Analyse cytométrique en flux de paramètres mitochondriaux multiples dans des cellules souches pluripotentes induites par l’homme et leurs dérivés neuronaux et gliaux

Résumé

Cette étude rapporte une nouvelle approche pour mesurer plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux basés sur la cytométrie en flux et la double coloration avec deux rapporteurs fluorescents ou anticorps pour détecter les changements dans le volume mitochondrial, le potentiel de membrane mitochondriale, le niveau d’espèces réactives de l’oxygène, la composition de la chaîne respiratoire mitochondriale et l’ADN mitochondrial.

Résumé

Les mitochondries sont importantes dans la physiopathologie de nombreuses maladies neurodégénératives. Les changements dans le volume mitochondrial, le potentiel de membrane mitochondriale (MMP), la production mitochondriale d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et le nombre de copies d’ADN mitochondrial (ADNmt) sont souvent des caractéristiques de ces processus. Ce rapport détaille une nouvelle approche basée sur la cytométrie en flux pour mesurer plusieurs paramètres mitochondriaux dans différents types de cellules, y compris les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) et les cellules neurales et gliales dérivées des CSPi. Cette stratégie basée sur le flux utilise des cellules vivantes pour mesurer le volume mitochondrial, les niveaux de MMP et de ROS, ainsi que des cellules fixes pour estimer les composants de la chaîne respiratoire mitochondriale (MRC) et les protéines associées à l’ADNmt telles que le facteur de transcription mitochondrial A (TFAM).

En cocolorant avec des rapporteurs fluorescents, y compris MitoTracker Green (MTG), l’ester éthylique de tétraméthylrhodamine (TMRE) et MitoSox Red, les changements dans le volume mitochondrial, la MMP et les ROS mitochondriaux peuvent être quantifiés et liés au contenu mitochondrial. La double coloration avec des anticorps contre les sous-unités complexes MRC et la translocase de la membrane mitochondriale externe 20 (TOMM20) permet d’évaluer l’expression de la sous-unité MRC. Comme la quantité de TFAM est proportionnelle au nombre de copies d’ADNmt, la mesure de TFAM par TOMM20 donne une mesure indirecte de l’ADNmt par volume mitochondrial. L’ensemble du protocole peut être effectué en 2-3 heures. Il est important de noter que ces protocoles permettent la mesure des paramètres mitochondriaux, à la fois au niveau total et au niveau spécifique par volume mitochondrial, en utilisant la cytométrie en flux.

Introduction

Les mitochondries sont des organites essentiels présents dans presque toutes les cellules eucaryotes. Les mitochondries sont responsables de l’approvisionnement en énergie en produisant de l’adénosine triphosphate (ATP) par phosphorylation oxydative et agissent comme intermédiaires métaboliques pour la biosynthèse et le métabolisme. Les mitochondries sont profondément impliquées dans de nombreux autres processus cellulaires importants, tels que la génération de ROS, la mort cellulaire et la régulation intracellulaire du Ca²⁺. Le dysfonctionnement mitochondrial a été associé à diverses maladies neurodégénératives, notamment la maladie de Parkinson (MP), la maladie d’Alzheimer (MA), la maladie de Huntington (MH), l’ataxie de Friedreich (FRDA) et la sclérose latérale amyotrophique (SLA)¹. On pense également que l’augmentation du dysfonctionnement mitochondrial et l’anomalie de l’ADNmt contribuent au vieillissement humain ^2,3.

Divers types de dysfonctionnement mitochondrial se produisent dans les maladies neurodégénératives, et les changements dans le volume mitochondrial, la dépolarisation MMP, la production de ROS et les altérations du nombre de copies d’ADNmt sont courants 4,5,6,7. Par conséquent, la capacité de mesurer ces fonctions et d’autres fonctions mitochondriales est d’une grande importance lors de l’étude des mécanismes de la maladie et du test d’agents thérapeutiques potentiels. De plus, compte tenu du manque de modèles animaux qui reproduisent fidèlement les maladies neurodégénératives humaines, l’établissement de systèmes modèles in vitro appropriés qui récapitulent la maladie humaine dans les cellules cérébrales est une étape importante vers une meilleure compréhension de ces maladies et le développement de nouvelles thérapies 2,3,8,9.

Les CSPi humaines peuvent être utilisées pour générer diverses cellules cérébrales, y compris des cellules neuronales et non neuronales (c.-à-d. cellules gliales), et des dommages mitochondriaux associés à une maladie neurodégénérative ont été trouvés dans les deux types de cellules 3,10,11,12,13. Des méthodes appropriées pour la différenciation des CSPi en lignées neuronales et gliales sont disponibles^14,15,16. Ces cellules fournissent une plate-forme humaine / patient unique pour la modélisation in vitro des maladies et le dépistage de médicaments. De plus, comme ils sont dérivés de patients, les neurones dérivés de l’iPSC et les cellules gliales fournissent des modèles de maladie qui reflètent plus précisément ce qui se passe chez l’homme.

À ce jour, peu de méthodes pratiques et fiables pour mesurer plusieurs paramètres fonctionnels mitochondriaux dans les CSPi, en particulier les neurones vivants et les cellules gliales, sont disponibles. L’utilisation de la cytométrie en flux fournit au scientifique un outil puissant pour mesurer les paramètres biologiques, y compris la fonction mitochondriale, dans des cellules individuelles. Ce protocole fournit des détails sur la génération de différents types de cellules cérébrales, y compris les cellules souches neurales (CSN), les neurones et les astrocytes gliaux à partir de CSPi, ainsi que de nouvelles approches basées sur la cytométrie en flux pour mesurer plusieurs paramètres mitochondriaux dans différents types de cellules, y compris les CSPi et les cellules neurales et gliales dérivées des CSPi. Le protocole fournit également une stratégie de co-coloration pour l’utilisation de la cytométrie en flux pour mesurer le volume mitochondrial, le MMP, le niveau de ROS mitochondrial, les complexes MRC et TFAM. En incorporant des mesures de volume ou de masse mitochondriale, ces protocoles permettent également de mesurer à la fois le niveau total et le niveau spécifique par unité mitochondriale.

Protocole

REMARQUE : Voir le tableau des matériaux et le tableau supplémentaire S1 pour les recettes de tous les milieux et solutions utilisés dans ce protocole.

1. Différenciation des CSPi humaines en NCS, neurones dopaminergiques (DA) et astrocytes

1. Préparer des plaques revêtues de matrice.
   1. Décongeler un flacon de 5 mL de matrice sur de la glace pendant la nuit. Diluer 1 mL de matrice avec 99 mL de froid Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 (Advanced DMEM/F12) (concentration finale de 1 %). Fabriquer des aliquotes de 1 mL et les conserver à -20 °C.
   2. Décongeler la solution matricielle à 4 °C (la garder froide) et enduire 6 puits (1 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
   3. Placer la plaque revêtue de matrice dans un incubateur à air humidifié à 5 % de CO₂/95 % à 37 °C pendant 1 h. Sortez la plaque de l’incubateur et laissez-la s’équilibrer à température ambiante (RT).
      REMARQUE: Il est recommandé d’utiliser la plaque dans les 3 jours suivant le revêtement. Cependant, la plaque revêtue peut être conservée jusqu’à 2 semaines à 4 °C. N’oubliez pas de le retirer et de le laisser se réchauffer à RT avant utilisation. Pour un stockage prolongé, ajouter 1 mL de milieu de culture iPSC à la plaque revêtue pour éviter le dessèchement de la matrice.
2. Décongélation des CSPi
   1. Préchauffer les plaques revêtues de matrice à la RT ou dans l’incubateur à 37 °C pendant 20-30 min. Préchauffer la quantité requise de milieu de culture iPSC à RT.
   2. Mélanger 6 mL de milieu de culture iPSC préchauffé avec 12 μL d’inhibiteur de ROCK Y-27632 pour obtenir une concentration finale de 10 μM.
   3. Décongeler partiellement le flacon congelé de CSPi à 37 °C au bain-marie jusqu’à ce qu’il reste un petit morceau de glace.
   4. Ajouter lentement 1 mL de milieu de culture iPSC préchauffé avec 12 μL d’inhibiteur ROCK goutte à goutte aux cellules. Transférer goutte à goutte le contenu liquide du flacon contenant des CSPi dans un puits d’une plaque précouverte de 6 puits à l’aide d’une pipette de 5 mL.
   5. Déplacez la plaque dans des directions perpendiculaires pour mélanger le contenu du puits et retourner la plaque dans l’incubateur. Changez le milieu de culture iPSC après 24 heures après le lavage avec la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco (1x) (Ca 2+/Mg^2+-libre) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
      REMARQUE: N’ajoutez pas d’inhibiteur de ROCK aux tétées suivantes. Changez le milieu de culture iPSC tous les jours.
3. Sous-culture des CSPi
   1. Préchauffer les plaques revêtues de matrice à la RT ou dans l’incubateur à 37 °C pendant 20-30 min. Préchauffer la quantité requise de milieu de culture iPSC à RT.
   2. Aspirer le milieu de culture des plaques contenant les cellules. Rincer les CSPi avec du DPBS (1x) (Ca 2+/Mg^2+-free) (4 mL par puits dans une plaque à 6 puits).
   3. Ajouter de l’EDTA (0,5 mM) (1 mL par puits dans une plaque de 6 puits). Incuber les plaques à 37 °C jusqu’à ce que les bords des colonies commencent à se soulever du puits (généralement 3-5 min). Aspirer l’EDTA.
   4. Ajouter le milieu de culture iPSC préchauffé (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et détacher de force les colonies de CSPi à l’aide d’une pipette stérile de 10 mL une fois. Ne pipette pas de haut en bas, car cela pourrait briser les amas de cellules en cellules individuelles.
   5. Transférer le contenu de chaque puits dans deux puits individuels dans une plaque à 6 puits revêtue d’une matrice (2 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et incuber à 37 °C. Ne générez pas de bulles dans la suspension pendant le pipetage.
      REMARQUE: Secouez doucement la plaque avant de la conserver dans l’incubateur. Le rapport de division peut être de 1:2 (un puits dans 2 nouveaux puits) à 1:4 (un puits dans 4 nouveaux puits).
   6. Remplacez le milieu quotidiennement jusqu’à ce que les colonies atteignent 60% de confluence avec une bonne taille et des connexions.
4. Induction neuronale et génération de progéniteurs neuronaux
   1. Préparer 500 mL de milieu chimiquement défini (CDM), 500 mL de milieu d’induction neurale (NIM) et 500 mL de milieu sans sérum de cellules souches neurales (NSC SF).
   2. Rincer les cellules avec DPBS (1x) (Ca 2+/Mg^2+-free) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et ajouter NIM (3 mL par puits dans une plaque de 6 puits). Configuré en tant que Jour 0.
   3. Remplacez le NIM (3 mL par puits dans une plaque à 6 puits) le jour 1, le jour 3 et le jour 4 et observez quotidiennement sous la microscopie.
   4. Le jour 5, détachez les rosettes neurales dans une culture de suspension comme décrit ci-dessous.
      1. Laver une fois doucement avec DPBS (1x) (Ca 2+/Mg^2+-free) (4 mL par puits dans une assiette à 6 puits). Ajouter la collagénase IV (1 mL par puits dans une assiette de 6 puits) et conserver dans un incubateur pendant 1 min. Aspirer la collagénase IV et laver une fois avec DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) doucement.
      2. Ajouter 2 mL de NSC SF Medium par puits à une plaque de 6 puits. Détacher les cellules en grattant le fond des puits en dessinant des grilles à l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL.
      3. Recueillir la suspension cellulaire de la plaque à 6 puits dans une capsule non adhérente de 10 cm. Porter le volume à 12 ml avec NSC SF Medium.
      4. Secouez la capsule non adhérente à 65-85 tr / min sur un agitateur orbital dans un incubateur pour éviter l’agrégation.
5. Différenciation des neurones DA
   1. Le jour 7, ajouter 12 mL de MDP additionnés de facteur de croissance des fibroblastes-8b (FGF-8b) de 100 ng/mL et placer la capsule sur l’agitateur orbital dans l’incubateur.
   2. Les jours 8-13, changez le milieu tous les 2 jours et observez sous la microscopie quotidiennement.
   3. Au jour 14, ajouter 12 mL de MDP additionnés de 100 ng/mL de FGF-8b et de 1 μM de purmorphamine (PM). Placez le plat sur le shaker orbital dans l’incubateur.
   4. Les jours 15 à 20, changez le milieu tous les 2 jours et observez quotidiennement les cellules sous la microscopie.
   5. Passez mécaniquement les sphères en utilisant des pointes de 1000 μL pour briser les sphères plus grandes.
      NOTE: Le rapport peut être de 1: 2 (un plat dans 2 nouveaux plats).
6. Fin de la différenciation
   1. Enduisez une plaque à 6 puits ou des lamelles de couverture avec de la poly-L-ornithine (PLO) et de la laminine comme décrit ci-dessous.
      1. Enduire une plaque de 6 puits de 1 mL de PLO par puits et incuber la plaque à 37 °C pendant 20 min. Aspirez la solution de l’OLP.
      2. Stériliser la plaque sous UV pendant 20 min. Rincer les puits deux fois avec DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
      3. Ajouter 5 μg/mL de solution de laminine (1 mL par puits dans une plaque de 6 puits) au puits et incuber à 37 °C pendant 2 h. Aspirer la laminine et laver brièvement les puits avec DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) une fois avant le placage.
   2. Recueillir toutes les sphères (à partir de l’étape 1.5.5) dans des tubes de 50 ml et compléter avec DPBS (1x). Faire tourner à 300 × g pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
   3. Incuber avec 2 mL de réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matériaux) pendant 10 min à 37 °C au bain-marie suivi d’une trituration douce avec une pipette de 200 μL (20-50 fois selon la taille des sphères, en évitant la formation de bulles).
   4. Neutraliser le réactif de dissociation cellulaire avec 2 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco avec 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et centrifuger le tube conique de 50 mL contenant les cellules à 300 × g pendant 5 min à TA. Aspirer le surnageant.
   5. Ajouter 1 mL de MDP complété par 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) et 10 ng/mL de facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF) pour remettre les granulés cellulaires en pipetant doucement de haut en bas pour obtenir des suspensions unicellulaires.
   6. Aspirer la solution de laminine de la plaque (étape 1.6.1.3), laver brièvement avec du DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque à 6 puits) et ensemencer les cellules (à partir de l’étape 1.6.5) dans les plaques préenduites ou les lamelles de recouvrement dans 3 mL de MDP complétées par 10 ng/mL de BDNF et 10 ng/mL de GDNF. Nourrissez les cellules tous les 4 jours.
      REMARQUE: Les cultures différenciantes peuvent être maintenues pendant plusieurs semaines jusqu’à 3 mois. La morphologie neuronale apparaît généralement après 2 semaines d’arrêt et peut être utilisée pour des analyses en aval à partir de ce point. Le BDNF et le GDNF ne sont pas nécessaires pour la culture pour un entretien plus long (jusqu’à 2 mois).
7. Génération NSC
   1. Plaques matricielles d’enduit.
   2. Recueillir toutes les sphères neurales (générées à partir de l’étape 1.4) dans des tubes de 50 mL et compléter avec DPBS (1x) (Ca 2+/Mg^2+-free). Faire tourner à 300 × g pendant 5 min. Aspirer les surnageants.
   3. Incuber les pastilles avec 2 mL de réactif de dissociation cellulaire pendant 10 min à 37 °C au bain-marie, puis procéder à une trituration douce avec une pipette de 200 μL (20 à 50 fois selon la taille des sphères, en évitant la formation de bulles).
   4. Neutraliser avec 2 mL de DMEM avec 10% FBS et centrifuger les tubes coniques de 50 mL contenant les cellules à 300 × g pendant 5 min à TA. Aspirer les surnageants. Remettez en suspension les granulés de cellule en pipetant doucement de haut en bas pour obtenir des suspensions unicellulaires.
   5. Aspirer la solution matricielle d’une plaque prérevêtue et ensemencer les cellules dans les plaques prérevêtues dans NSC SF Medium (3 mL par puits dans une plaque à 6 puits). Nourrissez les cellules tous les 2-3 jours et divisez les cellules lorsqu’elles sont confluentes.
      REMARQUE : À partir de ce stade, les CSN peuvent être étendus et gelés.
8. Différenciation des astrocytes gliaux
   1. Différenciation des astrocytes par rapport aux CSN
      1. Préparer 500 ml de milieu de différenciation des astrocytes.
      2. Semer des NSC sur des plaques/lamelles revêtues de poly-D-lysine (PDL) avec NSC SF Medium.
      3. Le lendemain, rincer les cellules avec du DPBS (1x) (Ca 2+/Mg^2+-libre) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et ajouter un milieu de différenciation astrocytaire (3 mL par puits dans une plaque de 6 puits). Configuré en tant que Jour 0.
      4. Observez quotidiennement les CSN au microscope et remplacez le milieu de différenciation des astrocytes (3 mL par puits dans une plaque à 6 puits) tous les 2 jours du Jour 1 au Jour 27.
   2. Maturation des astrocytes
      1. Préparer le milieu de maturation des astrocytes.
      2. Le jour 28, rincer les cellules avec du DPBS (1x) (4 mL par puits dans une plaque de 6 puits) et ajouter le milieu de maturation des astrocytes (3 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
      3. À partir du jour 29, observez quotidiennement les cellules au microscope et remplacez le milieu de maturation des astrocytes (3 mL par puits dans une plaque à 6 puits) tous les 2 jours.
      4. Après un mois de maturation, dilatez les cellules et cryopréservez-les à partir de ce stade.
         REMARQUE: Au cours de cette phase, le nombre de cellules augmentera. Lors de la division des cellules, les lamelles de couverture enduites de PDL ne sont pas nécessaires pour la culture.

2. Caractérisation cellulaire par immunocytochimie et coloration par immunofluorescence

1. À la fin de la période de culture, transférer les lames de couverture avec les cellules dans une plaque de 12 puits.
   Rincer les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) (1x) deux fois et incuber pendant 10 minutes dans du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % (0,5 mL par puits dans une plaque de 12 puits) à TA.
   REMARQUE : L’échantillon fixe peut être recouvert de 2 mL de PBS (1x) et conservé à 4 °C jusqu’à ce qu’il soit nécessaire pour l’immunomarquage. Le PFA est toxique et est soupçonné de causer le cancer. Prévenez l’exposition de la peau et des yeux et travaillez sous une hotte chimique.
2. Bloquer et perméabiliser les cellules et incuber avec un tampon de blocage contenant du PBS (1x), 0,3% de Triton X-100 et 10% de sérum de chèvre normal pendant 1 h à TA.
3. Incuber avec des anticorps primaires dans le tampon de blocage pendant la nuit à 4 °C: coloration des CSPi avec facteur de transcription anti-octamère 4 (Oct4) et antigène embryonnaire spécifique au stade (SSEA4), CSN avec zone Y anti-sexe (Sox2) et anti-Nestine, sphères neurales avec boîte anti-appariement 6 (Pax6) et anti-Nestine, astrocytes avec protéine acide fibrillaire anti-gliale (GFAP) et protéine de liaison au calcium anti-S100 β (S100β), et neurones DA avec anti-tyrosine hydroxylase (TH), anti-β III Tubuline (Tuj 1), anti-synaptophysine et anti-PSD-95 (0,5 mL de solution d’anticorps primaires par puits dans une plaque de 12 puits; voir le tableau des matériaux pour plus de détails).
4. Lavez les échantillons avec du PBS (1x) trois fois pendant 10 minutes chacun en balançant doucement.
5. Incuber avec une solution d’anticorps secondaires (1:800 dans un tampon de blocage, 0,5 mL de solution d’anticorps secondaires Alexa Fluor par puits dans une plaque de 12 puits) pendant 1 h à TA avec basculement doux.
6. Incuber les cellules avec Hoechst 33342 (1:5 000, 0,5 mL par puits dans une plaque de 12 puits) dans du PBS (1x) pendant 15 minutes à TA pour marquer les noyaux.
7. Montez les cellules avec un support de montage et séchez-les pendant la nuit à RT pour l’imagerie sous un microscope à fluorescence dans l’obscurité. Voir la figure supplémentaire S1 pour les réglages et les paramètres du microscope.

3. Mesure par cytométrie de flux du volume mitochondrial, de la MMP et des ROS mitochondriaux dans les cellules vivantes

1. Ensemencer les cellules séparément dans 4 puits dans une plaque de 6 puits jusqu’à ce que les cellules atteignent 50% -60% de confluence. Étiquetez ces quatre puits comme #1, #2, #3 et #4.
2. À la fin de la période de culture, préparer 5 solutions de coloration individuelles (500 μL par puits dans une plaque de 6 puits) comme suit : #1 seul milieu de culture (au puits #1 contenant uniquement des cellules pour le contrôle); #2-1 contenant FCCP (100 μM); #2-2 contenant FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) en milieu de culture; #3 contenant TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) dans un milieu de culture; #4 contenant MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) dans PBS (1x) avec 10% FBS. Voir la figure 1A, le tableau supplémentaire S2 et le tableau des matériaux pour plus de détails sur ces composés et la configuration de la cytométrie en flux.
   REMARQUE: Utilisez le milieu de culture pour préparer la solution de coloration. Réchauffer le milieu et PBS (1x) à TA avant utilisation. Le FCCP est toxique; Prévenir l’exposition de la peau et des yeux et travailler sous une hotte chimique.
3. Aspirer le milieu du puits #2 et ajouter la solution #2-1 (FCCP seulement). Incuber les cellules à 37 °C pendant 10 min.
4. Aspirer le milieu des puits #2 et #3 et ajouter la solution #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) dans le puits #2 et la solution #3 (TMRE + MTG) dans #3. Incuber les cellules à 37 °C pendant 45 min.
5. Aspirez le milieu du puits #4 et ajoutez la solution #4 (MitoSox Red + MTG). Incuber les cellules à 37 °C pendant 15 min.
6. Aspirer le milieu de tous les puits. Laver avec du PBS (1x) (4 mL par puits dans une assiette à 6 puits). Détacher les cellules à l’aide de 1 mL de réactif de dissociation cellulaire (1 mL par puits dans une plaque de 6 puits) à 37 °C pendant 5 min. Neutraliser le réactif de dissociation cellulaire dans 1 mL de DMEM avec 10% FBS (2 mL par puits dans une plaque de 6 puits).
7. Recueillir le contenu de tous les puits dans des tubes coniques de 15 mL. Centrifuger les tubes à 300 × g pendant 5 min. Lavez les granulés avec du PBS (1x) une ou deux fois.
8. Aspirer les surnageants, mais laisser environ 100 μL dans les tubes. Remettez en suspension les pastilles de la cellule dans 300 μL de PBS (1x). Transférer les cellules dans des tubes microcentrifugés de 1,5 mL. Gardez les tubes dans l’obscurité à RT.
9. Analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux (avec une configuration laser 3 bleu et 1 rouge). Détectez MTG dans le filtre 1 (FL1) à l’aide d’un filtre passe-bande 530/30, TMRE dans le filtre 2 (FL2) à l’aide du filtre passe-bande 585/40 et MitoSox Red dans le filtre 3 (FL3) à l’aide d’un filtre passe-bande 510/580.

4. Mesure par cytométrie de flux des sous-unités complexes MRC et TFAM dans les cellules fixes

1. À la fin de la période de culture, détacher les cellules (~10⁶) en ajoutant le réactif de dissociation cellulaire ; Ensuite, pelletez et recueillez les cellules dans un tube de 15 mL. Laver les cellules par centrifugation avec du PBS (1x) deux fois par centrifugation à 300 × g pendant 5 min.
2. Fixer les cellules dans 1,6 % de PFA (1 mL de 1,6 % de PFA dans un tube de 15 mL) à TA pendant 10 min. Laver les cellules par centrifugation avec du PBS (1x) deux fois par centrifugation à 300 × g pendant 5 min.
3. Perméabiliser les cellules avec du méthanol glacé à 90 % (1 mL de méthanol à 90 % dans un tube de 15 mL) à -20 °C pendant 20 min.
4. Bloquer les échantillons dans un tampon de blocage contenant 0,3 M de glycine, 5 % de sérum de chèvre et 1 % d’albumine sérique bovine (BSA) - fraction V dans du PBS (1x) (1 mL de tampon de blocage dans un tube de 15 mL). Laver les cellules par centrifugation avec du PBS (1x) deux fois (comme à l’étape 3.7).
5. Incuber les cellules avec les anticorps primaires suivants pendant 30 minutes : anti-NDUFB10 (1:1 000) pour la mesure de la sous-unité complexe I, sous-unité A du complexe flavoprotéine flavoprotéine du complexe anti-succinate déshydrogénase (SDHA, 1:1 000) pour la mesure de la sous-unité complexe II et anti-COX IV (1:1 000) pour la mesure de la sous-unité IV complexe, et anticorps anti-TFAM conjugué avec Alexa Fluor 488 (1:400). Colorer le même nombre de cellules séparément avec l’anticorps anti-TOMM20 conjugué avec Alexa Fluor 488 (1:400) pendant 30 minutes (1 mL de solution d’anticorps primaires dans un tube de 15 mL; voir le Tableau des matériaux pour plus de détails sur les anticorps).
6. Laver les cellules avec du PBS (1x) une fois avec centrifugation à 300 × g pendant 5 min. Ajouter un anticorps secondaire (1:400) dans des tubes de NDUFB10, SDHA et COX IV et incuber les cellules avec ces solutions pendant 30 minutes.
7. Laver les cellules avec du PBS (1x) une fois en centrifugeant à 300 × g pendant 5 min. Aspirer les surnageants, en laissant environ 100 μL dans les tubes. Remettez en suspension les pastilles de la cellule dans 300 μL de PBS (1x). Transférer les cellules dans des tubes microcentrifugeux de 1,5 mL conservés dans l’obscurité sur de la glace.
8. Analysez les cellules sur le cytomètre en flux (avec une configuration laser 3 bleu et 1 rouge). Détectez les signaux dans le filtre 1 (FL1) à l’aide d’un filtre passe-bande 530/30. Voir la figure supplémentaire S2 pour les réglages et les paramètres du microscope.

5. Acquisition et analyse de la cytométrie en flux

1. Utilisez le tube témoin non coloré pour définir les diagrammes de dispersion de la zone de diffusion vers l’avant (FSC-A) et de la zone de diffusion latérale (SSC-A) en fonction de la taille et de la complexité de la population cellulaire analysée. Voir la figure supplémentaire S2 pour les réglages et les paramètres du microscope.
   Remarque : Configurez des contrôles non colorés pour des types de cellules individuels.
2. Utilisez les tubes de contrôle sans tache pour sélectionner les portes positives et utilisez des tubes de contrôle unicolores pour compenser le chevauchement spectral de fluorescence entre MTG (fluorophore-1 [FL-1]) et TMRE (FL-2) en cytométrie en flux multicolore. Utiliser le contrôle d’isotype pour le contrôle négatif afin de surveiller la coloration de fond dans les échantillons MRC et TFAM. Utilisez le tube FCCP comme contrôle de dépolarisation pour la coloration TMRE.
3. Retirez les débris étrangers pour sélectionner les cellules vivantes et le point de contrôle principal à partir du tracé de dispersion avant et latéral (figure 2A). Sortez les doublets à l’aide d’un diagramme de densité de hauteur de diffusion vers l’avant (FSC-H) par rapport à (vs.) FSC-A pour exclure les doublets et également construire un diagramme de hauteur de diffusion latérale (SSC-H) par rapport à SSC-A (Figure 2A).
4. Acquisition de données (cytomètre en flux)
   1. En utilisant les échantillons non colorés ou d’isotype comme témoin négatif, créer une porte au-dessus de la population principale des événements unicellulaires tout en observant SSC-A et les divers filtres (FL1, FL2, FL3, FL4) (Figure 1B et Figure 2B).
5. Analyse des données (logiciel CFlow)
   1. Copiez la position des portes sur les échantillons de cellules colorées et notez la quantité de cellules colorées positivement pour la coloration positive.
   2. Pour chaque sous-population cellulaire, sélectionnez un histogramme et analysez l’intensité médiane de fluorescence (ICM) des différents canaux filtrants (FL1, FL2, FL3, FL4) (axe des x).
      1. Calculer les niveaux d’EMTC en soustrayant l’IMF du FL2 des cellules traitées par FCCP #2 de l’IMF du FL2 des échantillons colorés au TMRE #3 dans un histogramme, comme dans Eq (1) ci-dessous.
         TMRE levels = MFI of FL2 from #3 TMRE-scolored samples - MFI of FL2 of #2 FCCP-treated cells (1)
      2. Calculer les valeurs spécifiques pour MMP et ROS mitochondrial par MFI en TMRE ou MitoSox Red, en divisant l’indicateur de volume mitochondrial MTG.
      3. Calculez la valeur spécifique pour la sous-unité complexe et TFAM en utilisant MFI en expression complexe ou TFAM, en divisant l’indicateur de volume mitochondrial TOMM20.

Résultats

Une description schématique de la méthode de différenciation et des stratégies de cytométrie en flux est présentée à la figure 3. Les CSPi humaines sont différenciées en rosettes neurales, puis soulevées dans une culture de suspension pour la différenciation en sphères neuronales. Les sphères neuronales sont davantage différenciées et mûries en neurones DA. Les sphères neurales sont dissociées en cellules uniques pour générer des astrocytes gliaux, replaquées en monocou...

Discussion

Voici des protocoles pour générer des neurones et des astrocytes dérivés de l’iPSC et évaluer de multiples aspects de la fonction mitochondriale à l’aide de la cytométrie en flux. Ces protocoles permettent une conversion efficace des CSPi humaines en neurones et astrocytes gliaux et la caractérisation détaillée de la fonction mitochondriale, principalement dans les cellules vivantes. Les protocoles fournissent également une stratégie basée sur la cytométrie de flux de co-coloration pour l’acquisition ...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A	PeproTech	120-14E	Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium	Lonza	CC-3187	Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack	Lonza	CC-4123	Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF	PeproTech	450-02	DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer	BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12103C	Medium ingredient
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31765027	Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human	Sigma-Aldrich	SRP3055	Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human	Sigma-Aldrich	I3769	Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	12660012	Basal medium for NSC culture
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048	Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement	Thermo Fisher Scientific	A10508-01	Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific	12604013	Cell dissociation reagent
Transferrin	Roche	652202	CDM ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE	Abcam	ab113852	Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA