Análisis citométrico de flujo de múltiples parámetros mitocondriales en células madre pluripotentes inducidas por humanos y sus derivados neuronales y gliales

Resumen

Este estudio informa un enfoque novedoso para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales basados en citometría de flujo y tinción doble con dos reporteros fluorescentes o anticuerpos para detectar cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de la membrana mitocondrial, el nivel de especies reactivas de oxígeno, la composición de la cadena respiratoria mitocondrial y el ADN mitocondrial.

Resumen

Las mitocondrias son importantes en la fisiopatología de muchas enfermedades neurodegenerativas. Los cambios en el volumen mitocondrial, el potencial de membrana mitocondrial (MMP), la producción mitocondrial de especies reactivas de oxígeno (ROS) y el número de copias del ADN mitocondrial (ADNmt) son a menudo características de estos procesos. Este informe detalla un nuevo enfoque basado en la citometría de flujo para medir múltiples parámetros mitocondriales en diferentes tipos de células, incluidas las células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) y las células neurales y gliales derivadas de iPSC. Esta estrategia basada en el flujo utiliza células vivas para medir el volumen mitocondrial, MMP y niveles de ROS, así como células fijas para estimar los componentes de la cadena respiratoria mitocondrial (MRC) y las proteínas asociadas al ADNmt, como el factor de transcripción mitocondrial A (TFAM).

Al co-teñir con reporteros fluorescentes, incluyendo MitoTracker Green (MTG), tetramethylrhodamine ethyl ester (TMRE) y MitoSox Red, los cambios en el volumen mitocondrial, MMP y ROS mitocondrial pueden cuantificarse y relacionarse con el contenido mitocondrial. La doble tinción con anticuerpos contra subunidades del complejo MRC y translocasa de la membrana mitocondrial externa 20 (TOMM20) permite la evaluación de la expresión de la subunidad MRC. Como la cantidad de TFAM es proporcional al número de copias de ADNmt, la medición de TFAM por TOMM20 da una medición indirecta de ADNmt por volumen mitocondrial. Todo el protocolo se puede llevar a cabo en 2-3 h. Es importante destacar que estos protocolos permiten la medición de parámetros mitocondriales, tanto a nivel total como a nivel específico por volumen mitocondrial, utilizando citometría de flujo.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos esenciales presentes en casi todas las células eucariotas. Las mitocondrias son responsables del suministro de energía mediante la producción de trifosfato de adenosina (ATP) a través de la fosforilación oxidativa y actúan como intermediarios metabólicos para la biosíntesis y el metabolismo. Las mitocondrias están profundamente involucradas en muchos otros procesos celulares importantes, como la generación de ROS, la muerte celular y la regulación intracelular de Ca²⁺. La disfunción mitocondrial se ha asociado con diversas enfermedades neurodegenerativas, incluyendo la enfermedad de Parkinson (EP), la enfermedad de Alzheimer (EA), la enfermedad de Huntington (HD), la ataxia de Friedreich (FRDA) y la esclerosis lateral amiotrófica (ELA)¹. También se cree que el aumento de la disfunción mitocondrial y la anomalía del ADNmt contribuyen al envejecimiento humano ^2,3.

Varios tipos de disfunción mitocondrial ocurren en enfermedades neurodegenerativas, y los cambios en el volumen mitocondrial, la despolarización MMP, la producción de ROS y las alteraciones en el número de copias de ADNmt son comunes 4,5,6,7. Por lo tanto, la capacidad de medir estas y otras funciones mitocondriales es de gran importancia cuando se estudian los mecanismos de la enfermedad y se prueban posibles agentes terapéuticos. Además, en vista de la falta de modelos animales que repliquen fielmente las enfermedades neurodegenerativas humanas, el establecimiento de sistemas modelo in vitro adecuados que recapitulen la enfermedad humana en las células cerebrales es un paso importante hacia una mayor comprensión de estas enfermedades y el desarrollo de nuevas terapias 2,3,8,9.

Las iPSC humanas se pueden usar para generar varias células cerebrales, incluidas las células neuronales y no neuronales (es decir, células gliales), y se ha encontrado daño mitocondrial asociado con la enfermedad neurodegenerativa en ambos tipos de células 3,10,11,12,13. Se dispone de métodos apropiados para la diferenciación de iPSC en linajes neuronales y gliales^14,15,16. Estas células proporcionan una plataforma única para el modelado de enfermedades in vitro y la detección de fármacos. Además, como estos se derivan de pacientes, las neuronas derivadas de iPSC y las células gliales proporcionan modelos de enfermedades que reflejan lo que está sucediendo en los humanos con mayor precisión.

Hasta la fecha, se dispone de pocos métodos convenientes y confiables para medir múltiples parámetros funcionales mitocondriales en iPSC, particularmente neuronas vivas y células gliales. El uso de la citometría de flujo proporciona al científico una poderosa herramienta para medir parámetros biológicos, incluida la función mitocondrial, en células individuales. Este protocolo proporciona detalles para la generación de diferentes tipos de células cerebrales, incluidas las células madre neurales (NSC), las neuronas y los astrocitos gliales de iPSC, así como nuevos enfoques basados en citometría de flujo para medir múltiples parámetros mitocondriales en diferentes tipos de células, incluidas las iPSC y las células neuronales y gliales derivadas de iPSC. El protocolo también proporciona una estrategia de tinción conjunta para usar citometría de flujo para medir el volumen mitocondrial, MMP, nivel de ROS mitocondriales, complejos MRC y TFAM. Al incorporar medidas de volumen o masa mitocondrial, estos protocolos también permiten la medición tanto del nivel total como del nivel específico por unidad mitocondrial.

Protocolo

NOTA: Consulte la Tabla de materiales y la Tabla suplementaria S1 para obtener recetas de todos los medios y soluciones utilizados en este protocolo.

1. Diferenciación de iPSCs humanas en NCSs, neuronas dopaminérgicas (DA) y astrocitos

1. Prepare placas recubiertas de matriz.
   1. Descongele un vial de 5 ml de matriz en hielo durante la noche. Diluir 1 mL de matriz con 99 mL de Cold Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 (Advanced DMEM/F12) (1% de concentración final). Hacer 1 ml de alícuotas y almacenarlas a -20 °C.
   2. Descongele la solución de matriz a 4 °C (manténgala fría) y cubra 6 pocillos (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
   3. Coloque la placa recubierta de matriz en una incubadora de aire humidificada al 5% de CO₂/95% a 37 °C durante 1 h. Saque la placa de la incubadora y deje que se equilibre a temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Se recomienda utilizar la placa dentro de los 3 días posteriores al recubrimiento. Sin embargo, la placa recubierta puede conservarse hasta 2 semanas a 4 °C. Solo recuerde sacarlo y dejar que se caliente a RT antes de usarlo. Para un almacenamiento prolongado, agregue 1 ml de medio de cultivo iPSC a la placa recubierta para evitar el secado de la matriz.
2. Descongelación de iPSCs
   1. Precaliente las placas recubiertas de matriz a RT o en la incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Precaliente la cantidad requerida de medio de cultivo iPSC en RT.
   2. Mezclar 6 ml de medio de cultivo iPSC precalentado con 12 μL de inhibidor ROCK Y-27632 para obtener una concentración final de 10 μM.
   3. Descongelar parcialmente el vial congelado de iPSCs a 37 °C en un baño maría hasta que quede un pequeño trozo de hielo.
   4. Añadir lentamente 1 ml de medio de cultivo iPSC precalentado con 12 μL de inhibidor de ROCK gota a gota a las células. Transfiera el contenido líquido del vial con iPSCs gota a gota a un pocillo de una placa prerecubierta de 6 pocillos utilizando una pipeta de 5 ml.
   5. Mueva la placa en direcciones perpendiculares para mezclar el contenido del pozo y devolver la placa a la incubadora. Cambie el medio de cultivo iPSC después de 24 h después del lavado con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco (1x) (libre de Ca 2+/Mg²⁺) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
      NOTA: No agregue inhibidor de ROCK a las alimentaciones posteriores. Cambie el medio de cultivo iPSC diariamente.
3. Subcultivo de iPSCs
   1. Precaliente las placas recubiertas de matriz a RT o en la incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Precaliente la cantidad requerida de medio de cultivo iPSC en RT.
   2. Aspirar el medio de cultivo de las placas que contienen las células. Enjuague las iPSC con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-libre) (4 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos).
   3. Agregue EDTA (0.5 mM) (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Incubar las placas a 37 °C hasta que los bordes de las colonias comiencen a levantarse del pozo (generalmente 3-5 min). Aspirar el EDTA.
   4. Añadir el medio de cultivo iPSC precalentado (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) y separar con fuerza las colonias de iPSC con una pipeta estéril de 10 ml una vez. No pipetear hacia arriba y hacia abajo, ya que esto puede romper los grupos de células en células individuales.
   5. Transfiera el contenido de cada pocillo a dos pocillos individuales en una placa de 6 pocillos recubierta de matriz (2 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) e incube a 37 °C. No genere burbujas en la suspensión durante el pipeteo.
      NOTA: Agite el plato suavemente antes de guardarlo en la incubadora. La proporción de división puede ser de 1:2 (un pozo en 2 pozos nuevos) a 1:4 (un pozo en 4 pozos nuevos).
   6. Reemplazar el medio diariamente hasta que las colonias alcancen el 60% de confluencia con buen tamaño y conexiones.
4. Inducción neuronal y generación de progenitores neuronales
   1. Prepare 500 ml de medio químicamente definido (CDM), 500 ml de medio de inducción neural (NIM) y 500 ml de medio sin suero de células madre neurales (NSC SF).
   2. Enjuague las células con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-libre) (4 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos) y agregue NIM (3 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos). Configurado como Día 0.
   3. Reemplace el NIM (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) el día 1, el día 3 y el día 4 y observe bajo la microscopía diariamente.
   4. El día 5, separe las rosetas neurales en un cultivo de suspensión como se describe a continuación.
      1. Lavar una vez suavemente con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-libre) (4 mL por pocillo en un plato de 6 pocillos). Agregue colagenasa IV (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) y manténgala en una incubadora durante 1 minuto. Aspire suavemente la colagenasa IV y lávela una vez con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
      2. Agregue 2 ml de medio NSC SF por pocillo a una placa de 6 pocillos. Separe las células raspando los fondos de los pocillos dibujando rejillas con una punta de pipeta de 200 μL.
      3. Recoja la suspensión celular de la placa de 6 pocillos en un plato no adherente de 10 cm. Enrasar el volumen a 12 ml con NSC SF Medium.
      4. Agite el plato no adherente a 65-85 rpm en un agitador orbital en una incubadora para evitar la agregación.
5. Diferenciación de neuronas DA
   1. El día 7, agregue 12 ml de CDM suplementado con 100 ng / ml de factor de crecimiento de fibroblastos-8b (FGF-8b) y coloque el plato en el agitador orbital en la incubadora.
   2. En los días 8-13, cambie el medio cada 2 días y observe bajo la microscopía diariamente.
   3. El día 14, agregue 12 ml de CDM suplementado con 100 ng / ml FGF-8b y 1 μM de purmorfamina (PM). Coloque el plato en el agitador orbital de la incubadora.
   4. En los días 15-20, cambie el medio cada 2 días y observe las células bajo la microscopía diariamente.
   5. Paso mecánico de las esferas mediante el uso de puntas de 1000 μL para romper las esferas más grandes.
      NOTA: La proporción puede ser de 1:2 (un plato en 2 platos nuevos).
6. Terminación de la diferenciación
   1. Cubra una placa o cubreobjetos de 6 pocillos con poli-L-ornitina (PLO) y laminina como se describe a continuación.
      1. Cubra una placa de 6 pocillos con 1 ml de PLO por pocillo e incube la placa a 37 °C durante 20 min. Aspirar la solución de PLO.
      2. Esterilice la placa bajo UV durante 20 min. Enjuague los pocillos dos veces con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
      3. Añadir 5 μg/ml de solución de laminina (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) al pocillo e incubar a 37 °C durante 2 h. Aspire la laminina y lave los pocillos brevemente con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) una vez antes de enchapar.
   2. Recoja todas las esferas (del paso 1.5.5) en tubos de 50 ml y recargue con DPBS (1x). Girar a 300 × g durante 5 min. Aspirar el sobrenadante.
   3. Incubar con 2 ml de reactivo de disociación celular (ver tabla de materiales) durante 10 min a 37 °C en un baño maría, seguido de una trituración suave con una pipeta de 200 μL (20-50 veces dependiendo del tamaño de las esferas, evitando la formación de burbujas).
   4. Neutralizar el reactivo de disociación celular con 2 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) con 10% de suero bovino fetal (FBS) y centrifugar el tubo cónico de 50 mL que contiene las células a 300 × g durante 5 min en RT. Aspirar el sobrenadante.
   5. Agregue 1 ml de CDM suplementado con 10 ng / ml de factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) y 10 ng / ml de factor neurotrófico derivado de la línea celular glial (GDNF) para resuspender los gránulos celulares pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para obtener suspensiones de células individuales.
   6. Aspirar la solución de laminina de la placa (paso 1.6.1.3), lavar brevemente con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) y sembrar las células (a partir del paso 1.6.5) en las placas prerecubiertas o cubreobjetos en 3 ml de MDL suplementado con 10 ng/ml de BDNF y 10 ng/ml de GDNF. Alimente las células cada 4 días.
      NOTA: Los cultivos diferenciadores se pueden mantener durante muchas semanas hasta 3 meses. La morfología neural generalmente aparece después de 2 semanas de terminación y se puede usar para análisis posteriores a partir de ese momento. BDNF y GDNF no son necesarios para el cultivo para un mantenimiento más prolongado (hasta 2 meses).
7. Generación NSC
   1. Placas matriciales de recubrimiento.
   2. Recopile todas las esferas neuronales (generadas a partir del paso 1.4) en tubos de 50 ml y recargue con DPBS (1x) (libre de Ca 2+/Mg²⁺). Girar a 300 × g durante 5 min. Aspirar los sobrenadantes.
   3. Incubar los gránulos con 2 ml de reactivo de disociación celular durante 10 min a 37 °C en un baño maría, seguido de una trituración suave con una pipeta de 200 μL (20-50 veces dependiendo del tamaño de las esferas, evitando la formación de burbujas).
   4. Neutralizar con 2 mL de DMEM con 10% de FBS y centrifugar los tubos cónicos de 50 mL que contienen las células a 300 × g durante 5 min en RT. Aspirar los sobrenadantes. Resuspenda los gránulos celulares pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para obtener suspensiones de una sola célula.
   5. Aspirar la solución de matriz de una placa prerecubierta y sembrar las células en las placas prerecubiertas en medio NSC SF (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Alimente las células cada 2-3 días y divida las células cuando sean confluentes.
      NOTA: A partir de esta etapa, los NSC se pueden expandir y congelar.
8. Diferenciación de astrocitos gliales
   1. Diferenciación de astrocitos de NSCs
      1. Preparar 500 mL de medio de diferenciación de astrocitos.
      2. NSC de semillas en placas/cubreobjetos recubiertos de poli-D-lisina (PDL) con medio NSC SF.
      3. Al día siguiente, enjuague las células con DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-libre) (4 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos) y agregue medio de diferenciación de astrocitos (3 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos). Configurado como Día 0.
      4. Observe las NSC bajo el microscopio diariamente y reemplace el medio de diferenciación de astrocitos (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) cada 2 días desde los días 1 hasta el 27.
   2. Maduración de astrocitos
      1. Preparar el medio de maduración de astrocitos.
      2. El día 28, enjuague las células con DPBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) y agregue medio de maduración de astrocitos (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos).
      3. En el día 29 en adelante, observe las células bajo el microscopio diariamente y reemplace el medio de maduración de astrocitos (3 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) cada 2 días.
      4. Después de un mes de maduración, expanda las células y criopreserve a partir de esta etapa.
         NOTA: Durante esta fase, el número de celdas aumentará. Al dividir las células, los cubreobjetos recubiertos con PDL no son necesarios para el cultivo.

2. Caracterización celular por inmunocitoquímica y tinción por inmunofluorescencia

1. Al final del período de cultivo, transfiera los cubreobjetos con las células a una placa de 12 pocillos.
   Enjuague las células con solución salina tamponada con fosfato (PBS) (1x) dos veces e incube durante 10 minutos en paraformaldehído al 4% (PFA) (0,5 ml por pocillo en una placa de 12 pocillos) en RT.
   NOTA: La muestra fija puede cubrirse con 2 ml de PBS (1x) y almacenarse a 4 °C hasta que sea necesario para la inmunotinción. La PFA es tóxica y se sospecha que causa cáncer. Evite la exposición de la piel y los ojos, y trabaje bajo una campana de humo químico.
2. Bloquear y permeabilizar las células e incubar con tampón de bloqueo que contiene PBS (1x), 0,3% Triton X-100 y 10% de suero de cabra normal durante 1 h en RT.
3. Incubar con anticuerpos primarios en tampón de bloqueo durante la noche a 4 °C: tinción de iPSCs con factor de transcripción de unión a octameros 4 (Oct4) y antígeno-4 embrionario antiestadio específico (SSEA4), NSC con región antideterminante del sexo Y box-2 (Sox2) y anti-Nestin, esferas neurales con anti-pareado box-6 (Pax6) y anti-Nestin, astrocitos con proteína ácida fibrilar anti-glial (GFAP) y proteína de unión al calcio anti-S100 β (S100β), y neuronas DA con anti-tirosina hidroxilasa (TH), anti-β III Tubulina (Tuj 1), anti-Sinaptofisina, y anti-PSD-95 (0,5 ml de solución de anticuerpos primarios por pocillo en una placa de 12 pocillos; consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles).
4. Lave las muestras con PBS (1x) tres veces durante 10 minutos cada una con un balanceo suave.
5. Incubar con solución de anticuerpos secundarios (1:800 en tampón de bloqueo, 0,5 ml de solución de anticuerpos secundarios de Alexa Fluor por pocillo en una placa de 12 pocillos) durante 1 h en RT con balanceo suave.
6. Incubar las células con Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 ml por pocillo en una placa de 12 pocillos) en PBS (1x) durante 15 min en RT para marcar los núcleos.
7. Monte las células con medio de montaje y séquelas durante la noche en RT para obtener imágenes bajo un microscopio de fluorescencia en la oscuridad. Consulte la Figura suplementaria S1 para conocer los ajustes y parámetros del microscopio.

3. Medición por citometría de flujo del volumen mitocondrial, MMP y ROS mitocondrial en células vivas

1. Sembrar las células por separado en 4 pocillos en una placa de 6 pocillos hasta que las células alcancen una confluencia del 50% -60%. Etiquete estos cuatro pozos como #1, #2, #3 y #4.
2. Al final del período de cultivo, preparar 5 soluciones de tinción individuales (500 μL por pocillo en una placa de 6 pocillos) de la siguiente manera: #1 solo medio de cultivo (hasta el pozo #1 que contiene solo células para control); #2-1 que contiene FCCP (100 μM); #2-2 que contiene FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) en medio de cultivo; #3 que contiene TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) en medio de cultivo; #4 que contiene MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) en PBS (1x) con 10% de FBS. Consulte la Figura 1A, la Tabla suplementaria S2 y la Tabla de materiales para obtener detalles sobre estos compuestos y la configuración de la citometría de flujo.
   NOTA: Utilice el medio de cultivo para preparar la solución de tinción. Caliente el medio y PBS (1x) en RT antes de usar. FCCP es tóxico; Evite la exposición de la piel y los ojos y trabaje bajo una campana de humos químicos.
3. Aspire el medio del pocillo # 2 y agregue la solución # 2-1 (solo FCCP). Incubar las células a 37 °C durante 10 min.
4. Aspire el medio de los pozos #2 y #3 y agregue la solución #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) en el pozo #2 y la solución #3 (TMRE + MTG) en #3. Incubar las células a 37 °C durante 45 min.
5. Aspirar el medio del pozo #4 y añadir la solución #4 (MitoSox Red + MTG). Incubar las células a 37 °C durante 15 min.
6. Aspirar el medio de todos los pocillos. Lavar con PBS (1x) (4 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos). Separar las células utilizando 1 ml de reactivo de disociación celular (1 ml por pocillo en una placa de 6 pocillos) a 37 °C durante 5 min. Neutralizar el reactivo de disociación celular en 1 mL de DMEM con FBS al 10% (2 mL por pocillo en una placa de 6 pocillos).
7. Recoja el contenido de todos los pocillos en tubos cónicos de 15 ml. Centrifugar los tubos a 300 × g durante 5 min. Lave los gránulos con PBS (1x) una o dos veces.
8. Aspirar los sobrenadantes pero dejar aproximadamente 100 μL en los tubos. Resuspender los gránulos celulares en 300 μL de PBS (1x). Transfiera las células a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml. Mantenga los tubos en la oscuridad en RT.
9. Analice las células utilizando un citómetro de flujo (con una configuración de láser azul 3 y 1 rojo). Detecte MTG en el filtro 1 (FL1) utilizando un filtro de paso de banda 530/30, TMRE en el filtro 2 (FL2) utilizando el filtro de paso de banda 585/40 y MitoSox Red en el filtro 3 (FL3) utilizando un filtro de paso de banda 510/580.

4. Medición por citometría de flujo de subunidades del complejo MRC y TFAM en células fijas

1. Al final del período de cultivo, separar las células (~10⁶) añadiendo el reactivo de disociación celular; luego, pellet y recoger las células en un tubo de 15 ml. Lavar las células por centrifugación con PBS (1x) dos veces centrifugando a 300 × g durante 5 min.
2. Fijar las células en PFA al 1,6% (1 ml de PFA al 1,6% en un tubo de 15 ml) a RT durante 10 min. Lavar las células por centrifugación con PBS (1x) dos veces centrifugando a 300 × g durante 5 min.
3. Permeabilizar las células con metanol helado al 90% (1 ml de metanol al 90% en un tubo de 15 ml) a -20 °C durante 20 min.
4. Bloquear las muestras en tampón de bloqueo que contenga 0,3 M de glicina, 5% de suero de cabra y 1% de albúmina sérica bovina (BSA) - Fracción V en PBS (1x) (1 ml de tampón de bloqueo en un tubo de 15 ml). Lavar las células por centrifugación con PBS (1x) dos veces (como en el paso 3.7).
5. Incubar las células con los siguientes anticuerpos primarios durante 30 min: anti-NDUFB10 (1:1.000) para la medición de la subunidad del complejo I, anti-succinato deshidrogenasa complejo flavoproteína subunidad A (SDHA, 1:1.000) para la medición de la subunidad del complejo II y anti-COX IV (1:1.000) para la medición de la subunidad del complejo IV, y anticuerpo anti-TFAM conjugado con Alexa Fluor 488 (1:400). Tiñe el mismo número de células por separado con el anticuerpo anti-TOMM20 conjugado con Alexa Fluor 488 (1:400) durante 30 min (1 ml de solución de anticuerpos primarios en un tubo de 15 ml; consulte la Tabla de materiales para obtener detalles sobre los anticuerpos).
6. Lavar las células con PBS (1x) una vez con centrifugación a 300 × g durante 5 min. Agregue anticuerpos secundarios (1:400) en tubos de NDUFB10, SDHA y COX IV e incube las células con estas soluciones durante 30 minutos.
7. Lave las células con PBS (1x) una vez centrifugando a 300 × g durante 5 min. Aspirar los sobrenadantes, dejando aproximadamente 100 μL en los tubos. Resuspender los gránulos celulares en 300 μL de PBS (1x). Transfiera las células a tubos de microcentrífuga de 1,5 ml mantenidos en la oscuridad sobre hielo.
8. Analice las células en el citómetro de flujo (con una configuración de láser azul 3 y 1 rojo). Detecte señales en el filtro 1 (FL1) utilizando un filtro de paso de banda 530/30. Consulte la figura suplementaria S2 para conocer los ajustes y parámetros del microscopio.

5. Adquisición y análisis de citometría de flujo

1. Utilice el tubo de control no teñido para establecer los gráficos de dispersión del área de dispersión directa (FSC-A) y del área de dispersión lateral (SSC-A) en función del tamaño y la complejidad de la población celular analizada. Consulte la figura suplementaria S2 para conocer los ajustes y parámetros del microscopio.
   NOTA: Configure controles no teñidos para tipos de celdas individuales.
2. Utilice los tubos de control sin manchas para seleccionar las puertas positivas, y utilice tubos de control de un solo color para compensar la superposición espectral de fluorescencia entre MTG (fluoróforo-1 [FL-1]) y TMRE (FL-2) en citometría de flujo multicolor. Utilice el control de isotipo para el control negativo para monitorear la tinción de fondo en muestras MRC y TFAM. Utilice el tubo FCCP como control de despolarización para la tinción de TMRE.
3. Elimine los desechos extraños para seleccionar celdas vivas y la puerta principal del diagrama de dispersión frontal y lateral (Figura 2A). Elimine los dobletes utilizando una altura de dispersión directa (FSC-H) frente a (vs.) gráfica de densidad FSC-A para excluir dobletes y también construir una gráfica de altura de dispersión lateral (SSC-H) frente a SSC-A (Figura 2A).
4. Adquisición de datos (citómetro de flujo)
   1. Usando las muestras no teñidas o isotipo como control negativo, cree una puerta por encima de la población principal de los eventos de una sola célula mientras ve SSC-A y los diversos filtros (FL1, FL2, FL3, FL4) (Figura 1B y Figura 2B).
5. Análisis de datos (software CFlow)
   1. Copie la posición de las puertas en las muestras de células teñidas y registre la cantidad de células teñidas positivamente para la tinción positiva.
   2. Para cada subpoblación celular, seleccione un gráfico de histograma y analice la intensidad de fluorescencia mediana (MFI) de los diferentes canales de filtro (FL1, FL2, FL3, FL4) (eje x).
      1. Calcule los niveles de TMRE restando la MFI de FL2 de las células tratadas con FCCP # 2 de la MFI de FL2 de muestras teñidas con TMRE # 3 en un histograma, como en Eq (1) a continuación.
         Niveles de TMRE = MFI de FL2 de muestras teñidas con TMRE #3 - MFI de FL2 de células tratadas con FCCP #2 (1)
      2. Calcule los valores específicos para MMP y ROS mitocondrial por MFI en TMRE o MitoSox Red, dividiendo el indicador de volumen mitocondrial MTG.
      3. Calcule el valor específico para la subunidad compleja y TFAM utilizando MFI en expresión compleja o TFAM, dividiendo el indicador de volumen mitocondrial TOMM20.

Resultados

En la Figura 3 se muestra una descripción esquemática del método de diferenciación y las estrategias de citometría de flujo. Las iPSC humanas se diferencian en rosetas neuronales y luego se elevan a la cultura de suspensión para su diferenciación en esferas neuronales. Las esferas neuronales se diferencian aún más y maduran en neuronas DA. Las esferas neuronales se disocian en células individuales para generar astrocitos gliales, se recolocan en monocapas como NSC y luego se difere...

Discusión

Aquí hay protocolos para generar neuronas y astrocitos derivados de iPSC y evaluar múltiples aspectos de la función mitocondrial utilizando citometría de flujo. Estos protocolos permiten la conversión eficiente de iPSCs humanas tanto en neuronas como en astrocitos gliales y la caracterización detallada de la función mitocondrial, principalmente en células vivas. Los protocolos también proporcionan una estrategia basada en citometría de flujo de tinción conjunta para adquirir y analizar múltiples funciones mit...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A	PeproTech	120-14E	Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium	Lonza	CC-3187	Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack	Lonza	CC-4123	Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF	PeproTech	450-02	DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer	BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12103C	Medium ingredient
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31765027	Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human	Sigma-Aldrich	SRP3055	Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human	Sigma-Aldrich	I3769	Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	12660012	Basal medium for NSC culture
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048	Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement	Thermo Fisher Scientific	A10508-01	Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific	12604013	Cell dissociation reagent
Transferrin	Roche	652202	CDM ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE	Abcam	ab113852	Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA