Durchflusszytometrische Analyse multipler mitochondrialer Parameter in humaninduzierten pluripotenten Stammzellen und deren neuronalen und glialen Derivaten

Zusammenfassung

Diese Studie berichtet über einen neuartigen Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter basierend auf Durchflusszytometrie und Doppelfärbung mit zwei fluoreszierenden Reportern oder Antikörpern, um Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials, des reaktiven Sauerstoffgehalts, der mitochondrialen Atmungskettenzusammensetzung und der mitochondrialen DNA zu erkennen.

Zusammenfassung

Mitochondrien sind wichtig für die Pathophysiologie vieler neurodegenerativer Erkrankungen. Änderungen des mitochondrialen Volumens, des mitochondrialen Membranpotentials (MMP), der mitochondrialen Produktion von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) und der Kopienzahl der mitochondrialen DNA (mtDNA) sind häufig Merkmale dieser Prozesse. Dieser Bericht beschreibt einen neuartigen, auf Durchflusszytometrie basierenden Ansatz zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in verschiedenen Zelltypen, einschließlich humaner induzierter pluripotenter Stammzellen (iPSCs) und iPSC-abgeleiteter Neural- und Gliazellen. Diese flussbasierte Strategie verwendet lebende Zellen zur Messung des mitochondrialen Volumens, des MMP- und ROS-Spiegels sowie fixierte Zellen zur Schätzung von Komponenten der mitochondrialen Atmungskette (MRC) und mtDNA-assoziierte Proteine wie den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (TFAM).

Durch Co-Färbung mit fluoreszierenden Reportern, einschließlich MitoTracker Green (MTG), Tetramethylrhodaminethylester (TMRE) und MitoSox Red, können Veränderungen des mitochondrialen Volumens, des MMP und der mitochondrialen ROS quantifiziert und mit dem mitochondrialen Inhalt in Beziehung gesetzt werden. Die Doppelfärbung mit Antikörpern gegen MRC-Komplex-Untereinheiten und Translokase der äußeren Mitochondrienmembran 20 (TOMM20) ermöglicht die Beurteilung der MRC-Untereinheitsexpression. Da die Menge an TFAM proportional zur mtDNA-Kopienzahl ist, ergibt die Messung von TFAM pro TOMM20 eine indirekte Messung der mtDNA pro mitochondrialem Volumen. Das gesamte Protokoll kann innerhalb von 2-3 h durchgeführt werden. Wichtig ist, dass diese Protokolle die Messung mitochondrialer Parameter sowohl auf der Gesamtebene als auch auf der spezifischen Ebene pro mitochondrialem Volumen mittels Durchflusszytometrie ermöglichen.

Einleitung

Mitochondrien sind essentielle Organellen, die in fast allen eukaryotischen Zellen vorhanden sind. Mitochondrien sind für die Energieversorgung verantwortlich, indem sie Adenosintriphosphat (ATP) durch oxidative Phosphorylierung produzieren und als metabolische Vermittler für Biosynthese und Stoffwechsel fungieren. Mitochondrien sind tief an vielen anderen wichtigen zellulären Prozessen beteiligt, wie ROS-Generierung, Zelltod und intrazellulärer Ca²⁺-Regulation. Mitochondriale Dysfunktion wurde mit verschiedenen neurodegenerativen Erkrankungen in Verbindung gebracht, darunter Parkinson-Krankheit (PD), Alzheimer-Krankheit (AD), Huntington-Krankheit (HD), Friedreich-Ataxie (FRDA) und amyotrophe Lateralsklerose (ALS)¹. Es wird auch angenommen, dass eine erhöhte mitochondriale Dysfunktion und mtDNA-Anomalie zum menschlichen Altern beitragen ^2,3.

Verschiedene Arten von mitochondrialer Dysfunktion treten bei neurodegenerativen Erkrankungen auf, und Veränderungen des mitochondrialen Volumens, der MMP-Depolarisation, der Produktion von ROS und Veränderungen der mtDNA-Kopienzahl sind häufig 4,5,6,7. Daher ist die Fähigkeit, diese und andere mitochondriale Funktionen zu messen, von großer Bedeutung, um Krankheitsmechanismen zu untersuchen und potenzielle Therapeutika zu testen. Darüber hinaus ist angesichts des Mangels an Tiermodellen, die menschliche neurodegenerative Erkrankungen originalgetreu nachbilden, die Etablierung geeigneter In-vitro-Modellsysteme, die die menschliche Krankheit in Gehirnzellen rekapitulieren, ein wichtiger Schritt zu einem besseren Verständnis dieser Krankheiten und zur Entwicklung neuer Therapien 2,3,8,9.

Humane iPS-Zellen können verwendet werden, um verschiedene Gehirnzellen zu erzeugen, einschließlich neuronaler und nicht-neuronaler Zellen (dh Gliazellen), und mitochondriale Schäden im Zusammenhang mit neurodegenerativen Erkrankungen wurden in beiden Zelltypen^gefunden 3,10,11,12,13. Geeignete Methoden zur iPSC-Differenzierung in neuronale und gliale Linien stehen zur Verfügung^14,15,16. Diese Zellen bieten eine einzigartige Mensch-Patienten-Plattform für die In-vitro-Krankheitsmodellierung und das Arzneimittelscreening. Da diese von Patienten stammen, liefern iPSC-abgeleitete Neuronen und Gliazellen Krankheitsmodelle, die genauer widerspiegeln, was beim Menschen passiert.

Bisher gibt es nur wenige komfortable und zuverlässige Methoden zur Messung mehrerer mitochondrialer Funktionsparameter in iPS-Zellen, insbesondere lebenden Neuronen und Gliazellen. Der Einsatz der Durchflusszytometrie bietet dem Wissenschaftler ein leistungsfähiges Werkzeug zur Messung biologischer Parameter, einschließlich der mitochondrialen Funktion, in einzelnen Zellen. Dieses Protokoll liefert Details für die Erzeugung verschiedener Arten von Gehirnzellen, einschließlich neuraler Stammzellen (NSCs), Neuronen und glialer Astrozyten aus iPSCs, sowie neuartige durchflusszytometrische Ansätze zur Messung mehrerer mitochondrialer Parameter in verschiedenen Zelltypen, einschließlich iPSCs und iPSC-abgeleiteten Neural- und Gliazellen. Das Protokoll bietet auch eine Co-Färbestrategie für die Verwendung der Durchflusszytometrie zur Messung des mitochondrialen Volumens, MMP, mitochondrialen ROS-Spiegels, MRC-Komplexe und TFAM. Durch die Einbeziehung von Messungen des mitochondrialen Volumens oder der mitochondrialen Masse ermöglichen diese Protokolle auch die Messung sowohl des Gesamtniveaus als auch des spezifischen Niveaus pro mitochondrialer Einheit.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokoll

HINWEIS: In der Materialtabelle und der Zusatztabelle S1 finden Sie Rezepturen aller in diesem Protokoll verwendeten Medien und Lösungen.

1. Differenzierung humaner iPS-Zellen in NCSs, dopaminerge (DA) Neuronen und Astrozyten

1. Matrixbeschichtete Platten vorbereiten.
   1. Eine Durchstechflasche mit 5 ml Matrix über Nacht auf Eis auftauen. Verdünnen Sie 1 ml Matrix mit 99 ml kaltem Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% Endkonzentration). Stellen Sie 1 ml Aliquots her und lagern Sie sie bei -20 °C.
   2. Die Matrixlösung bei 4 °C auftauen (kalt halten) und 6 Vertiefungen (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) beschichten.
   3. Legen Sie die matrixbeschichtete Platte für 1 h in einen befeuchteten 5% CO₂/95% Luftinkubator bei 37 °C. Nehmen Sie die Platte aus dem Inkubator und lassen Sie sie auf Raumtemperatur (RT) ausgleichen.
      HINWEIS: Es wird empfohlen, die Platte innerhalb von 3 Tagen nach der Beschichtung zu verwenden. Die beschichtete Platte kann jedoch bis zu 2 Wochen bei 4 °C gelagert werden. Denken Sie nur daran, es herauszunehmen und vor dem Gebrauch auf RT aufwärmen zu lassen. Für eine Langzeitlagerung 1 ml iPSC-Kulturmedium auf die beschichtete Platte geben, um ein Austrocknen der Matrix zu vermeiden.
2. Auftauen von iPSCs
   1. Die matrixbeschichteten Platten bei RT oder im Inkubator bei 37 °C für 20-30 min vorwärmen. Die erforderliche Menge an iPSC-Kulturmedium bei RT vorwärmen.
   2. Mischen Sie 6 ml vorgewärmtes iPSC-Kulturmedium mit 12 μL Y-27632 ROCK-Inhibitor, um eine Endkonzentration von 10 μM zu erhalten.
   3. Die gefrorene Durchstechflasche mit iPSCs bei 37 °C in einem Wasserbad teilweise auftauen, bis ein kleines Stück Eis übrig bleibt.
   4. Geben Sie langsam 1 ml vorgewärmtes iPSC-Kulturmedium mit 12 μL ROCK-Inhibitor tropfenweise in die Zellen. Den flüssigen Inhalt der Durchstechflasche mit iPSCs tropfenweise in eine Vertiefung einer 6-Well-vorbeschichteten Platte mit einer 5-ml-Pipette überführen.
   5. Bewegen Sie die Platte in senkrechten Richtungen, um den Brunneninhalt zu mischen und die Platte in den Inkubator zurückzubringen. Wechseln Sie das iPSC-Kulturmedium nach 24 h nach dem Waschen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Kochsalzlösung (DPBS) (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
      HINWEIS: Fügen Sie ROCK-Hemmer nicht zu nachfolgenden Fütterungen hinzu. Wechseln Sie das iPSC-Kulturmedium täglich.
3. Subkulturierung von iPSCs
   1. Die matrixbeschichteten Platten bei RT oder im Inkubator bei 37 °C für 20-30 min vorwärmen. Die erforderliche Menge an iPSC-Kulturmedium bei RT vorwärmen.
   2. Das Kulturmedium von den Platten mit den Zellen absaugen. Spülen Sie die iPSCs mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
   3. Fügen Sie EDTA (0,5 mM) (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu. Inkubieren Sie die Platten bei 37 °C, bis sich die Ränder der Kolonien aus dem Brunnen heben (normalerweise 3-5 min). Saugen Sie die EDTA ab.
   4. Fügen Sie vorgewärmtes iPSC-Kulturmedium (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu und lösen Sie die iPSC-Kolonien einmal mit einer sterilen 10-ml-Pipette gewaltsam. Pipettieren Sie nicht auf und ab, da dies Zellklumpen in einzelne Zellen zerlegen kann.
   5. Der Inhalt jeder Vertiefung wird in zwei einzelne Vertiefungen in einer matrixbeschichteten 6-Well-Platte (2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) überführt und bei 37 °C inkubiert. Erzeugen Sie beim Pipettieren keine Blasen in der Suspension.
      HINWEIS: Schütteln Sie die Platte vorsichtig, bevor Sie sie im Inkubator aufbewahren. Das Split-Verhältnis kann 1:2 (eine Bohrung in 2 neue Bohrungen) bis 1:4 (eine Bohrung in 4 neue Bohrungen) betragen.
   6. Ersetzen Sie das Medium täglich, bis die Kolonien 60% Konfluenz mit guter Größe und Verbindungen erreichen.
4. Neuronale Induktion und neuronale Vorläufergenerierung
   1. Bereiten Sie 500 ml chemisch definiertes Medium (CDM), 500 ml neuronales Induktionsmedium (NIM) und 500 ml neural stem cell serumfreies (NSC SF) Medium vor.
   2. Spülen Sie die Zellen mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und fügen Sie NIM (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu. Als Tag 0 eingerichtet.
   3. Ersetzen Sie das NIM (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) an Tag 1, Tag 3 und Tag 4 und beobachten Sie täglich unter der Mikroskopie.
   4. An Tag 5 lösen Sie die neuronalen Rosetten wie unten beschrieben in die Suspensionskultur.
      1. Einmal vorsichtig mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) waschen. Fügen Sie Kollagenase IV hinzu (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und bewahren Sie sie 1 Minute in einem Inkubator auf. Die Kollagenase IV absaugen und einmal mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) vorsichtig waschen.
      2. Fügen Sie 2 ml NSC SF Medium pro Vertiefung zu einer 6-Well-Platte hinzu. Lösen Sie die Zellen, indem Sie die Böden der Vertiefungen abkratzen, indem Sie Gitter mit einer 200-μL-Pipettenspitze zeichnen.
      3. Sammeln Sie die Zellsuspension von der 6-Well-Platte in eine 10 cm nicht haftende Schale. Erhöhen Sie das Volumen mit NSC SF Medium auf 12 ml.
      4. Schütteln Sie die nicht haftende Schale bei 65-85 U/min auf einem Orbitalschüttler in einem Inkubator, um eine Aggregation zu verhindern.
5. DA-Neuronendifferenzierung
   1. An Tag 7 fügen Sie 12 ml CDM hinzu, ergänzt mit 100 ng / ml Fibroblasten-Wachstumsfaktor-8b (FGF-8b) und legen Sie die Schale auf den Orbitalschüttler im Inkubator.
   2. An den Tagen 8-13 das Medium alle 2 Tage wechseln und täglich unter der Mikroskopie beobachten.
   3. An Tag 14 fügen Sie 12 ml CDM hinzu, ergänzt mit 100 ng/ml FGF-8b und 1 μM Purmorphamin (PM). Stellen Sie die Schale auf den Orbitalschüttler im Inkubator.
   4. An den Tagen 15-20 wechseln Sie das Medium alle 2 Tage und beobachten die Zellen täglich unter der Mikroskopie.
   5. Durchlässigen Sie die Kugeln mechanisch, indem Sie 1000 μL-Spitzen verwenden, um die größeren Kugeln aufzubrechen.
      HINWEIS: Das Verhältnis kann 1:2 betragen (ein Gericht in 2 neue Gerichte).
6. Beendigung der Differenzierung
   1. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte oder Deckgläser mit Poly-L-Ornithin (PLO) und Laminin wie unten beschrieben.
      1. Beschichten Sie eine 6-Well-Platte mit 1 ml PLO pro Vertiefung und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 20 min. Saugen Sie die PLO-Lösung ab.
      2. Sterilisieren Sie die Platte unter UV für 20 min. Spülen Sie die Vertiefungen zweimal mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
      3. 5 μg/ml Lamininlösung (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) in die Vertiefung geben und bei 37 °C für 2 h inkubieren. Das Laminin absaugen und die Vertiefungen vor dem Plattieren einmal kurz mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) waschen.
   2. Alle Kugeln (ab Schritt 1.5.5) in 50-ml-Röhrchen sammeln und mit DPBS (1x) nachfüllen. Bei 300 × g 5 min schleudern. Asspirieren Sie den Überstand.
   3. Inkubieren Sie mit 2 ml Zelldissoziationsreagenz (siehe Materialtabelle) für 10 min bei 37 °C im Wasserbad, gefolgt von sanfter Verreibung mit einer 200 μL Pipette (20-50 mal je nach Größe der Kugeln, Vermeidung von Blasenbildung).
   4. Neutralisieren Sie das Zelldissoziationsreagenz mit 2 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fetalem Rinderserum (FBS) und zentrifugieren Sie das 50 ml konische Röhrchen mit den Zellen bei 300 × g für 5 min bei RT.
   5. Fügen Sie 1 ml CDM hinzu, ergänzt mit 10 ng / ml Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) und 10 ng / mL Gliazelllinien-abgeleitetem neurotrophem Faktor (GDNF), um die Zellpellets durch sanftes Pipettieren auf und ab zu resuspendieren, um Einzelzellsuspensionen zu erhalten.
   6. Die Lamininlösung wird von der Platte abgesaugt (Schritt 1.6.1.3), kurz mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) abgesaugt und die Zellen (ab Schritt 1.6.5) in die vorbeschichteten Platten oder Deckgläser in 3 ml CDM gesät, ergänzt mit 10 ng/ml BDNF und 10 ng/ml GDNF. Füttern Sie die Zellen alle 4 Tage.
      HINWEIS: Unterscheidungskulturen können für viele Wochen bis zu 3 Monate beibehalten werden. Die neuronale Morphologie tritt in der Regel nach 2 Wochen nach Beendigung auf und kann ab diesem Zeitpunkt für nachgeschaltete Analysen verwendet werden. BDNF und GDNF sind für die Kultivierung für längere Pflege (bis zu 2 Monate) nicht notwendig.
7. NSC-Erzeugung
   1. Matrixplatten beschichten.
   2. Sammeln Sie alle neuronalen Kugeln (generiert aus Schritt 1.4) in 50-ml-Röhrchen und füllen Sie sie mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-frei) auf. Bei 300 × g 5 min drehen. Saugen Sie die Überstände ab.
   3. Die Pellets mit 2 mL Zelldissoziationsreagenz für 10 min bei 37 °C im Wasserbad inkubieren, gefolgt von einer sanften Verreibung mit einer 200 μL Pipette (20-50 mal je nach Größe der Kugeln, Vermeidung von Blasenbildung).
   4. Neutralisieren Sie mit 2 ml DMEM mit 10% FBS und zentrifugieren Sie die 50 ml konischen Röhrchen mit den Zellen bei 300 × g für 5 min bei RT. Resuspendieren Sie die Zellpellets, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren, um einzellige Suspensionen zu erhalten.
   5. Die Matrixlösung aus einer vorbeschichteten Platte absaugen und die Zellen in die vorbeschichteten Platten in NSC SF Medium einsäen (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Füttern Sie die Zellen alle 2-3 Tage und teilen Sie die Zellen, wenn sie zusammenfließen.
      HINWEIS: Ab diesem Zeitpunkt können NSCs erweitert und eingefroren werden.
8. Differenzierung von Glia-Astrozyten
   1. Astrozyten-Differenzierung von NSCs
      1. Bereiten Sie 500 ml Astrozyten-Differenzierungsmedium vor.
      2. Saat-NSCs auf Poly-D-Lysin (PDL)-beschichteten Platten/Deckgläsern mit NSC SF Medium.
      3. Am nächsten Tag spülen Sie die Zellen mit DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-frei) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und fügen Astrocyte Differentiation Medium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu. Als Tag 0 eingerichtet.
      4. Beobachten Sie die NSCs täglich unter dem Mikroskop und ersetzen Sie das Astrozytendifferenzierungsmedium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) alle 2 Tage von Tag 1 bis 27.
   2. Astrozyten-Reifung
      1. Astrozyten-Reifungsmedium vorbereiten.
      2. Am Tag 28 spülen Sie die Zellen mit DPBS (1x) (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) und fügen Sie Astrozyten-Reifungsmedium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) hinzu.
      3. Beobachten Sie am Tag 29 und danach die Zellen täglich unter dem Mikroskop und ersetzen Sie das Astrozyten-Reifungsmedium (3 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) alle 2 Tage.
      4. Nach einem Monat Reifung expandieren Sie die Zellen und kryokonservieren sie ab diesem Stadium.
         HINWEIS: Während dieser Phase erhöht sich die Anzahl der Zellen. Bei der Spaltung der Zellen sind PDL-beschichtete Deckgläser für die Kultivierung nicht notwendig.

2. Zellcharakterisierung durch Immunzytochemie und Immunfluoreszenzfärbung

1. Am Ende der Kulturperiode die Deckgläser mit den Zellen auf eine 12-Well-Platte übertragen.
   Spülen Sie die Zellen zweimal mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) (1x) und inkubieren Sie für 10 min in 4% Paraformaldehyd (PFA) (0,5 ml pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte) bei RT.
   HINWEIS: Die fixierte Probe kann mit 2 ml PBS (1x) abgedeckt und bei 4 °C gelagert werden, bis sie für die Immunfärbung erforderlich ist. PFA ist giftig und steht im Verdacht, Krebs zu verursachen. Verhindern Sie Haut- und Augenexposition und arbeiten Sie unter einem chemischen Abzug.
2. Blockieren und permeabilisieren Sie die Zellen und inkubieren Sie mit Blockierpuffer, der PBS (1x), 0,3% Triton X-100 und 10% normales Ziegenserum für 1 h bei RT enthält.
3. Inkubation mit primären Antikörpern im Blockierungspuffer über Nacht bei 4 °C: Färbung von iPSCs mit Anti-Oktamer-bindendem Transkriptionsfaktor 4 (Oct4) und anti-stage-spezifischem embryonalem Antigen-4 (SSEA4), NSCs mit anti-geschlechtsbestimmender Region Y box-2 (Sox2) und Anti-Nestin, neuronale Sphären mit anti-paired box-6 (Pax6) und Anti-Nestin, Astrozyten mit anti-glialem fibrillärem saurem Protein (GFAP) und Anti-S100-Calcium-bindendem Protein β (S100β) und DA-Neuronen mit Anti-Tyrosinhydroxylase (TH), Anti-β-III-Tubulin (Tuj 1), Anti-Synaptophysin und Anti-PSD-95 (0,5 ml primäre Antikörperlösung pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte; Einzelheiten siehe Materialtabelle ).
4. Die Proben mit PBS (1x) dreimal für jeweils 10 min unter leichtem Schaukeln waschen.
5. Inkubieren Sie mit sekundärer Antikörperlösung (1:800 im Blockierpuffer, 0,5 ml Alexa Fluor Sekundärantikörperlösung pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte) für 1 h bei RT mit leichtem Schaukeln.
6. Inkubieren Sie die Zellen mit Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 ml pro Vertiefung in einer 12-Well-Platte) in PBS (1x) für 15 min bei RT, um die Kerne zu markieren.
7. Montieren Sie die Zellen mit Montagemedium und trocknen Sie über Nacht bei RT für die Bildgebung unter einem Fluoreszenzmikroskop im Dunkeln. Siehe Ergänzende Abbildung S1 für die Mikroskopeinstellungen und -parameter.

3. Durchflusszytometrische Messung des mitochondrialen Volumens, MMP und mitochondrialen ROS in lebenden Zellen

1. Säen Sie die Zellen separat in 4 Vertiefungen in einer 6-Well-Platte, bis die Zellen 50% -60% Konfluenz erreichen. Beschriften Sie diese vier Brunnen als #1, #2, #3 und #4.
2. Am Ende der Kulturperiode 5 einzelne Färbelösungen (500 μL pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) wie folgt vorbereiten: #1 nur Kulturmedium (bis Vertiefung #1 enthält nur Zellen zur Kontrolle); #2-1 mit FCCP (100 μM); #2-2 mit FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) im Kulturmedium; #3 mit TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) im Kulturmedium; #4 mit MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) in PBS (1x) mit 10% FBS. Siehe Abbildung 1A, Zusatztabelle S2 und Materialtabelle für Details zu diesen Verbindungen und dem Aufbau der Durchflusszytometrie.
   HINWEIS: Verwenden Sie das Kulturmedium, um die Färbelösung vorzubereiten. Erwärmen Sie das Medium und PBS (1x) bei RT vor dem Gebrauch. FCCP ist giftig; Verhindern Sie Haut- und Augenexposition und arbeiten Sie unter einem chemischen Abzug.
3. Saugen Sie das Medium aus der #2-Welle ab und fügen Sie #2-1-Lösung hinzu (nur FCCP). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 10 min.
4. Saugen Sie das Medium aus #2 und #3 Wells ab und fügen Sie #2-2 Lösung (FCCP + TMRE + MTG) in der #2 Welle und #3 Lösung (TMRE + MTG) in #3 hinzu. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 45 min.
5. Saugen Sie das Medium aus der #4-Welle ab und fügen Sie die #4-Lösung hinzu (MitoSox Red + MTG). Inkubieren Sie die Zellen bei 37 °C für 15 min.
6. Saugen Sie das Medium aus allen Bohrlöchern ab. Mit PBS (1x) waschen (4 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte). Lösen Sie die Zellen mit 1 ml Zelldissoziationsreagenz (1 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte) bei 37 °C für 5 min. Neutralisieren Sie das Zelldissoziationsreagenz in 1 ml DMEM mit 10% FBS (2 ml pro Vertiefung in einer 6-Well-Platte).
7. Sammeln Sie den Inhalt aller Vertiefungen in konischen 15-ml-Röhrchen. Zentrifugieren Sie die Röhrchen bei 300 × g für 5 min. Waschen Sie die Pellets ein- bis zweimal mit PBS (1x).
8. Die Überstände absaugen, aber etwa 100 μL in den Röhrchen belassen. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 300 μL PBS (1x). Übertragen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Halten Sie die Röhren bei RT im Dunkeln.
9. Analysieren Sie die Zellen mit einem Durchflusszytometer (mit einer 3 blauen und 1 roten Laserkonfiguration). Erkennen Sie MTG in Filter 1 (FL1) mit einem 530/30-Bandpassfilter, TMRE in Filter 2 (FL2) mit dem Bandpassfilter 585/40 und MitoSox Red in Filter 3 (FL3) mit einem 510/580-Bandpassfilter.

4. Durchflusszytometrische Messung von MRC-komplexen Untereinheiten und TFAM in festen Zellen

1. Am Ende der Kulturperiode lösen Sie die Zellen (~ 10⁶) durch Zugabe des Zelldissoziationsreagenzes; Dann pelletieren und sammeln Sie die Zellen in einem 15-ml-Röhrchen. Die Zellen werden zweimal mit PBS (1x) durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min gewaschen.
2. Fixieren Sie die Zellen in 1,6% PFA (1 ml 1,6% PFA in einem 15 ml Röhrchen) bei RT für 10 min. Die Zellen werden zweimal mit PBS (1x) durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min gewaschen.
3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit eiskaltem 90% Methanol (1 mL 90% Methanol in einem 15 ml Röhrchen) bei -20 °C für 20 min.
4. Blockieren Sie die Proben in einem Blockierpuffer, der 0,3 M Glycin, 5% Ziegenserum und 1% Rinderserumalbumin (BSA) - Fraktion V in PBS (1x) enthält (1 ml Blockierpuffer in einem 15-ml-Röhrchen). Die Zellen werden zweimal mit PBS (1x) zentrifugiert (wie in Schritt 3.7).
5. Inkubieren Sie die Zellen mit den folgenden primären Antikörpern für 30 min: Anti-NDUFB10 (1:1.000) zur Messung der Komplex-I-Untereinheit, Anti-Succinat-Dehydrogenase-Komplex-Flavoprotein-Untereinheit A (SDHA, 1:1.000) zur Messung der Komplex-II-Untereinheit und Anti-COX IV (1:1.000) zur Messung der komplexen IV-Untereinheit und Anti-TFAM-Antikörper konjugiert mit Alexa Fluor 488 (1:400). Färben Sie die gleiche Anzahl von Zellen separat mit Anti-TOMM20-Antikörpern, die mit Alexa Fluor 488 (1:400) konjugiert sind, für 30 min (1 ml primäre Antikörperlösung in einem 15-ml-Röhrchen; Details zu den Antikörpern finden Sie in der Materialtabelle ).
6. Die Zellen mit PBS (1x) einmal bei Zentrifugation bei 300 × g für 5 min waschen. Fügen Sie sekundäre Antikörper (1:400) in Röhrchen mit NDUFB10, SDHA und COX IV hinzu und inkubieren Sie die Zellen mit diesen Lösungen für 30 min.
7. Waschen Sie die Zellen einmal mit PBS (1x) durch Zentrifugieren bei 300 × g für 5 min. Die Überstände werden abgesaugt, wobei etwa 100 μL in den Röhrchen verbleiben. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 300 μL PBS (1x). Übertragen Sie die Zellen in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, die im Dunkeln auf Eis aufbewahrt werden.
8. Analysieren Sie die Zellen auf dem Durchflusszytometer (mit einer 3 blauen und 1 roten Laserkonfiguration). Erkennen Sie Signale in Filter 1 (FL1) mit einem 530/30-Bandpassfilter. Siehe Ergänzende Abbildung S2 für die Einstellungen und Parameter des Mikroskops.

5. Erfassung und Analyse der Durchflusszytometrie

1. Verwenden Sie das nicht gefärbte Steuerrohr, um die Vorwärtsstreuflächen- (FSC-A) und Seitenstreuflächendiagramme (SSC-A) basierend auf der Größe und Komplexität der analysierten Zellpopulation festzulegen. Siehe Ergänzende Abbildung S2 für die Einstellungen und Parameter des Mikroskops.
   HINWEIS: Richten Sie nicht gefärbte Kontrollen für einzelne Zelltypen ein.
2. Verwenden Sie die Nicht-Fleckenkontrollröhrchen, um die positiven Gatter auszuwählen, und verwenden Sie einfarbige Steuerröhren, um die spektrale Überlappung der Fluoreszenz-Spektralüberlappung zwischen MTG (Fluorophor-1 [FL-1]) und TMRE (FL-2) in der Mehrfarben-Durchflusszytometrie zu kompensieren. Verwenden Sie die Isotypkontrolle für die Negativkontrolle, um die Hintergrundfärbung in MRC- und TFAM-Proben zu überwachen. Verwenden Sie die FCCP-Röhre als Depolarisationskontrolle für die TMRE-Färbung.
3. Gate aus Fremdkörpern, um stromführende Zellen und die Hauptansteuerung aus dem Vorwärts- und Seitenstreudiagramm auszuwählen (Abbildung 2A). Gate out-Dubletten unter Verwendung eines Vorwärtsstreuhöhen- (FSC-H) versus (vs.) FSC-A-Dichtediagramms, um Dubletten auszuschließen und auch ein Seitenstreuhöhendiagramm (SSC-H) vs. SSC-A-Diagramm zu konstruieren (Abbildung 2A).
4. Datenerfassung (Durchflusszytometer)
   1. Verwenden Sie die ungefärbten oder isotypischen Proben als Negativkontrolle, um ein Tor über der Hauptpopulation der Einzelzellereignisse zu erstellen, während Sie SSC-A und die verschiedenen Filter (FL1, FL2, FL3, FL4) betrachten (Abbildung 1B und Abbildung 2B).
5. Datenanalyse (CFlow Software)
   1. Kopieren Sie die Position der Gatter auf die gefärbten Zellproben und notieren Sie die Menge der positiv gefärbten Zellen für die positive Färbung.
   2. Wählen Sie für jede Zellsubpopulation ein Histogrammdiagramm aus und analysieren Sie die mediane Fluoreszenzintensität (MFI) der verschiedenen Filterkanäle (FL1, FL2, FL3, FL4) (x-Achse).
      1. Berechnen Sie die TMRE-Werte, indem Sie den MFI von FL2 von #2 FCCP-behandelten Zellen vom MFI von FL2 von #3 TMRE-gefärbten Proben in einem Histogramm subtrahieren, wie in Eq (1) unten.
         TMRE-Werte = MFI von FL2 aus #3 TMRE-gefärbten Proben - MFI von FL2 von #2 FCCP-behandelten Zellen (1)
      2. Berechnen Sie die spezifischen Werte für MMP und mitochondriale ROS durch MFI in TMRE oder MitoSox Red, wobei der mitochondriale Volumenindikator MTG dividiert wird.
      3. Berechnen Sie den spezifischen Wert für komplexe Untereinheiten und TFAM, indem Sie MFI in komplexer Expression oder TFAM verwenden, wobei der mitochondriale Volumenindikator TOMM20 dividiert wird.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ergebnisse

Eine schematische Beschreibung der Differenzierungsmethode und der durchflusszytometrischen Strategien ist in Abbildung 3 dargestellt. Humane iPS-Zellen werden in neuronale Rosetten differenziert und dann zur Differenzierung in neuronale Sphären in die Suspensionskultur gehoben. Neuronale Sphären werden weiter differenziert und zu DA-Neuronen gereift. Neuronale Kugeln werden in einzelne Zellen dissoziiert, um gliale Astrozyten zu erzeugen, die in Monoschichten als NSCs umplattiert und dann...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Diskussion

Hierin befinden sich Protokolle zur Erzeugung von iPSC-abgeleiteten Neuronen und Astrozyten und zur Bewertung mehrerer Aspekte der mitochondrialen Funktion mittels Durchflusszytometrie. Diese Protokolle ermöglichen eine effiziente Umwandlung menschlicher iPS-Zellen in Neuronen und Glia-Astrozyten und die detaillierte Charakterisierung der mitochondrialen Funktion, hauptsächlich in lebenden Zellen. Die Protokolle bieten auch eine auf der Durchflusszytometrie basierende Strategie zur Erfassung und Analyse mehrerer mitoch...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A	PeproTech	120-14E	Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium	Lonza	CC-3187	Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack	Lonza	CC-4123	Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF	PeproTech	450-02	DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer	BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12103C	Medium ingredient
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31765027	Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human	Sigma-Aldrich	SRP3055	Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human	Sigma-Aldrich	I3769	Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	12660012	Basal medium for NSC culture
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048	Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement	Thermo Fisher Scientific	A10508-01	Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific	12604013	Cell dissociation reagent
Transferrin	Roche	652202	CDM ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE	Abcam	ab113852	Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA