Análise citométrica de fluxo de múltiplos parâmetros mitocondriais em células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e seus derivados neurais e gliais

Resumo

Este estudo relata uma nova abordagem para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais com base na citometria de fluxo e dupla coloração com dois repórteres fluorescentes ou anticorpos para detectar alterações no volume mitocondrial, potencial de membrana mitocondrial, nível de espécies reativas de oxigênio, composição da cadeia respiratória mitocondrial e DNA mitocondrial.

Resumo

As mitocôndrias são importantes na fisiopatologia de muitas doenças neurodegenerativas. Alterações no volume mitocondrial, no potencial de membrana mitocondrial (MMP), na produção mitocondrial de espécies reativas de oxigênio (ROS) e no número de cópias do DNA mitocondrial (mtDNA) são frequentemente características desses processos. Este relatório detalha uma nova abordagem baseada em citometria de fluxo para medir múltiplos parâmetros mitocondriais em diferentes tipos de células, incluindo células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) e células neurais e gliais derivadas de iPSC. Essa estratégia baseada em fluxo usa células vivas para medir o volume mitocondrial, os níveis de MMP e ROS, bem como células fixas para estimar componentes da cadeia respiratória mitocondrial (MRC) e proteínas associadas ao mtDNA, como o fator de transcrição mitocondrial A (TFAM).

Ao co-coloração com repórteres fluorescentes, incluindo MitoTracker Green (MTG), éster etílico de tetrametilrodamina (TMRE) e MitoSox Red, mudanças no volume mitocondrial, MMP e ROS mitocondrial podem ser quantificadas e relacionadas ao conteúdo mitocondrial. A dupla coloração com anticorpos contra subunidades do complexo MRC e translocase da membrana mitocondrial externa 20 (TOMM20) permite a avaliação da expressão da subunidade MRC. Como a quantidade de TFAM é proporcional ao número de cópias de mtDNA, a medição de TFAM por TOMM20 fornece uma medição indireta de mtDNA por volume mitocondrial. Todo o protocolo pode ser realizado dentro de 2-3 h. É importante ressaltar que esses protocolos permitem a mensuração de parâmetros mitocondriais, tanto no nível total quanto no nível específico por volume mitocondrial, utilizando citometria de fluxo.

Introdução

As mitocôndrias são organelas essenciais presentes em quase todas as células eucarióticas. As mitocôndrias são responsáveis pelo fornecimento de energia, produzindo trifosfato de adenosina (ATP) através da fosforilação oxidativa e atuam como intermediários metabólicos para a biossíntese e o metabolismo. As mitocôndrias estão profundamente envolvidas em muitos outros processos celulares importantes, como a geração de EROs, a morte celular e a regulação intracelular do Ca²+. A disfunção mitocondrial tem sido associada a várias doenças neurodegenerativas, incluindo a doença de Parkinson (DP), a doença de Alzheimer (DA), a doença de Huntington (DH), a ataxia de Friedreich (FRDA) e a esclerose lateral amiotrófica (ELA)¹. Acredita-se que o aumento da disfunção mitocondrial e a anormalidade do mtDNA também contribuam para o envelhecimento humano ^2,3.

Vários tipos de disfunção mitocondrial ocorrem em doenças neurodegenerativas, e alterações no volume mitocondrial, despolarização da MMP, produção de ERO e alterações no número de cópias do mtDNA são comuns 4,5,6,7. Portanto, a capacidade de medir essas e outras funções mitocondriais é de grande importância ao estudar os mecanismos da doença e testar potenciais agentes terapêuticos. Além disso, diante da falta de modelos animais que repliquem fielmente as doenças neurodegenerativas humanas, o estabelecimento de sistemas de modelos in vitro adequados que recapitulem a doença humana nas células cerebrais é um passo importante para uma maior compreensão dessas doenças e o desenvolvimento de novas terapias 2,3,8,9.

As iPSCs humanas podem ser usadas para gerar várias células cerebrais, incluindo células neuronais e não neuronais (ou seja, células gliais), e danos mitocondriais associados à doença neurodegenerativa foram encontrados em ambos os tipos celulares 3,10,11,12,13. Métodos apropriados para diferenciação de iPSC em linhagens neurais e gliais estão disponíveis^14,15,16. Essas células fornecem uma plataforma única para humanos / pacientes para modelagem de doenças in vitro e triagem de medicamentos. Além disso, como estes são derivados de pacientes, os neurônios derivados de iPSC e as células gliais fornecem modelos de doença que refletem o que está acontecendo em humanos com mais precisão.

Até o momento, poucos métodos convenientes e confiáveis para medir múltiplos parâmetros funcionais mitocondriais em iPSCs, particularmente neurônios vivos e células gliais, estão disponíveis. O uso da citometria de fluxo fornece ao cientista uma ferramenta poderosa para medir parâmetros biológicos, incluindo a função mitocondrial, em células individuais. Este protocolo fornece detalhes para a geração de diferentes tipos de células cerebrais, incluindo células-tronco neurais (NSCs), neurônios e astrócitos gliais de iPSCs, bem como novas abordagens baseadas em citometria de fluxo para medir múltiplos parâmetros mitocondriais em diferentes tipos de células, incluindo iPSCs e células neurais e gliais derivadas de iPSC. O protocolo também fornece uma estratégia de co-coloração para o uso de citometria de fluxo para medir o volume mitocondrial, MMP, nível de ROS mitocondrial, complexos MRC e TFAM. Ao incorporar medidas de volume ou massa mitocondrial, esses protocolos também permitem a medição do nível total e do nível específico por unidade mitocondrial.

Protocolo

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais e a Tabela Suplementar S1 para obter receitas de todas as mídias e soluções usadas neste protocolo.

1. Diferenciação de iPSCs humanas em NCSs, neurônios dopaminérgicos (DA) e astrócitos

1. Preparar placas revestidas de matriz.
   1. Descongele um frasco para injetáveis de 5 ml de matriz no gelo durante a noite. Diluir 1 mL de matriz com 99 mL de F-12 (Advanced DMEM/F12) de Advanced Dulbecco (Advanced DMEM/F12) a frio (concentração final de 1%). Fazer alíquotas de 1 ml e armazená-las a -20 °C.
   2. Descongele a solução da matriz a 4 °C (mantenha-a fria) e revestir 6 poços (1 mL por poço em uma placa de 6 poços).
   3. Colocar a placa revestida de matriz numa incubadora de ar humidificada a 5%_{de CO 2}/95% a 37 °C durante 1 h. Retire a placa da incubadora e deixe-a se equilibrar à temperatura ambiente (RT).
      NOTA: Recomenda-se usar a placa dentro de 3 dias após o revestimento. No entanto, a placa revestida pode ser armazenada por até 2 semanas a 4 °C. Apenas lembre-se de tirá-lo e deixá-lo aquecer para RT antes de usar. Para armazenamento prolongado, adicione 1 mL de meio de cultura iPSC à placa revestida para evitar a secagem da matriz.
2. Descongelamento de iPSCs
   1. Pré-aqueça as placas revestidas de matriz a RT ou na incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Pré-aqueça a quantidade necessária de meio de cultura iPSC no RT.
   2. Misture 6 mL de meio de cultura iPSC pré-aquecido com 12 μL de inibidor de Y-27632 ROCK para obter uma concentração final de 10 μM.
   3. Descongelar parcialmente o frasco para injetáveis congelado de iPSCs a 37 °C em banho-maria até que permaneça um pequeno pedaço de gelo.
   4. Adicione lentamente 1 mL de meio de cultura iPSC pré-aquecido com 12 μL de inibidor de ROCK gota a gota às células. Transfira o conteúdo líquido do frasco para injetáveis com iPSCs gota a gota para um poço de uma placa pré-revestida de 6 poços usando uma pipeta de 5 mL.
   5. Mova a placa em direções perpendiculares para misturar o conteúdo do poço e retornar a placa para a incubadora. Trocar o meio de cultura iPSC após 24 h após a lavagem com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) da Dulbecco (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
      NOTA: Não adicione inibidor de ROCK a alimentações subsequentes. Altere o meio de cultura iPSC diariamente.
3. Subcultura de iPSCs
   1. Pré-aqueça as placas revestidas de matriz a RT ou na incubadora a 37 °C durante 20-30 min. Pré-aqueça a quantidade necessária de meio de cultura iPSC no RT.
   2. Aspirar o meio de cultura das placas que contêm as células. Enxaguar as iPSCs com DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
   3. Adicione EDTA (0,5 mM) (1 mL por poço em uma placa de 6 poços). Incubar as placas a 37 °C até que as bordas das colônias comecem a levantar do poço (geralmente 3-5 min). Aspirar o EDTA.
   4. Adicione o meio de cultura iPSC pré-aquecido (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e desprenda com força as colônias de iPSC usando uma pipeta estéril de 10 mL uma vez. Não pipete para cima e para baixo, pois isso pode quebrar aglomerados de células em células únicas.
   5. Transfira o conteúdo de cada poço para dois poços individuais em uma placa de 6 poços revestida de matriz (2 mL por poço em uma placa de 6 poços) e incube a 37 °C. Não gere bolhas na suspensão durante a pipetagem.
      NOTA: Agite a placa suavemente antes de a manter na incubadora. A proporção de divisão pode ser de 1:2 (um poço em 2 novos poços) para 1:4 (um poço em 4 novos poços).
   6. Substitua o meio diariamente até que as colônias atinjam 60% de confluência com bom tamanho e conexões.
4. Indução neural e geração de progenitores neurais
   1. Prepare 500 mL de Meio Quimicamente Definido (MDL), 500 mL de Meio de Indução Neural (NIM) e 500 mL de meio livre de soro de células-tronco neurais (NSC SF).
   2. Lave as células com DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e adicione NIM (3 mL por poço em uma placa de 6 poços). Configure como Dia 0.
   3. Substitua o NIM (3 mL por poço em uma placa de 6 poços) no Dia 1, Dia 3 e Dia 4 e observe sob a microscopia diariamente.
   4. No Dia 5, desprenda as rosetas neurais em cultura de suspensão, conforme descrito abaixo.
      1. Lave uma vez suavemente com DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-free) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços). Adicione a colagenase IV (1 mL por poço em uma placa de 6 poços) e mantenha em uma incubadora por 1 min. Aspirar a colagenase IV e lavar uma vez com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) suavemente.
      2. Adicione 2 mL de NSC SF Medium por poço a uma placa de 6 poços. Desprenda as células raspando os fundos dos poços desenhando grades usando uma ponta de pipeta de 200 μL.
      3. Recolha a suspensão celular da placa de 6 poços num prato não aderente de 10 cm. Perfazer o volume para 12 mL com NSC SF Medium.
      4. Agite o prato não aderente a 65-85 rpm em um agitador orbital em uma incubadora para evitar a agregação.
5. Diferenciação de neurônios DA
   1. No Dia 7, adicione 12 mL de MDL suplementado com fator de crescimento de fibroblastos de 100 ng/mL-8b (FGF-8b) e coloque o prato no agitador orbital na incubadora.
   2. Nos dias 8-13, troque o meio a cada 2 dias e observe sob a microscopia diariamente.
   3. No Dia 14, adicione 12 mL de MDL suplementado com 100 ng/mL de FGF-8b e 1 μM de purmorfamina (PM). Coloque o prato no agitador orbital na incubadora.
   4. Nos dias 15-20, mude o meio a cada 2 dias e observe as células sob a microscopia diariamente.
   5. Passe mecanicamente as esferas usando pontas de 1000 μL para quebrar as esferas maiores.
      NOTA: A proporção pode ser de 1:2 (um prato em 2 pratos novos).
6. Cessação da diferenciação
   1. Revestir uma placa de 6 poços ou tampas com Poly-L-Ornithine (PLO) e laminina conforme descrito abaixo.
      1. Revestir uma placa de 6 poços com 1 mL de OLP por poço e incubar a placa a 37 °C por 20 min. Aspirar a solução PLO.
      2. Esterilize a placa sob UV por 20 min. Lave os poços duas vezes com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços).
      3. Adicionar 5 μg/ml de solução de laminina (1 ml por alvéolo numa placa de 6 poços) ao alvéolo e incubar a 37 °C durante 2 h. Aspirar a laminina e lavar os poços brevemente com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) uma vez antes do revestimento.
   2. Recolher todas as esferas (a partir do passo 1.5.5) em tubos de 50 ml e completar com DPBS (1x). Gire a 300 × g por 5 min. Aspirar o sobrenadante.
   3. Incubar com 2 ml de reagente de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) durante 10 min a 37 °C em banho-maria seguido de trituração suave com uma pipeta de 200 μL (20-50 vezes dependendo do tamanho das esferas, evitando a formação de bolhas).
   4. Neutralizar o reagente de dissociação celular com 2 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) com 10% de soro fetal bovino (FBS) e centrifugar o tubo cônico de 50 mL contendo as células a 300 × g por 5 min no RT. Aspirar o sobrenadante.
   5. Adicione 1 mL de MDL suplementado com 10 ng/mL de Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF) e 10 ng/mL Fator neurotrófico derivado da linhagem celular glial (GDNF) para ressuspender os pellets celulares pipetando suavemente para cima e para baixo para obter suspensões unicelulares.
   6. Aspirar a solução de laminina da placa (etapa 1.6.1.3), lavar brevemente com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e semear as células (a partir da etapa 1.6.5) nas placas pré-revestidas ou folhas de cobertura em 3 mL de MDL suplementado com 10 ng/mL de BDNF e 10 ng/mL de GDNF. Alimente as células a cada 4 dias.
      NOTA: As culturas diferenciadoras podem ser mantidas por muitas semanas até 3 meses. A morfologia neural geralmente aparece após 2 semanas de término e pode ser usada para análises a jusante a partir desse ponto. BDNF e GDNF não são necessários para a cultura para manutenção mais longa (até 2 meses).
7. Geração de NSC
   1. Placas matriciais de revestimento.
   2. Recolha todas as esferas neurais (geradas a partir do passo 1.4) em tubos de 50 ml e recarregue com DPBS (1x) (livre de Ca²⁺/Mg²⁺). Gire a 300 × g por 5 min. Aspirar os sobrenadantes.
   3. Incubar os pellets com 2 mL de reagente de dissociação celular por 10 min a 37 °C em banho-maria, seguido de trituração suave com pipeta de 200 μL (20-50 vezes dependendo do tamanho das esferas, evitando a formação de bolhas).
   4. Neutralizar com 2 mL de DMEM com FBS a 10% e centrifugar os tubos cônicos de 50 mL contendo as células a 300 × g por 5 min no RT. Aspirar os sobrenadantes. Ressuspenda os pellets celulares pipetando suavemente para cima e para baixo para obter suspensões unicelulares.
   5. Aspirar a solução matricial de uma placa pré-revestida e semear as células nas placas pré-revestidas em meio NSC SF (3 mL por poço em uma placa de 6 poços). Alimente as células a cada 2-3 dias e divida as células quando confluentes.
      NOTA: A partir deste estágio, os NSCs podem ser expandidos e congelados.
8. Diferenciação de astrócitos da glia
   1. Diferenciação de astrócitos a partir de NSCs
      1. Preparar 500 mL de Meio de Diferenciação de Astrócitos.
      2. NSCs de sementes em placas/coberturas revestidas com poli-D-lisina (PDL) com meio NSC SF.
      3. No dia seguinte, lave as células com DPBS (1x) (Ca 2+/Mg²⁺-livre) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e adicione o Meio de Diferenciação de Astrócitos (3 mL por poço em uma placa de 6 poços). Configure como Dia 0.
      4. Observe os NSCs ao microscópio diariamente e substitua o Meio de Diferenciação de Astrócitos (3 mL por poço em uma placa de 6 poços) a cada 2 dias dos Dias 1 a 27.
   2. Maturação de astrócitos
      1. Prepare o Meio de Maturação de Astrócitos.
      2. No dia 28, lave as células com DPBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços) e adicione o Meio de Maturação de Astrócitos (3 mL por poço em uma placa de 6 poços).
      3. No dia 29 em diante, observe as células ao microscópio diariamente e substitua o Meio de Maturação de Astrócitos (3 mL por poço em uma placa de 6 poços) a cada 2 dias.
      4. Após um mês de maturação, expanda as células e criopreserve-as a partir desta fase.
         Observação : durante esta fase, o número de células aumentará. Ao dividir as células, as coberturas revestidas com PDL não são necessárias para a cultura.

2. Caracterização celular por imunocitoquímica e coloração por imunofluorescência

1. No final do período de cultura, transfira as coberturas com as células para uma placa de 12 poços.
   Enxaguar as células com solução salina tamponada com fosfato (PBS) (1x) duas vezes e incubar por 10 min em Paraformaldeído (PFA) a 4% (0,5 mL por poço em uma placa de 12 poços) no RT.
   NOTA: A amostra fixa pode ser coberta com 2 mL de PBS (1x) e armazenada a 4 °C até que seja necessária a imunocoloração. O PFA é tóxico e é suspeito de causar câncer. Evite a exposição da pele e dos olhos e trabalhe sob um exaustor químico.
2. Bloquear e permeabilizar as células e incubar com tampão bloqueador contendo PBS (1x), Triton X-100 a 0,3% e soro caprino normal a 10% por 1 h no RT.
3. Incubar com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante a noite a 4 °C: iPSCs de coloração com fator de transcrição anti-octamero ligado 4 (Oct4) e antígeno embrionário anti-estágio específico-4 (SSEA4), NSCs com região anti-determinante de sexo Y box-2 (Sox2) e anti-Nestina, esferas neurais com box-6 anti-pareado (Pax6) e anti-Nestina, astrócitos com proteína ácida fibrilar antiglial (GFAP) e proteína anti-ligação ao cálcio S100 β (S100β) e neurônios DA com anti-tirosina hidroxilase (TH), anti-β III Tubulina (Tuj 1), anti-Sinaptofisina e anti-PSD-95 (0,5 mL de solução primária de anticorpos por poço em uma placa de 12 poços; consulte a Tabela de Materiais para detalhes).
4. Lave as amostras com PBS (1x) três vezes durante 10 minutos cada com balanço suave.
5. Incubar com solução de anticorpos secundários (1:800 em tampão de bloqueio, 0,5 mL de solução de anticorpo secundário Alexa Fluor por poço em uma placa de 12 poços) por 1 h no RT com balanço suave.
6. Incubar as células com Hoechst 33342 (1:5.000, 0,5 ml por poço numa placa de 12 poços) em PBS (1x) durante 15 min a RT para marcar os núcleos.
7. Monte as células com meio de montagem e seque durante a noite no RT para obter imagens sob um microscópio de fluorescência no escuro. Consulte a Figura Suplementar S1 para as configurações e parâmetros do microscópio.

3. Medição da citometria de fluxo do volume mitocondrial, MMP e ROS mitocondrial em células vivas

1. Sesite as células separadamente em 4 poços em uma placa de 6 poços até que as células atinjam 50% a 60% de confluência. Rotule esses quatro poços como #1, #2, #3 e #4.
2. Ao final do período de cultura, preparar 5 soluções individuais de coloração (500 μL por poço em uma placa de 6 poços) da seguinte forma: #1 único meio de cultura (para o poço #1 contendo apenas células para controle); #2-1 contendo FCCP (100 μM); #2-2 contendo FCCP (100 μM) + TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) em meio de cultura; #3 contendo TMRE (100 nM) + MTG (150 nM) em meio de cultura; #4 contendo MitoSox Red (10 μM) + MTG (150 nM) em PBS (1x) com 10% FBS. Consulte a Figura 1A, a Tabela Suplementar S2 e a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre esses compostos e a configuração da citometria de fluxo.
   NOTA: Use o meio de cultura para preparar a solução de coloração. Aqueça o meio e o PBS (1x) no RT antes de usar. O FCCP é tóxico; prevenir a exposição da pele e dos olhos e trabalhar sob um exaustor químico.
3. Aspirar o meio do poço #2 e adicionar a solução #2-1 (somente FCCP). Incubar as células a 37 °C durante 10 minutos.
4. Aspirar o meio dos poços #2 e #3 e adicionar a solução #2-2 (FCCP + TMRE + MTG) no poço #2 e a solução #3 (TMRE + MTG) no #3. Incubar as células a 37 °C durante 45 min.
5. Aspirar o meio do poço #4 e adicionar a solução #4 (MitoSox Red + MTG). Incubar as células a 37 °C durante 15 minutos.
6. Aspirar o meio de todos os poços. Lave com PBS (1x) (4 mL por poço em uma placa de 6 poços). Descole as células usando 1 mL de reagente de dissociação celular (1 mL por poço em uma placa de 6 poços) a 37 °C por 5 min. Neutralizar o reagente de dissociação celular em 1 mL de DMEM com FBS a 10% (2 mL por poço em uma placa de 6 poços).
7. Coletar o conteúdo de todos os poços em tubos cônicos de 15 mL. Centrifugar os tubos a 300 × g durante 5 min. Lave os pellets com PBS (1x) uma ou duas vezes.
8. Aspirar os sobrenadantes, mas deixar aproximadamente 100 μL nos tubos. Ressuscite os pellets celulares em 300 μL de PBS (1x). Transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL. Mantenha os tubos no escuro em RT.
9. Analise as células usando um citômetro de fluxo (com uma configuração de laser 3 azul e 1 vermelho). Detecte MTG no filtro 1 (FL1) usando um filtro passa-banda 530/30, TMRE no filtro 2 (FL2) usando o filtro passa-banda 585/40 e MitoSox Red no filtro 3 (FL3) usando um filtro passa-banda 510/580.

4. Medição da citometria de fluxo de subunidades complexas MRC e TFAM em células fixas

1. No final do período de cultura, desprenda as células (~10⁶) adicionando o reagente de dissociação celular; em seguida, pellet e coletar as células em um tubo de 15 mL. Lavar as células por centrifugação com PBS (1x) duas vezes por centrifugação a 300 × g durante 5 min.
2. Fixar as células em PFA a 1,6% (1 mL de PFA a 1,6% em um tubo de 15 mL) no RT por 10 min. Lavar as células por centrifugação com PBS (1x) duas vezes por centrifugação a 300 × g durante 5 min.
3. Permeabilizar as células com metanol gelado a 90% (1 mL de metanol a 90% em um tubo de 15 mL) a -20 °C por 20 min.
4. Bloquear as amostras em tampão de bloqueio contendo 0,3 M de glicina, 5% de soro caprino e 1% de albumina sérica bovina (BSA) - Fração V em PBS (1x) (1 mL de tampão de bloqueio em um tubo de 15 mL). Lavar as células por centrifugação com PBS (1x) duas vezes (como no passo 3.7).
5. Incubar as células com os seguintes anticorpos primários por 30 min: anti-NDUFB10 (1:1.000) para medição da subunidade do complexo I, subunidade A da flavoproteína do complexo anti-succinato desidrogenase (SDHA, 1:1.000) para medição da subunidade do complexo II e anti-COX IV (1:1.000) para medição da subunidade do complexo IV e anticorpo anti-TFAM conjugado com Alexa Fluor 488 (1:400). Colorir o mesmo número de células separadamente com o anticorpo anti-TOMM20 conjugado com Alexa Fluor 488 (1:400) por 30 min (1 mL de solução de anticorpo primário em um tubo de 15 mL; consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre os anticorpos).
6. Lavar as células com PBS (1x) uma vez com centrifugação a 300 × g durante 5 min. Adicione anticorpos secundários (1:400) em tubos de NDUFB10, SDHA e COX IV e incube as células com essas soluções por 30 min.
7. Lavar as células com PBS (1x) uma vez por centrifugação a 300 × g durante 5 min. Aspirar os sobrenadantes, deixando aproximadamente 100 μL nos tubos. Ressuscite os pellets celulares em 300 μL de PBS (1x). Transfira as células para tubos de microcentrífuga de 1,5 mL mantidos no escuro no gelo.
8. Analise as células no citômetro de fluxo (com uma configuração de laser 3 azul e 1 vermelho). Detecte sinais no filtro 1 (FL1) usando um filtro passa-banda 530/30. Consulte a Figura Suplementar S2 para as configurações e parâmetros do microscópio.

5. Aquisição e análise da citometria de fluxo

1. Use o tubo de controle não corado para definir os gráficos de dispersão da área de dispersão frontal (FSC-A) e da área de dispersão lateral (SSC-A) com base no tamanho e na complexidade da população celular analisada. Consulte a Figura Suplementar S2 para as configurações e parâmetros do microscópio.
   Observação : configure controles não manchados para tipos de célula individuais.
2. Use os tubos de controle sem coloração para selecionar as portas positivas e use tubos de controle de cor única para compensar a sobreposição espectral de fluorescência entre MTG (fluoróforo-1 [FL-1]) e TMRE (FL-2) na citometria de fluxo multicolorida. Use o controle de isotipo para controle negativo para monitorar a coloração de fundo em amostras MRC e TFAM. Use o tubo FCCP como um controle de despolarização para coloração TMRE.
3. Retirar detritos estranhos para selecionar células vivas e o gating principal do gráfico de dispersão para frente e para o lado (Figura 2A). Duplicatas de saída de porta usando um gráfico de densidade de altura de dispersão frontal (FSC-H) versus (vs.) FSC-A para excluir duplicatas e também construir um gráfico de altura de dispersão lateral (SSC-H) versus SSC-A (Figura 2A).
4. Aquisição de dados (citômetro de fluxo)
   1. Usando as amostras não coradas ou isotipadas como um controle negativo, crie uma porta acima da população principal dos eventos de célula única enquanto visualiza o SSC-A e os vários filtros (FL1, FL2, FL3, FL4) (Figura 1B e Figura 2B).
5. Análise de dados (software CFlow)
   1. Copie a posição dos portões nas amostras de células coradas e registre a quantidade de células coradas positivamente para a coloração positiva.
   2. Para cada subpopulação celular, selecione um gráfico de histograma e analise a intensidade de fluorescência mediana (IFM) dos diferentes canais filtrantes (FL1, FL2, FL3, FL4) (eixo x).
      1. Calcule os níveis de TMRE subtraindo a IFM de FL2 de células tratadas com FCCP #2 da IFM de FL2 de amostras coradas com TMRE #3 em um histograma, como na Eq (1) abaixo.
         Níveis de TMRE = IFM de FL2 de amostras coradas com TMRE n.º 3 - IFM de FL2 de células tratadas com FCCP n.º 2 (1)
      2. Calcular os valores específicos de MMP e ROS mitocondrial por MFI em TMRE ou MitoSox Red, dividindo o indicador de volume mitocondrial MTG.
      3. Calcule o valor específico para subunidade complexa e TFAM usando MFI em expressão complexa ou TFAM, dividindo o indicador de volume mitocondrial TOMM20.

Resultados

Uma descrição esquemática do método de diferenciação e das estratégias de citometria de fluxo é mostrada na Figura 3. As iPSCs humanas são diferenciadas em rosetas neurais e, em seguida, levantadas em cultura de suspensão para diferenciação em esferas neurais. As esferas neurais são ainda mais diferenciadas e amadurecidas em neurônios DA. As esferas neurais são dissociadas em células únicas para gerar astrócitos gliais, revestidas em monocamadas como NSCs e, em seguida, dif...

Discussão

Aqui estão os protocolos para gerar neurônios e astrócitos derivados de iPSC e avaliar múltiplos aspectos da função mitocondrial usando citometria de fluxo. Esses protocolos permitem a conversão eficiente de iPSCs humanas em neurônios e astrócitos gliais e a caracterização detalhada da função mitocondrial, principalmente em células vivas. Os protocolos também fornecem uma estratégia baseada em citometria de fluxo de cocoloração para adquirir e analisar múltiplas funções mitocondriais, incluindo volum...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
anti-Oct4	Abcam	ab19857, RRID:AB_445175	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-SSEA4	Abcam	ab16287, RRID:AB_778073	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Sox2	Abcam	ab97959, RRID:AB_2341193	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Pax6	Abcam	ab5790, RRID:AB_305110	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Nestin	Santa Cruz Biotechnology	sc-23927, RRID:AB_627994	Primary Antibody; use as 1:50, 20 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-GFAP	Abcam	ab4674, RRID:AB_304558	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-S100β  conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab196442, RRID:AB_2722596	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution;
anti-TH	Abcam	ab75875, RRID:AB_1310786	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-Tuj 1	Abcam	ab78078, RRID:AB_2256751	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 594 goat anti-mouse IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11005) as secondary antibody.
anti-Synaptophysin	Abcam	ab32127, RRID:AB_2286949	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody.
anti-PSD-95	Abcam	ab2723, RRID:AB_303248	Primary Antibody; use as 1:100, 10 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 594 goat anti-chicken IgG (1:800, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11042) as secondary antibody.
anti-TFAM conjugated with Alexa Fluor 488	Abcam	ab198308	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2b  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-TOMM20 conjugated with Alexa Fluor 488	Santa Cruz Biotechnology	Cat# sc-17764 RRID:AB_628381	Primary Antibody; use as 1:400, 2.5 μL in 1000 μL staining solution; use mouse monoclonal IgG2a  Alexa Fluor® 488 as an isotype control.
anti-NDUFB10	Abcam	ab196019	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-SDHA	Abcam	ab137040	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution;  use Alexa Fluor ® 488 goat anti-rabbit IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11008) as secondary antibody; use rabbit monoclonal IgG as an isotype control.
anti-COX IV	Abcam	ab14744, RRID:AB_301443	Primary Antibody; use as 1:1000, 1 μL in 1000 μL staining solution; use  Alexa Fluor ® 488 goat anti-mouse IgG  (1:400, Thermo Fisher Scientific, Catalog # A-11001) as secondary antibody; use mouse monoclonal IgG as an isotype control.
Activin A	PeproTech	120-14E	Astrocyte differentiation medium ingredient
ABM Basal Medium	Lonza	CC-3187	Basal medium for astrocyte culture
AGM SingleQuots Supplement Pack	Lonza	CC-4123	Supplement for astrocyte culture
Antibiotic-Antimycotic	Thermo Fisher Scientific	15240062	CDM ingredient
Advanced DMEM/F-12	Thermo Fisher Scientific	12634010	Basal medium for dilute Geltrex
Bovine Serum Albumin	Europa Bioproducts	EQBAH62-1000	Blocking agent to prevent non-specific binding of antibodies in immunostaining assays and CDM ingredient
BDNF	PeproTech	450-02	DA neurons medium ingredient
B-27 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17504044	Astrocyte differentiation medium ingredient
BD Accuri C6 Plus Flow Cytometer	BD Biosciences, USA
Chemically Defined Lipid Concentrate	Thermo Fisher Scientific	11905031	CDM ingredient
Collagenase IV	Thermo Fisher Scientific	17104019	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
CCD Microscope Camera Leica DFC3000 G	Leica Microsystems, Germany
Corning non-treated culture dishes	Sigma-Aldrich	CLS430589	Suspension culture
DPBS	Thermo Fisher Scientific	14190250	Used for a variety of cell culture wash
DMEM/F-12, GlutaMAX supplement	Thermo Fisher Scientific	10565018	Astrocyte differentiation basal Medium
EDTA	Thermo Fisher Scientific	15575020	Reagent for gentle dissociation of human iPSCs
Essential 8 Basal Medium	Thermo Fisher Scientific	A1516901	Basal medium for iPSC culture
Essential 8 Supplement (50X)	Thermo Fisher Scientific	A1517101	Supplement for iPSC culture
EGF Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0314	Supplement for NSC culture
FGF-basic (AA 10–155) Recombinant Human Protein	Thermo Fisher Scientific	PHG0024	Supplement for NSC culture
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	12103C	Medium ingredient
FGF-basic	PeproTech	100-18B	Astrocyte differentiation medium ingredient
FCCP	Abcam	ab120081	Eliminates mitochondrial membrane potential and TMRE staining
Fluid aspiration system BVC control	Vacuubrand, Germany
Formaldehyde (PFA) 16%	Thermo Fisher Scientific	28908	Cell fixation
Geltrex	Thermo Fisher Scientific	A1413302	Used for attachment and maintenance of human iPSCs
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Supplement for NSC culture
GDNF	Peprotech	450-10	DA neurons medium ingredient
Glycine	Sigma-Aldrich	G8898	Used for blocking buffer
Ham's F-12 Nutrient Mix	Thermo Fisher Scientific	31765027	Basal medium for CDM
Heregulin beta-1 human	Sigma-Aldrich	SRP3055	Astrocyte differentiation medium ingredient
Hoechst 33342	Thermo Fisher Scientific	H1399	Stain the nuclei for confocal image
Heracell 150i CO2 Incubators	Fisher Scientific, USA
IMDM	Thermo Fisher Scientific	21980032	Basal medium for CDM
Insulin	Roche	1376497	CDM ingredient
InSolution AMPK Inhibitor	Sigma-Aldrich	171261	Neural induction medium ingredient
Insulin-like Growth Factor-I human	Sigma-Aldrich	I3769	Astrocyte differentiation medium ingredient
KnockOut DMEM/F-12 medium	Thermo Fisher Scientific	12660012	Basal medium for NSC culture
Laminin	Sigma-Aldrich	L2020	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Leica TCS SP8 STED confocal microscope	Leica Microsystems, Germany
Monothioglycerol	Sigma-Aldrich	M6145	CDM ingredient
MitoTracker Green FM	Thermo Fisher Scientific	M7514	Used for mitochondrial volume indicator
MitoSox Red	Thermo Fisher Scientific	M36008	Used for mitochondrial ROS indicator
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma-Aldrich	A7250	Neural induction medium ingredient
N-2 Supplement	Thermo Fisher Scientific	17502048	Astrocyte differentiation medium ingredient
Normal goat serum	Thermo Fisher Scientific	PCN5000	Used for blocking buffer
Orbital shakers - SSM1	Stuart Equipment, UK
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Poly-D-lysine hydrobromide	Sigma-Aldrich	P7405	Promotes attachment and growth of neural cells in vitro
Purmorphamine	STEMCELL Technologies	72204	Promotes DA neuron differentiation
ProLong Gold Antifade Mountant	Thermo Fisher Scientific	P36930	Mounting the coverslip for confocal image
PBS 1x	Thermo Fisher Scientific	18912014	Used for a variety of wash
Recombinant Human/Mouse FGF-8b Protein	R&D Systems	423-F8-025/CF	Promotes DA neuron differentiation
SB 431542	Tocris Bioscience	TB1614-GMP	Neural Induction Medium ingredient
StemPro Neural Supplement	Thermo Fisher Scientific	A10508-01	Supplement for NSCs culture
TrypLE Express Enzyme	Thermo Fisher Scientific	12604013	Cell dissociation reagent
Transferrin	Roche	652202	CDM ingredient
TRITON X-100	VWR International	9002-93-1	Used for cells permeabilization in immunostaining assays
TMRE	Abcam	ab113852	Used for mitochondrial membrane potential staining
Water Bath Jb Academy Basic Jba5 JBA5 Grant Instruments	Grant Instruments, USA