JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании сообщается о новом подходе к измерению нескольких митохондриальных функциональных параметров на основе проточной цитометрии и двойного окрашивания двумя флуоресцентными репортерами или антителами для обнаружения изменений в объеме митохондрий, митохондриальном мембранном потенциале, уровне активных форм кислорода, составе митохондриальной дыхательной цепи и митохондриальной ДНК.

Аннотация

Митохондрии играют важную роль в патофизиологии многих нейродегенеративных заболеваний. Изменения в объеме митохондрий, митохондриальном мембранном потенциале (MMP), митохондриальной продукции активных форм кислорода (АФК) и количестве копий митохондриальной ДНК (мтДНК) часто являются особенностями этих процессов. В этом отчете подробно описывается новый подход на основе проточной цитометрии для измерения нескольких митохондриальных параметров в различных типах клеток, включая индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки (IPSCs) и нейронные и глиальные клетки, полученные из iPSC. Эта стратегия, основанная на потоке, использует живые клетки для измерения объема митохондрий, уровней MMP и АФК, а также фиксированные клетки для оценки компонентов митохондриальной дыхательной цепи (MRC) и связанных с мтДНК белков, таких как митохондриальный фактор транскрипции A (TFAM).

Путем совместного окрашивания с флуоресцентными репортерами, включая MitoTracker Green (MTG), тетраметилродаминэтиловый эфир (TMRE) и MitoSox Red, изменения в объеме митохондрий, MMP и митохондриальном АФК могут быть количественно определены и связаны с содержанием митохондрий. Двойное окрашивание антителами против субъединиц комплекса MRC и транслоказы наружной митохондриальной мембраны 20 (TOMM20) позволяет оценить экспрессию субъединицы MRC. Поскольку количество TFAM пропорционально числу копий мтДНК, измерение TFAM на TOMM20 дает косвенное измерение мтДНК на митохондриальный объем. Весь протокол может быть выполнен в течение 2-3 ч. Важно отметить, что эти протоколы позволяют измерять митохондриальные параметры, как на общем уровне, так и на конкретном уровне на митохондриальный объем, используя проточную цитометрию.

Введение

Митохондрии являются важными органеллами, присутствующими почти во всех эукариотических клетках. Митохондрии отвечают за энергоснабжение, производя аденозинтрифосфат (АТФ) путем окислительного фосфорилирования и действуют как метаболические посредники для биосинтеза и метаболизма. Митохондрии глубоко вовлечены во многие другие важные клеточные процессы, такие как генерация АФК, гибель клеток и внутриклеточная регуляция Ca2+. Митохондриальная дисфункция была связана с различными нейродегенеративными заболеваниями, включая болезнь Паркинсона (БП), болезнь Альцгеймера (БА), болезнь Хантингтона (БГ), атаксию Фридрейха (FRDA) и боковой амиотрофический склероз (БАС)1. Считается, что повышенная митохондриальная дисфункция и аномалия мтДНК также способствуют старению человека 2,3.

Различные типы митохондриальной дисфункции встречаются при нейродегенеративных заболеваниях, а изменения в объеме митохондрий, деполяризация MMP, производство АФК и изменения в количестве копий мтДНК распространены 4,5,6,7. Поэтому способность измерять эти и другие митохондриальные функции имеет большое значение при изучении механизмов заболевания и тестировании потенциальных терапевтических агентов. Более того, ввиду отсутствия животных моделей, которые точно воспроизводят нейродегенеративные заболевания человека, создание подходящих модельных систем in vitro, которые рекапитулируют заболевание человека в клетках мозга, является важным шагом на пути к лучшему пониманию этих заболеваний и разработке новых методов лечения 2,3,8,9.

Человеческие ИПСК могут быть использованы для генерации различных клеток мозга, включая нейронные и ненейрональные клетки (то есть глиальные клетки), а митохондриальное повреждение, связанное с нейродегенеративными заболеваниями, было обнаружено в обоих типах клеток 3,10,11,12,13. Соответствующие методы дифференциации iPSC в нейронные и глиальные линии доступны 14,15,16. Эти клетки обеспечивают уникальную платформу для моделирования заболеваний in vitro и скрининга лекарств. Кроме того, поскольку они получены от пациентов, нейроны и глиальные клетки, полученные из iPSC, обеспечивают модели заболеваний, которые более точно отражают то, что происходит у людей.

На сегодняшний день существует мало удобных и надежных методов измерения множественных митохондриальных функциональных параметров в ИПСК, особенно в живых нейронах и глиальных клетках. Использование проточной цитометрии предоставляет ученому мощный инструмент для измерения биологических параметров, включая митохондриальную функцию, в отдельных клетках. Этот протокол предоставляет подробную информацию о генерации различных типов клеток мозга, включая нервные стволовые клетки (NSC), нейроны и глиальные астроциты из iPSCs, а также новые подходы на основе проточной цитометрии для измерения нескольких митохондриальных параметров в разных типах клеток, включая iPSCs и нейронные и глиальные клетки, полученные из iPSC. Протокол также обеспечивает стратегию совместного окрашивания для использования проточной цитометрии для измерения объема митохондрий, MMP, уровня митохондриальной АФК, комплексов MRC и TFAM. Включая измерения объема или массы митохондрий, эти протоколы также позволяют измерять как общий уровень, так и конкретный уровень на митохондриальную единицу.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов и Дополнительную таблицу S1 для рецептур всех сред и решений, используемых в этом протоколе.

1. Дифференциация ИПСК человека в NCS, дофаминергические (DA) нейроны и астроциты

  1. Подготовьте пластины с матричным покрытием.
    1. Разморозьте флакон 5 мл матрицы на льду за ночь. Разбавьте 1 мл матрицы 99 мл холодной модифицированной среды Eagle Medium advanced Dulbecco/F-12 Ham (Advanced DMEM/F12) (конечная концентрация 1%). Сделайте 1 мл аликвоты и храните их при -20 °C.
    2. Разморозьте матричный раствор при 4 °C (держите его холодным) и покройте 6 лунок (1 мл на скважину в 6-луночной плите).
    3. Поместите пластину с матричным покрытием в увлажненный 5% CO2/95% воздушный инкубатор при 37 °C в течение 1 ч. Выньте тарелку из инкубатора и дайте ей уравновеситься до комнатной температуры (RT).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется использовать пластину в течение 3 дней после нанесения покрытия. Однако пластина с покрытием может храниться до 2 недель при температуре 4 °C. Просто не забудьте вынуть его и дать ему нагреться до RT перед использованием. Для длительного хранения добавьте 1 мл питательной среды iPSC к покрытой пластине, чтобы избежать высыхания матрицы.
  2. Размораживающие иПСК
    1. Предварительно прогрейте пластины с матричным покрытием при RT или в инкубаторе при 37 °C в течение 20-30 мин. Предварительно прогреть необходимое количество питательной среды iPSC на РТ.
    2. Смешайте 6 мл предварительной питательной среды iPSC с 12 мкл ингибитора Y-27632 ROCK для получения конечной концентрации 10 мкМ.
    3. Частично разморозьте замороженный флакон иПСК при 37 °C на водяной бане, пока не останется небольшой кусочек льда.
    4. Медленно добавляют 1 мл предварительной питательной среды iPSC с 12 мкл ингибитора ROCK по каплям к клеткам. Перенесите жидкое содержание флакона с iPSCs по каплям в одну лунку 6-луночной предварительно покрытой пластины с помощью пипетки 5 мл.
    5. Переместите пластину в перпендикулярных направлениях, чтобы перемешать содержимое скважины и вернуть пластину в инкубатор. Замените питательную среду iPSC через 24 ч после промывки фосфатно-буферным физиологическим раствором Dulbecco (DPBS) (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на скважину в 6-луночной пластине).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не добавляйте ингибитор ROCK к последующим кормлениям. Ежедневно меняйте среду культуры iPSC.
  3. Субкультурирование ИПСК
    1. Предварительно прогрейте пластины с матричным покрытием при RT или в инкубаторе при 37 °C в течение 20-30 мин. Предварительно прогреть необходимое количество питательной среды iPSC на РТ.
    2. Аспирируйте питательную среду из пластин, содержащих клетки. Промыть иПСК DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на скважину в 6-луночной пластине).
    3. Добавьте ЭДТА (0,5 мМ) (1 мл на скважину в 6-луночной плите). Насиживайте пластины при 37 °C до тех пор, пока края колоний не начнут подниматься из лунки (обычно 3-5 мин). Аспирация ЭДТА.
    4. Добавьте предварительно расплавленную питательную среду iPSC (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и принудительно отсоедините колонии iPSC с помощью стерильной пипетки объемом 10 мл один раз. Не пипетка вверх и вниз, так как это может разбить комки клеток на отдельные клетки.
    5. Перенесите содержимое каждой скважины в две отдельные скважины в 6-луночной плите с матричным покрытием (2 мл на скважину в 6-луночной плите) и инкубируйте при 37 °C. Не создавайте пузырьков в суспензии во время пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аккуратно встряхните тарелку, прежде чем держать ее в инкубаторе. Коэффициент разделения может составлять от 1:2 (одна скважина на 2 новые скважины) до 1:4 (одна скважина на 4 новые скважины).
    6. Заменяйте среднюю суточную до тех пор, пока колонии не достигнут 60% слияния с хорошими размерами и соединениями.
  4. Нейронная индукция и генерация нейронных предшественников
    1. Приготовьте 500 мл химически определенной среды (CDM), 500 мл нейронной индукционной среды (NIM) и 500 мл среды без сыворотки нервных стволовых клеток (NSC SF).
    2. Промыть ячейки DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на скважину в 6-луночной пластине) и добавить NIM (3 мл на скважину в 6-луночную пластину). Настройте как День 0.
    3. Замените NIM (3 мл на скважину в 6-луночной пластине) на день 1, день 3 и день 4 и наблюдайте под микроскопией ежедневно.
    4. На 5-й день отделите нейронные розетки в культуру суспензии, как описано ниже.
      1. Один раз аккуратно вымойте DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине). Добавить коллагеназу IV (1 мл на лунку в 6-луночную пластину) и выдержать в инкубаторе 1 мин. Аспирировать коллагеназу IV и вымыть один раз DPBS (1x) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) осторожно.
      2. Добавьте 2 мл NSC SF Medium на скважину в 6-луночную плиту. Отделите ячейки, соскребая дно скважин, рисуя сетки с помощью наконечника пипетки объемом 200 мкл.
      3. Соберите клеточную суспензию с 6-луночной пластины в 10-сантиметровую неприлипшную посуду. Увеличьте объем до 12 мл с помощью NSC SF Medium.
      4. Встряхните неадгезивную посуду со скоростью 65-85 об/мин на орбитальном шейкере в инкубаторе, чтобы предотвратить агрегацию.
  5. Дифференциация нейронов DA
    1. На 7-й день добавьте 12 мл CDM, дополненное 100 нг/мл фактора роста фибробластов-8b (FGF-8b), и поместите чашку на орбитальный шейкер в инкубаторе.
    2. На 8-13 день меняйте среду каждые 2 дня и ежедневно наблюдайте под микроскопией.
    3. На 14-й день добавьте 12 мл CDM, дополненного 100 нг/мл FGF-8b и 1 мкМ пурморфамина (PM). Поместите тарелку на орбитальный шейкер в инкубаторе.
    4. На 15-20 день меняйте среду каждые 2 дня и ежедневно наблюдайте за клетками под микроскопией.
    5. Механически проходите сферы, используя наконечники 1000 мкл, чтобы разбить большие сферы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соотношение может быть 1:2 (одно блюдо на 2 новых блюда).
  6. Прекращение дифференциации
    1. Покройте 6-луночную пластину или крышки поли-L-орнитином (PLO) и ламинином, как описано ниже.
      1. Покрыть 6-луночную пластину 1 мл ПЛО на лунку и инкубировать пластину при 37 °C в течение 20 мин. Аспирировать решение ООП.
      2. Стерилизуйте пластину под ультрафиолетом в течение 20 мин. Промывайте скважины дважды DPBS (1x) (4 мл на скважину в 6-луночной плите).
      3. Добавьте в скважину 5 мкг/мл раствора ламинина (1 мл на скважину в 6-луночной пластине) и инкубируйте при 37 °C в течение 2 ч. Аспирировать ламинин и ненадолго промыть скважины DPBS (1x) (4 мл на скважину в 6-луночной плите) один раз перед нанесением покрытия.
    2. Соберите все сферы (начиная с шага 1.5.5) в трубки по 50 мл и дополните DPBS (1x). Отжимать при 300 × г в течение 5 мин. Аспирировать супернатанта.
    3. Инкубировать с 2 мл реагента диссоциации клеток (см. Таблицу материалов) в течение 10 мин при 37 °С на водяной бане с последующим мягким тритурированием пипеткой 200 мкл (в 20-50 раз в зависимости от размера сфер, избегая образования пузырьков).
    4. Нейтрализуют реагент диссоциации клеток 2 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Дульбекко с 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и центрифугируют коническую трубку объемом 50 мл, содержащую клетки при 300 × г в течение 5 мин при RT. Аспирировать супернатант.
    5. Добавьте 1 мл CDM, дополненного 10 нг/мл нейротрофического фактора головного мозга (BDNF) и 10 нг/мл нейротрофического фактора, полученного из глиальных клеточных линий (GDNF), чтобы повторно суспендировать клеточные гранулы путем осторожного пипетирования вверх и вниз для получения одноклеточных суспензий.
    6. Аспирировать раствор ламинина с пластины (стадия 1.6.1.3), ненадолго промыть DPBS (1x) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и засеять клетки (со стадии 1.6.5) в предварительно покрытые пластины или крышки в 3 мл CDM, дополненных 10 нг/мл BDNF и 10 нг/мл GDNF. Кормите клетки каждые 4 дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Дифференциация культур может сохраняться в течение многих недель до 3 месяцев. Нейронная морфология обычно появляется через 2 недели после прекращения и может быть использована для последующего анализа с этого момента. BDNF и GDNF не нужны для культивирования для более длительного обслуживания (до 2 месяцев).
  7. Генерация НСК
    1. Покрытие матричных пластин.
    2. Соберите все нейронные сферы (сгенерированные из шага 1.4) в трубки по 50 мл и пополните DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free). Открутить при 300 × г в течение 5 мин. Аспирировать супернатанты.
    3. Инкубируют гранулы с 2 мл клеточного диссоциационного реагента в течение 10 мин при 37 °С на водяной бане с последующим мягким тритурированием пипеткой 200 мкл (в 20-50 раз в зависимости от размера сфер, избегая образования пузырьков).
    4. Нейтрализуют 2 мл ДМЭМ с 10% ФБС и центрифугируют конические трубки объемом 50 мл, содержащие клетки при 300 × г в течение 5 мин при РТ. Аспирация супернатантов. Повторное суспендирование клеточных гранул путем осторожного пипетирования вверх и вниз для получения одноэлементных суспензий.
    5. Аспирировать матричный раствор из предварительно покрытой пластины и засеять клетки в предварительно покрытые пластины в NSC SF Medium (3 мл на скважину в 6-луночной пластине). Подкармливайте клетки каждые 2-3 дня и расщепляйте клетки при слиянии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начиная с этого этапа, НСК могут быть расширены и заморожены.
  8. Дифференциация астроцитов глии
    1. Дифференцировка астроцитов от НСК
      1. Приготовьте 500 мл среды дифференцировки астроцитов.
      2. Семена НСК на пластинах/крышках с покрытием из поли-D-лизина (PDL) со средой NSC SF.
      3. На следующий день промыть клетки DPBS (1x) (Ca2+/Mg2+-free) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и добавить среду дифференцировки астроцитов (3 мл на скважину в 6-луночной пластине). Настройте как День 0.
      4. Ежедневно наблюдают за НСК под микроскопом и заменяют среду дифференцировки астроцитов (3 мл на лунку в 6-луночной пластине) каждые 2 дня с 1 по 27 дни.
    2. Созревание астроцитов
      1. Готовят среду созревания астроцитов.
      2. На 28-й день промыть клетки DPBS (1x) (4 мл на лунку в 6-луночной пластине) и добавить среду созревания астроцитов (3 мл на скважину в 6-луночной пластине).
      3. На 29 день и далее ежедневно наблюдайте за клетками под микроскопом и заменяйте среду созревания астроцитов (3 мл на лунку в 6-луночной пластине) каждые 2 дня.
      4. После одного месяца созревания расширьте клетки и криоконсервируйте их с этой стадии.
        ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе количество клеток увеличится. При расщеплении клеток для культивирования не нужны покрытые PDL чехлы.

2. Характеристика клеток иммуноцитохимией и иммунофлуоресцентным окрашиванием

  1. В конце периода культивирования переложите покровы с клетками на 12-луночную пластину.
    Промыть клетки фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS) (1x) два раза и инкубировать в течение 10 мин в 4% параформальдегиде (PFA) (0,5 мл на лунку в 12-луночной пластине) на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фиксированный образец может быть покрыт 2 мл PBS (1x) и храниться при 4 °C до тех пор, пока не потребуется иммуноокрашивание. PFA токсичен и подозревается в возникновении рака. Предотвращайте воздействие на кожу и глаза и работайте под химическим дымом.
  2. Блокируют и проникают клетки и инкубируют блокирующим буфером, содержащим PBS (1x), 0,3% Triton X-100 и 10% нормальную козью сыворотку в течение 1 ч при RT.
  3. Инкубировать с первичными антителами в блокирующем буфере в течение ночи при 4 °C: окрашивать иПСК с антиоктамер-связывающим фактором транскрипции 4 (Oct4) и антистадийным эмбриональным антигеном-4 (SSEA4), НСК с анти-определяющей пол областью Y box-2 (Sox2) и анти-Nestin, нервные сферы с антипарным боксом-6 (Pax6) и анти-Nestin, астроциты с антиглиальным фибриллярным кислым белком (GFAP) и анти-S100 кальций-связывающим белковым β (S100β) и нейроны DA с антитирозингидроксилазой (TH), анти-β III тубулин (Tuj 1), анти-синаптофизин и анти-PSD-95 (0,5 мл раствора первичного антитела на лунку в 12-луночной пластине; см. Таблицу материалов для деталей).
  4. Промывайте образцы PBS (1x) три раза в течение 10 минут каждый с мягким раскачиванием.
  5. Инкубировать с раствором вторичных антител (1:800 в блокирующем буфере, 0,5 мл раствора вторичных антител Alexa Fluor на лунку в 12-луночной пластине) в течение 1 ч при РТ с мягким раскачиванием.
  6. Инкубируют клетки с Hoechst 33342 (1:5000, 0,5 мл на лунку в 12-луночной пластине) в PBS (1x) в течение 15 мин на RT для маркировки ядер.
  7. Установите клетки с монтажной средой и высушите в течение ночи в RT для визуализации под флуоресцентным микроскопом в темноте. Дополнительный рисунок S1 для настроек и параметров микроскопа.

3. Измерение проточной цитометрии митохондриального объема, MMP и митохондриального АФК в живых клетках

  1. Засейте клетки отдельно в 4 лунки в 6-луночную пластину, пока ячейки не достигнут 50-60% слияния. Обозначьте эти четыре скважины как # 1, # 2, # 3 и # 4.
  2. В конце периода культивирования готовят 5 отдельных окрашивающих растворов (500 мкл на лунку в 6-луночной пластине) следующим образом: No1 только культуральная среда (до скважины No1, содержащей только клетки для контроля); No2-1, содержащий FCCP (100 мкМ); No2-2, содержащий FCCP (100 мкМ) + TMRE (100 нМ) + МТГ (150 нМ) в питательной среде; No3, содержащий TMRE (100 нМ) + МТГ (150 нМ) в питательной среде; #4, содержащий MitoSox Red (10 мкМ) + MTG (150 нМ) в PBS (1x) с 10% FBS. См. Рисунок 1А, Дополнительная таблица S2 и Таблица материалов для получения подробной информации об этих соединениях и настройке проточной цитометрии.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте культуральную среду для приготовления окрашивающего раствора. Разогрейте среду и PBS (1x) на RT перед использованием. FCCP токсичен; предотвращать воздействие на кожу и глаза и работать под химическим дымом.
  3. Аспирируйте среду из лунки No2 и добавьте раствор No2-1 (только FCCP). Инкубировать клетки при 37 °C в течение 10 мин.
  4. Аспирировать среду из скважин No2 и No3 и добавить раствор No2-2 (FCCP + TMRE + MTG) в скважину No2 и раствор No3 (ПМРЭ + МТГ) в Луну No3. Инкубировать клетки при 37 °C в течение 45 мин.
  5. Аспирировать среду из лунки No4 и добавить раствор No4 (MitoSox Red + MTG). Инкубируют клетки при 37 °C в течение 15 мин.
  6. Аспирировать среду из всех скважин. Промывайте PBS (1x) (4 мл на скважину в 6-луночной плите). Отсоедините клетки с помощью 1 мл клеточного диссоциационного реагента (1 мл на лунку в 6-луночной пластине) при 37 °C в течение 5 мин. Нейтрализуют клеточный диссоциационный реагент в 1 мл DMEM с 10% FBS (2 мл на лунку в 6-луночной пластине).
  7. Соберите содержимое всех колодцев в конические трубки по 15 мл. Центрифугируйте пробирки по 300 × г в течение 5 мин. Вымойте гранулы PBS (1x) один или два раза.
  8. Аспирируйте супернатанты, но оставляйте примерно 100 мкл в пробирках. Повторное суспендирование клеточных гранул в 300 мкл PBS (1x). Перенесите клетки в микроцентрифужные трубки объемом 1,5 мл. Держите трубки в темноте при RT.
  9. Анализируйте клетки с помощью проточного цитометра (с конфигурацией 3 синего и 1 красного лазера). Обнаружение MTG в фильтре 1 (FL1) с помощью полосового фильтра 530/30, TMRE в фильтре 2 (FL2) с помощью полосового фильтра 585/40 и MitoSox Red в фильтре 3 (FL3) с помощью полосового фильтра 510/580.

4. Измерение проточной цитометрии субъединиц комплекса MRC и TFAM в фиксированных клетках

  1. В конце периода культивирования отсоединяют клетки (~106) путем добавления реагента диссоциации клеток; затем гранулируют и собирают клетки в пробирку объемом 15 мл. Промыть ячейки центрифугированием PBS (1x) дважды центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин.
  2. Зафиксируйте клетки в 1,6% PFA (1 мл 1,6% PFA в пробирке 15 мл) на RT в течение 10 мин. Промыть ячейки центрифугированием PBS (1x) дважды центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин.
  3. Пермеабилизируйте клетки ледяным 90% метанолом (1 мл 90% метанола в пробирке 15 мл) при -20 °C в течение 20 мин.
  4. Блокируйте образцы в блокирующем буфере, содержащем 0,3 М глицина, 5% козьей сыворотки и 1% бычьего сывороточного альбумина (BSA) - фракцию V в PBS (1x) (1 мл блокирующего буфера в пробирке 15 мл). Промывайте ячейки центрифугированием PBS (1x) дважды (как на этапе 3.7).
  5. Инкубируют клетки со следующими первичными антителами в течение 30 мин: анти-NDUFB10 (1:1000) для измерения субъединицы комплекса I, антисукцинатдегидрогеназного комплекса флавопротеиновая субъединица A (SDHA, 1:1000) для измерения субъединицы комплекса II и анти-ЦОГ IV (1:1000) для измерения комплексной IV субъединицы и анти-TFAM антитело, конъюгированное с Alexa Fluor 488 (1:400). Окрашивают такое же количество клеток отдельно антителом против TOMM20, конъюгированным с Alexa Fluor 488 (1:400) в течение 30 мин (1 мл раствора первичного антитела в пробирке объемом 15 мл; подробнее об антителах см. Таблицу материалов ).
  6. Промыть ячейки PBS (1x) однократно с центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин. Добавьте вторичное антитело (1:400) в пробирки NDUFB10, SDHA и COX IV и инкубируйте клетки этими растворами в течение 30 мин.
  7. Промывайте ячейки PBS (1x) однократно центрифугированием при 300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте супернатанты, оставляя примерно 100 мкл в пробирках. Повторное суспендирование клеточных гранул в 300 мкл PBS (1x). Переложите клетки в 1,5 мл микроцентрифужных трубок, хранящихся в темноте на льду.
  8. Проанализируйте клетки на проточном цитометре (с конфигурацией 3 синих и 1 красный лазер). Обнаружение сигналов в фильтре 1 (FL1) с помощью полосового фильтра 530/30. Дополнительный рисунок S2 для настроек и параметров микроскопа.

5. Сбор и анализ проточной цитометрии

  1. Используйте неокрашенную контрольную трубку для установки диаграмм рассеяния прямого рассеяния (FSC-A) и области бокового рассеяния (SSC-A) на основе размера и сложности анализируемой популяции клеток. Дополнительный рисунок S2 для настроек и параметров микроскопа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройка неокрашенных элементов управления для отдельных типов клеток.
  2. Используйте непятнистые контрольные трубки для выбора положительных затворов и используйте одноцветные управляющие трубки для компенсации флуоресцентного спектрального перекрытия между MTG (флуорофор-1 [FL-1]) и TMRE (FL-2) в многоцветной проточной цитометрии. Используйте контроль изотипов для отрицательного контроля для мониторинга фонового окрашивания в образцах MRC и TFAM. Используйте трубку FCCP в качестве деполяризационного контроля для окрашивания TMRE.
  3. Выгоните посторонний мусор для отбора живых клеток и основного затвора с передней и боковой диаграммы рассеяния (рисунок 2А). Выгоняйте дублеты, используя график плотности прямого рассеяния (FSC-H) против (vs.) FSC-A для исключения дублетов, а также построения боковой высоты рассеяния (SSC-H) против графика SSC-A (рисунок 2A).
  4. Сбор данных (проточный цитометр)
    1. Используя неокрашенные или изотипные образцы в качестве отрицательного элемента управления, создайте затвор над основной популяцией одноклеточных событий при просмотре SSC-A и различных фильтров (FL1, FL2, FL3, FL4) (рисунок 1B и рисунок 2B).
  5. Анализ данных (программное обеспечение CFlow)
    1. Скопируйте положение затворов на образцы окрашенных клеток и запишите количество положительно окрашенных клеток для положительного окрашивания.
    2. Для каждой подпопуляции клеток выберите график гистограммы и проанализируйте среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) различных каналов фильтра (FL1, FL2, FL3, FL4) (ось X).
      1. Рассчитайте уровни TMRE, вычитая MFI FL2 клеток, обработанных FCCP, из MFI FL2 из образцов, окрашенных #3 TMRE, в гистограмме, как в Eq (1) ниже.
        Уровни TMRE = MFI FL2 из образцов, окрашенных #3 TMRE - MFI FL2 клеток, обработанных FCCP #2 (1)
      2. Рассчитайте конкретные значения для MMP и митохондриальной АФК по MFI в TMRE или MitoSox Red, разделив индикатор объема митохондрий MTG.
      3. Рассчитайте конкретное значение для сложной субъединицы и TFAM с помощью MFI в комплексном выражении или TFAM, разделив индикатор объема митохондрий TOMM20.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Схематическое описание метода дифференциации и цитометрических стратегий потока показано на рисунке 3. Человеческие ИПСК дифференцируются в нейронные розетки, а затем поднимаются в культуру суспензии для дифференциации в нейронные сферы. Нейронные сферы далее диффер...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Здесь представлены протоколы для генерации нейронов и астроцитов, полученных из iPSC, и оценки нескольких аспектов функции митохондрий с использованием проточной цитометрии. Эти протоколы позволяют эффективно преобразовывать человеческие ИПСК как в нейроны, так и в глиальные астроцит?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы любезно благодарим Центр молекулярной визуализации и Центр проточной цитометрии в Университете Бергена в Норвегии. Эта работа была поддержана финансированием Норвежского исследовательского совета (номер гранта: 229652), Rakel og Otto Kr.Bruuns legat и Китайского стипендиального совета (номер проекта: 201906220275).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
anti-Oct4Abcamab19857, RRID:AB_445175Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4Abcamab16287, RRID:AB_778073Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2Abcamab97959, RRID:AB_2341193Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6Abcamab5790, RRID:AB_305110Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-NestinSanta Cruz Biotechnologysc-23927, RRID:AB_627994Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAPAbcamab4674, RRID:AB_304558Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488Abcamab196442, RRID:AB_2722596Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-THAbcamab75875, RRID:AB_1310786Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1Abcamab78078, RRID:AB_2256751Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-SynaptophysinAbcamab32127, RRID:AB_2286949Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95Abcamab2723, RRID:AB_303248Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488Abcamab198308Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488Santa Cruz BiotechnologyCat# sc-17764 RRID:AB_628381Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10Abcamab196019Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHAAbcamab137040Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IVAbcamab14744, RRID:AB_301443Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin APeproTech120-14EAstrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal MediumLonzaCC-3187Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement PackLonzaCC-4123Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-AntimycoticThermo Fisher Scientific15240062CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12Thermo Fisher Scientific12634010Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum AlbuminEuropa BioproductsEQBAH62-1000Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNFPeproTech450-02DA neurons medium ingredient
B-27 SupplementThermo Fisher Scientific17504044Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow CytometerBD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid ConcentrateThermo Fisher Scientific11905031CDM ingredient
Collagenase IVThermo Fisher Scientific17104019Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 GLeica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishesSigma-AldrichCLS430589Suspension culture
DPBSThermo Fisher Scientific14190250Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplementThermo Fisher Scientific10565018Astrocyte differentiation basal Medium
EDTAThermo Fisher Scientific15575020Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal MediumThermo Fisher ScientificA1516901Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X)Thermo Fisher ScientificA1517101Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human ProteinThermo Fisher ScientificPHG0314Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human ProteinThermo Fisher ScientificPHG0024Supplement for NSC culture
Fetal Bovine SerumSigma-Aldrich12103CMedium ingredient
FGF-basicPeproTech100-18BAstrocyte differentiation medium ingredient
FCCPAbcamab120081Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC controlVacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%Thermo Fisher Scientific28908Cell fixation
GeltrexThermo Fisher ScientificA1413302Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX SupplementThermo Fisher Scientific35050061Supplement for NSC culture
GDNFPeprotech450-10DA neurons medium ingredient
GlycineSigma-AldrichG8898Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient MixThermo Fisher Scientific31765027Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 humanSigma-AldrichSRP3055Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342Thermo Fisher ScientificH1399Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 IncubatorsFisher Scientific, USA
IMDMThermo Fisher Scientific21980032Basal medium for CDM
InsulinRoche1376497CDM ingredient
InSolution AMPK InhibitorSigma-Aldrich171261Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I humanSigma-AldrichI3769Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 mediumThermo Fisher Scientific12660012Basal medium for NSC culture
LamininSigma-AldrichL2020Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscopeLeica Microsystems, Germany
MonothioglycerolSigma-AldrichM6145CDM ingredient
MitoTracker Green FMThermo Fisher ScientificM7514Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox RedThermo Fisher ScientificM36008Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteineSigma-AldrichA7250Neural induction medium ingredient
N-2 SupplementThermo Fisher Scientific17502048Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serumThermo Fisher ScientificPCN5000Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solutionSigma-AldrichP4957Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromideSigma-AldrichP7405Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
PurmorphamineSTEMCELL Technologies72204Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade MountantThermo Fisher ScientificP36930Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1xThermo Fisher Scientific18912014Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b ProteinR&D Systems423-F8-025/CFPromotes DA neuron differentiation
SB 431542Tocris BioscienceTB1614-GMPNeural Induction Medium ingredient
StemPro Neural SupplementThermo Fisher ScientificA10508-01Supplement for NSCs culture
TrypLE Express EnzymeThermo Fisher Scientific12604013Cell dissociation reagent
TransferrinRoche652202CDM ingredient
TRITON X-100VWR International9002-93-1Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMREAbcamab113852Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant InstrumentsGrant Instruments, USA

Ссылки

  1. Wang, Y., Xu, E., Musich, P. R., Lin, F. Mitochondrial dysfunction in neurodegenerative diseases and the potential countermeasure. CNS Neuroscience & Therapeutics. 25 (7), 816-824 (2019).
  2. Chen, A., et al. Nicotinamide riboside and metformin ameliorate mitophagy defect in induced pluripotent stem cell-derived astrocytes with POLG mutations. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 737304(2021).
  3. Liang, K. X., et al. Disease-specific phenotypes in iPSC-derived neural stem cells with POLG mutations. EMBO Molecular Medicine. 12 (10), 12146(2020).
  4. Chen, H., Chan, D. C. Mitochondrial dynamics--fusion, fission, movement, and mitophagy--in neurodegenerative diseases. Human Molecular Genetics. 18, 169-176 (2009).
  5. Lin, M. T., Beal, M. F. Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature. 443 (7113), 787-795 (2006).
  6. Singh, A., Kukreti, R., Saso, L., Kukreti, S. Oxidative stress: A key modulator in neurodegenerative diseases. Molecules. 24 (8), Basel, Switzerland. 1583(2019).
  7. Kondadi, A. K., Anand, R., Reichert, A. S. Functional interplay between cristae biogenesis, mitochondrial dynamics and mitochondrial DNA integrity. International Journal of Molecular Sciences. 20 (17), 4311(2019).
  8. Sterneckert, J. L., Reinhardt, P., Schöler, H. R. Investigating human disease using stem cell models. Nature Reviews. Genetics. 15 (9), 625-639 (2014).
  9. Patani, R. Human stem cell models of disease and the prognosis of academic medicine. Nature Medicine. 26 (4), 449(2020).
  10. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. , 337(2021).
  11. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  12. Juopperi, T. A., et al. Astrocytes generated from patient induced pluripotent stem cells recapitulate features of Huntington's disease patient cells. Molecular Brain. 5, 17(2012).
  13. Liang, K. X., et al. Stem cell derived astrocytes with POLG mutations and mitochondrial dysfunction including abnormal NAD+ metabolism is toxic for neurons. bioRxiv. , (2020).
  14. Liu, Q., et al. Human neural crest stem cells derived from human ESCs and induced pluripotent stem cells: induction, maintenance, and differentiation into functional schwann cells. Stem Cells Translational Medicine. 1 (4), 266-278 (2012).
  15. Hong, Y. J., Do, J. T. Neural lineage differentiation from pluripotent stem cells to mimic human brain tissues. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 400(2019).
  16. Lundin, A., et al. Human iPS-derived astroglia from a stable neural precursor state show improved functionality compared with conventional astrocytic models. Stem Cell Reports. 10 (3), 1030-1045 (2018).
  17. Liang, K. X., et al. N-acetylcysteine amide ameliorates mitochondrial dysfunction and reduces oxidative stress in hiPSC-derived dopaminergic neurons with POLG mutation. Experimental Neurology. 337, 113536(2021).
  18. Pendergrass, W., Wolf, N., Poot, M. Efficacy of MitoTracker Green™ and CMXrosamine to measure changes in mitochondrial membrane potentials in living cells and tissues. Cytometry. Part A. 61 (2), 162-169 (2004).
  19. Keij, J. F., Bell-Prince, C., Steinkamp, J. A. Staining of mitochondrial membranes with 10-nonyl acridine orange, MitoFluor Green, and MitoTracker Green is affected by mitochondrial membrane potential altering drugs. Cytometry. 39 (3), 203-210 (2000).
  20. Buckman, J. F., et al. MitoTracker labeling in primary neuronal and astrocytic cultures: influence of mitochondrial membrane potential and oxidants. Journal of Neuroscience Methods. 104 (2), 165-176 (2001).
  21. Zanchetta, L. M., Kirk, D., Lyng, F., Walsh, J., Murphy, J. E. Cell-density-dependent changes in mitochondrial membrane potential and reactive oxygen species production in human skin cells post sunlight exposure. Photodermatology, Photoimmunology & Photomedicine. 26 (6), 311-317 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

177

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены