הערה: במהלך שלב זה, מספר התאים יגדל. בעת פיצול התאים, כיסויים מצופים PDL אינם נחוצים לתרבות.

2. אפיון תאים על ידי אימונוציטוכימיה וצביעת אימונופלואורסצנציה

  1. בתום תקופת התרבית, מעבירים את הכיסויים עם התאים לצלחת של 12 בארות.
    שטפו את התאים בתמיסת מלח (PBS) (1x) פעמיים ודגרו במשך 10 דקות ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) (0.5 מ"ל לבאר בצלחת של 12 בארות) ב-RT.
    הערה: ניתן לכסות את הדגימה הקבועה ב-2 מ"ל של PBS (1x) ולאחסן אותה בטמפרטורה של 4°C עד שתידרש לטיפול חיסוני. PFA הוא רעיל וחשוד כגורם לסרטן. למנוע חשיפה לעור ולעיניים, ולעבוד תחת מכסה אדים כימיים.
  2. לחסום ולחדור את התאים ולדגור עם מאגר חוסם המכיל PBS (1x), 0.3% טריטון X-100, ו 10% סרום עזים רגיל במשך שעה אחת ב- RT.
  3. דגירה עם נוגדנים ראשוניים בחסימת חיץ לילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס: iPSCs כתומים עם גורם שעתוק אנטי-אוקטמר-קושר 4 (Oct4) ואנטיגן עוברי ספציפי אנטי-שלב (SSEA4), NSCs עם אזור אנטי-קובע מין Y box-2 (Sox2) ואנטי-נסטין, כדורים עצביים עם קופסה-6 אנטי-זוגית (Pax6) ואנטי-נסטין, אסטרוציטים עם חלבון חומצי אנטי-גליאלי (GFAP) ואנטי-S100 חלבון קושר סידן β (S100β), ונוירוני DA עם אנטי-טירוזין הידרוקסילאז (TH), אנטי-β III טובולין (Tuj 1), אנטי-סינפטופיסין ואנטי-PSD-95 (0.5 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית לכל באר בלוח של 12 בארות; לפרטים ראו טבלת חומרים ).
  4. שטפו את הדגימות עם PBS (1x) שלוש פעמים במשך 10 דקות כל אחת עם נדנדה עדינה.
  5. דגירה עם תמיסת נוגדנים משנית (1:800 בחיץ חוסם, 0.5 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית Alexa Fluor לכל באר בצלחת של 12 בארות) במשך שעה אחת ב-RT עם נדנדה עדינה.
  6. דגרו על התאים עם Hoechst 33342 (1:5,000, 0.5 מ"ל לבאר בצלחת של 12 בארות) ב-PBS (1x) למשך 15 דקות ב-RT כדי לסמן את הגרעינים.
  7. הרכב את התאים עם הרכבה בינונית ויבש במשך הלילה ב- RT להדמיה תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בחושך. ראה איור משלים S1 עבור ההגדרות והפרמטרים של המיקרוסקופ.

3. מדידת ציטומטריה של זרימה של נפח המיטוכונדריה, MMP ו-ROS מיטוכונדריאלי בתאים חיים

  1. זרעו את התאים בנפרד ל-4 בארות בצלחת של 6 בארות עד שהתאים מגיעים למפגש של 50%-60%. תייג את ארבע הבארות האלה כ-#1, #2, #3 ו-#4.
  2. בסוף תקופת התרבית, הכינו 5 תמיסות צביעה בודדות (500 μL לבאר בצלחת של 6 בארות) כדלקמן: #1 רק מדיום תרבית (לבאר #1 המכיל רק תאים לבקרה); #2-1 המכיל FCCP (100 μM); #2-2 המכיל FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) במדיום תרבית; #3 המכיל TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) במדיום תרבות; #4 המכיל MitoSox אדום (10 μM) + MTG (150 ננומטר) ב- PBS (1x) עם 10% FBS. ראו איור 1A, טבלה משלימה S2 וטבלת חומרים לקבלת פרטים על תרכובות אלה ועל מערך הציטומטריה של הזרימה.
    הערה: השתמש במדיום התרבית כדי להכין את תמיסת הצביעה. חמם את המדיום ואת ה-PBS (1x) ב-RT לפני השימוש. FCCP הוא רעיל; למנוע חשיפה של העור והעיניים ולעבוד תחת מכסה אדים כימיים.
  3. שאפו את המדיום מהבאר #2 והוסיפו פתרון #2-1 (FCCP בלבד). לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
  4. שאפו את המדיום מבארות #2 ו #3 והוסיפו פתרון #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) בבאר #2 ובפתרון #3 (TMRE + MTG) ב #3. דגירה של התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
  5. שאפו את המדיום מהבאר #4 והוסיפו פתרון #4 (MitoSox Red + MTG). לדגור על התאים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
  6. לשאוף את המדיום מכל הבארות. יש לשטוף עם PBS (1x) (4 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות). נתק את התאים באמצעות מגיב דיסוציאציה של 1 מ"ל (1 מ"ל לכל באר בלוח של 6 בארות) בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות. נטרול מגיב הדיסוציאציה של התא ב-1 מ"ל של DMEM עם 10% FBS (2 מ"ל לכל באר בצלחת של 6 בארות).
  7. לאסוף את התוכן של כל הבארות ב 15 מ"ל צינורות חרוטיים. צנטריפוגה את הצינורות ב 300 × גרם במשך 5 דקות. לשטוף את הכדורים עם PBS (1x) פעם או פעמיים.
  8. שאפו את הסופרנאטנטים אך השאירו כ-100 μL בצינורות. השהה את כדורי התא ב-300 μL של PBS (1x). העבר את התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל. שמור את הצינורות בחושך ב- RT.
  9. לנתח את התאים באמצעות ציטומטר זרימה (עם תצורת לייזר 3 כחול ו 1 אדום). זהה MTG במסנן 1 (FL1) באמצעות מסנן פס 530/30, TMRE במסנן 2 (FL2) באמצעות מסנן bandpass 585/40, ו- MitoSox Red במסנן 3 (FL3) באמצעות מסנן פס פס 510/580.

4. מדידת ציטומטריה של זרימה של תת-יחידות מורכבות MRC ו- TFAM בתאים קבועים

  1. בסוף תקופת התרבית, נתק את התאים (~106) על ידי הוספת מגיב הדיסוציאציה של התא; לאחר מכן, גלולה ולאסוף את התאים בצינור 15 מ"ל. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות.
  2. תקן את התאים ב-1.6% PFA (1 מ"ל של 1.6% PFA בצינור של 15 מ"ל) ב-RT למשך 10 דקות. לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות.
  3. חלחלו לתאים עם 90% מתנול קר כקרח (1 מ"ל של 90% מתנול בצינור של 15 מ"ל) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
  4. חסום את הדגימות במאגר חוסם המכיל 0.3 M גליצין, 5% סרום עיזים ו-1% אלבומין בסרום בקר (BSA) - שבר V ב-PBS (1x) (1 מ"ל של מאגר חוסם בצינור של 15 מ"ל). לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה עם PBS (1x) פעמיים (כמו בשלב 3.7).
  5. דגירה של התאים עם הנוגדנים הראשוניים הבאים למשך 30 דקות: אנטי-NDUFB10 (1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת I, תת-יחידה מורכבת של פלבופרוטאין אנטי-סוקסינט דהידרוגנאז תת-יחידה A (SDHA, 1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת II ואנטי-COX IV (1:1,000) למדידת תת-יחידה מורכבת IV, ונוגדן אנטי-TFAM מצומד לאלקסה פלואור 488 (1:400). הכתימו את אותו מספר תאים בנפרד עם נוגדן anti-TOMM20 מצומד עם Alexa Fluor 488 (1:400) למשך 30 דקות (1 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית בצינור של 15 מ"ל; ראו טבלת חומרים לפרטים על הנוגדנים).
  6. לשטוף את התאים עם PBS (1x) פעם אחת עם צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות. הוסף נוגדן משני (1:400) לצינורות של NDUFB10, SDHA ו- COX IV ודגירה של התאים עם פתרונות אלה למשך 30 דקות.
  7. לשטוף את התאים עם PBS (1x) פעם אחת על ידי צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות. שאפו את הסופרנאטים, והשאירו כ-100 μL בצינורות. השהה את כדורי התא ב-300 μL של PBS (1x). העבירו את התאים לצינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המוחזקים בחושך על קרח.
  8. לנתח את התאים על ציטומטר זרימה (עם תצורת לייזר 3 כחול ו 1 אדום). זהה אותות במסנן 1 (FL1) באמצעות מסנן פס 530/30. ראה איור משלים S2 עבור ההגדרות והפרמטרים של המיקרוסקופ.

5. רכישה וניתוח של ציטומטריה של זרימה

  1. השתמש בצינור הבקרה שאינו מוכתם כדי להגדיר את חלקות הפיזור הקדמיות (FSC-A) ואזור הפיזור הצדדי (SSC-A) בהתבסס על הגודל והמורכבות של אוכלוסיית התאים שנותחו. ראה איור משלים S2 עבור ההגדרות והפרמטרים של המיקרוסקופ.
    הערה: הגדר פקדים שאינם מוכתמים עבור סוגי תאים בודדים.
  2. השתמש בצינורות הבקרה שאינם כתמים כדי לבחור את השערים החיוביים, והשתמש בצינורות בקרה בצבע יחיד כדי לפצות על החפיפה הספקטרלית הפלואורסצנטית בין MTG (פלואורופור-1 [FL-1]) ו- TMRE (FL-2) בציטומטריית זרימה צבעונית. השתמש בבקרת איזוטיפ לבקרה שלילית כדי לנטר כתמי רקע בדגימות MRC ו- TFAM. השתמש בצינור FCCP כבקרת דה-פולריזציה לצביעת TMRE.
  3. שער החוצה פסולת חיצונית כדי לבחור תאים חיים ואת המעטפת העיקרית מחלקת הפיזור הקדמית והצדדית (איור 2A). שער החוצה כפילים באמצעות גובה פיזור קדימה (FSC-H) לעומת (לעומת) FSC-A מתווה צפיפות כדי לא לכלול כפילים וגם לבנות גובה פיזור צדדי (SSC-H) לעומת תרשים SSC-A (איור 2A).
  4. איסוף נתונים (ציטומטר זרימה)
    1. באמצעות שימוש בדגימות לא מוכתמות או איזוטיפיות כבקרה שלילית, צור שער מעל האוכלוסייה העיקרית של האירועים החד-תאיים תוך כדי צפייה ב-SSC-A ובמסננים השונים (FL1, FL2, FL3, FL4) (איור 1B ואיור 2B).
  5. ניתוח נתונים (תוכנת CFlow)
    1. העתיקו את מיקום השערים על דגימות התאים המוכתמים, ותעדו את כמות התאים המוכתמים חיובית עבור הכתמים החיוביים.
    2. עבור כל תת-אוכלוסייה של תא, בחר תרשים היסטוגרמה ונתח את עוצמת הפלואורסצנציה החציונית (MFI) של ערוצי הסינון השונים (FL1, FL2, FL3, FL4) (ציר x).
      1. חשב את רמות TMRE על ידי הפחתת ה- MFI של FL2 של #2 תאים שטופלו ב- FCCP מה- MFI של FL2 מדגימות מוכתמות ב- TMRE #3 בהיסטוגרמה, כמו ב- Eq (1) להלן.
        רמות TMRE = MFI של FL2 מתוך #3 דגימות מוכתמות TMRE - MFI של FL2 של #2 תאים מטופלים FCCP (1)
      2. חשב את הערכים הספציפיים עבור MMP ו- ROS מיטוכונדריאלי על ידי MFI ב- TMRE או ב- MitoSox Red, תוך חלוקת מחוון נפח המיטוכונדריה MTG.
      3. חשב את הערך הספציפי עבור תת-יחידה מורכבת ו- TFAM באמצעות MFI בביטוי מרוכב או TFAM, חלוקת מחוון נפח המיטוכונדריה TOMM20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

תיאור סכמטי של שיטת ההתמיינות והאסטרטגיות הציטומטריות של הזרימה מוצג באיור 3. תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים מובחנים לרוזטות עצביות ואז מורמים לתרבית תרחיף לצורך התמיינות לתחומים עצביים. התחומים העצביים מובחנים עוד יותר ומבשילים לנוירוני DA. הכדורים העצביים מפורקים לתאים...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

להלן פרוטוקולים ליצירת נוירונים ואסטרוציטים שמקורם ב-iPSC ולהערכת היבטים רבים של תפקוד המיטוכונדריה באמצעות ציטומטריה של זרימה. פרוטוקולים אלה מאפשרים המרה יעילה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים הן לתאי עצב והן לאסטרוציטים גליים, ואפיון מפורט של תפקוד המיטוכונדריה, בעיקר בתאים חיים. הפרו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

אנו מודים בחביבות למרכז ההדמיה המולקולרית ולמתקן הליבה של ציטומטריה של זרימה באוניברסיטת ברגן בנורווגיה. עבודה זו נתמכה על ידי מימון ממועצת המחקר הנורבגית (מספר מענק: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat ומועצת המלגות של סין (מספר הפרויקט: 201906220275).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-SynaptophysinAbcamab32127, RRID:AB_2286949Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488Abcamab198308Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10Abcamab196019Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHAAbcamab137040Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin APeproTech120-14EAstrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal MediumLonzaCC-3187Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement PackLonzaCC-4123Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240062CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNFPeproTech450-02DA neurons medium ingredient
B-27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow CytometerBD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid ConcentrateThermo Fisher Scientific11905031CDM ingredient
Collagenase IVThermo Fisher Scientific17104019Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishesSigma-AldrichCLS430589Suspension culture
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte differentiation basal Medium
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human ProteinThermo Fisher ScientificPHG0314Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human ProteinThermo Fisher ScientificPHG0024Supplement for NSC culture
Fetal Bovine SerumSigma-Aldrich12103CMedium ingredient
FGF-basicPeproTech100-18BAstrocyte differentiation medium ingredient
FCCPAbcamab120081Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Cell fixation
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement for NSC culture
GDNFPeprotech450-10DA neurons medium ingredient
GlycineSigma-AldrichG8898Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific31765027Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 humanSigma-AldrichSRP3055Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basal medium for CDM
InsulinRoche1376497CDM ingredient
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I humanSigma-AldrichI3769Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 mediumThermo Fisher Scientific12660012Basal medium for NSC culture
LamininSigma-AldrichL2020Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM ingredient
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250Neural induction medium ingredient
N-2 SupplementThermo Fisher Scientific17502048Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solutionSigma-AldrichP4957Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b ProteinR&D Systems423-F8-025/CFPromotes DA neuron differentiation
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium ingredient
StemPro Neural SupplementThermo Fisher ScientificA10508-01Supplement for NSCs culture
TrypLE Express EnzymeThermo Fisher Scientific12604013Cell dissociation reagent
TransferrinRoche652202CDM ingredient
TRITON X-100VWR International9002-93-1Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMREAbcamab113852Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA

References

  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337(2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved