מדידת דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות באמצעות מיקרוסקופיה של תאים חיים

Summary

פרוטוקול זה נועד למדוד את הפרמטרים הדינמיים (בליטות, נסיגה, קפלים) של בליטות בקצה של תאים מתפשטים.

Abstract

ההתפתחות וההומיאוסטזיס של אורגניזמים רב-תאיים מסתמכים על רגולציה מתואמת של נדידת תאים. נדידת תאים היא אירוע חיוני בבנייה והתחדשות של רקמות, והיא קריטית בהתפתחות העוברית, בתגובות אימונולוגיות ובריפוי פצעים. דיסרגציה של תנועתיות התא תורמת להפרעות פתולוגיות, כגון דלקת כרונית וגרורות סרטן. נדידת תאים, פלישת רקמות, אקסון וצמיחת דנדריט יוזמות כולן עם בליטות של קצה התא בתיווך אקטין פילמור. כאן אנו מתארים שיטה פשוטה, יעילה וחוסכת זמן להדמיה וניתוח כמותי של דינמיקת בליטה בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מודדת תכונות נפרדות של דינמיקת קרום קצה התא, כגון בליטות, נסיגה וקפלים, וניתן להשתמש בה כדי להעריך כיצד מניפולציות של רגולטורים actin מפתח להשפיע על בליטות קצה התא בהקשרים מגוונים.

Introduction

הגירת תאים היא תהליך קריטי השולט בהתפתחות ובתפקוד של כל האורגניזמים החיים. נדידת תאים מתרחשת הן במצבים פיזיולוגיים, כגון עוברים, ריפוי פצעים ותגובה חיסונית, והן במצבים פתולוגיים, כגון גרורות סרטן ומחלות אוטואימוניות. למרות ההבדלים בסוגי התאים שלוקחים חלק באירועים נודדים שונים, כל אירועי תנועתיות התאים חולקים מנגנונים מולקולריים דומים, שנשמרו באבולוציה מפרוטוזואה ליונקים, וכוללים מנגנוני בקרה ציטו-שלדיים נפוצים שיכולים לחוש את הסביבה, להגיב לאותותים ולווסת את התנהגות התאים ^{בתגובה1}.

שלב ראשוני בנדידת תאים יכול להיות היווצרות של בליטות דינמיות מאוד בקצה המוביל של התא. מאחורי lamellipodium ניתן למצוא את lamella, אשר זוגות פועלים כדי myosin II בתיווך התכווצות ומתווך הידבקות למצע הבסיסי. Lamellipodia מושרה על ידי גירויים חוץ תאיים כגון גורמי גדילה, ציטוקינים, קולטני הידבקות תאים, מונעים על ידי פילמור actin, אשר מספק את הכוח הפיזי שדוחף את קרום הפלזמה ^{קדימה2,3}. חלבונים רבים מאותתים ומבניים היו מעורבים בכך; ביניהם הם Rho GTPases, אשר פועלים בתיאום עם אותות אחרים להפעלת חלבונים מווסת actin כגון קומפלקס Arp 2/3, חלבונים משפחתיים WASP, ובני משפחות פורמן וספיר ב lamellipodia2,4,5.

בנוסף פילמור אקטין, פעילות myosin II נדרשת ליצירת כוחות התכווצות ב lamellipodium ואת lamella הקדמי. התכווצויות אלה, המוגדרות גם כנסיגה בקצה התא, יכולות גם לנבוע מדה-פילמוריזציה של אקטין דנדריטי בפריפריה של התא והן קריטיות לפיתוח הקצה המוביל של lamellipodial ולאפשר לבלט לחוש את הגמישות של המטריצה החוץ-תאית ותאים אחרים ולקבוע את כיוון הנדידה6,7,8 . בליטות בקצה התא שאינן יכולות להיצמד למצע ייצרו קפלים של קרום היקפי, מבנים דמויי גיליון המופיעים על פני השטח הגחוניים של lamellipodia ו lamella ולנוע אחורה ביחס לכיוון הנדידה. כאשר הלמליפודיום אינו מתחבר למצע, נוצר מתחתיו למליפודיום אחורי ודוחף באופן מכני את הלאמליפודיום הראשון לכיוון פני השטח הגחוניים העליונים. חוטי האקטין בקפלים שבעבר היו מקבילים למצע הופכים כעת לאנכים לו, והרכישה ממוקמת כעת מעל למליפודיום המתקדם. ההמולה הנעה אחורה חוזרת לציטוסול ומייצגת מנגנון תאי למיחזור אקטין לאמליפודיאלי9,10.

כאן, אנו מתארים בדיקה למדידה של דינמיקת בליטה בקצה התא. בדיקת הבליטה משתמשת במיקרוסקופיית וידאו לשגות זמן כדי למדוד דינמיקת בליטה בקצה תא בודד במשך 10 דקות במהלך שלב ההתפשטות של התא. דינמיקת בליטה מנותחת על ידי יצירת kymographs מסרטים אלה. באופן עקרוני, קימוגרף מקנה נתונים כמותיים מפורטים של חלקיקים נעים בעלילה מרחבית כדי להניב הבנה איכותית של הדינמיקה של קצה התא. עוצמת החלקיק הנע מותווה עבור כל ערימות התמונה בזמן לעומת תרשים חלל, כאשר ציר ה- X וציר ה- Y מייצגים זמן ומרחק, ^{בהתאמה11}. שיטה זו משתמשת בניתוח קימוגרפיה ידני עם ImageJ כדי לקבל נתונים כמותיים מפורטים, המאפשרים אחזור מידע מסרטים ותמונות במקרה של יחס אות לרעש נמוך ו/או צפיפות תכונות גבוהה, וניתוח תמונות שנרכשו במיקרוסקופיית אור ניגודיות פאזה או באיכות תמונה ירודה.

בדיקת הדינמיקה של בליטה בקצה התא המתוארת כאן היא שיטה מהירה, פשוטה וחסכונית. ככזה, ומכיוון שהוא הוכח בקורלציה ישירה עם העברת ^{תאים11,12}, זה יכול לשמש כשיטה ראשונית לבדיקת דינמיקה של שלד cytoskeal מעורב תנועתיות התא לפני שתחליט לבצע שיטות תובעניות יותר משאבים. יתר על כן, הוא גם מאפשר מדידה כמותית של האופן שבו מניפולציות גנטיות (נוקאאוט, נוקאאוט או מבני הצלה) של חלבונים ציטוסקיליים משפיעים על הדינמיקה של השלד באמצעות פלטפורמה פשוטה. הבדיקה היא מודל מאלף לחקר הדינמיקה של השלד הציטוטי בהקשר של נדידת תאים ויכולה לשמש להבהרת המנגנונים והמולקולות שבבסיס תנועתיות התאים.

Protocol

כל השיטות המתוארות בפרוטוקול זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש (IACUC) של אוניברסיטת בר-אילן.

הערה: תיאור גרפי שלב אחר שלב של ההליך המתואר בסעיף זה מופיע באיור 1.

1. תרבות התא

הערה: התאים המשמשים בפרוטוקול הם פיברובלסטים עובריים של עכבר (MEFs) שנוצרו מ- E11.5-13.5 עוברים של עכברי C57BL/6 מסוג בר. MEFs ראשי נוצרו על פי פרוטוקול המעבדה ^{נסיכים13}. תאים מחמישה עוברים שונים חוברו יחד והונצחו על ידי זיהום עם וקטור רטרו-ויראלי המבטא אנטיגן T גדול SV40 ואחריו בחירה עם 4 mM Histidinol במשך 3 שבועות.

1. תאי תרבית בלוחות תרבית רקמות המכילים את מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco המכיל 1 גרם / L גלוקוז, 1% גלוטמין, 1% פניצילין-סטרפטומיצין, ו 10% סרום בקר עוברי (FBS) (ראה טבלת חומרים), בחממה לחה עם 5% _CO2 ב 37 °C (37 °FC).
2. תרבית את התאים עד למפגש של 90%-95% ותתפצל ביחס של 1:5 כל 2-3 ימים.

2. ציפוי צלחת תחתית זכוכית

הערה: ציפוי צלחת תחתון זכוכית צריך להתבצע במכסה המנוע תרבית הרקמות בתנאים סטריליים.

1. מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת HCl 1N במרכז צלחת זכוכית תחתונה (שולחן של חומרים) ודגור במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (RT).
   הערה: שלב זה נועד להסיר שאריות מהזכוכית שעלולות להפריע להדמיה מאוחר יותר.
2. לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS (שולחן של חומרים) כל אחד.
3. לדלל פיברונקטין (ראה טבלת חומרים) ל 10 מיקרוגרם / מ"ל ב 1x PBS. מוסיפים 200 μL של פתרון פיברונקטין מדולל למרכז הזכוכית של המנה. דגירה ב 37 °C ((אינקובטור תרבות רקמות) במשך 1 שעות.
   הערה: לחלופין, ניתן לדגור את המנה עם תחתית הזכוכית במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על משטח שטוח.
4. במהלך זמן הדגירה של ציפוי פיברונקטין, הכן פתרון 1% BSA (טבלת חומרים) ב- 1x PBS, סנן דרך 0.2 מיקרומטר, ודנטורה על ידי דגירה ב 70 °C (70 °F) במשך 30 דקות באמבט מים שחומם מראש.
5. לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה מצופה שלוש פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS כל אחד.
6. הוסף 2 מ"ל של פתרון BSA denatured למרכז הזכוכית ודגר במשך 1 שעה ב 37 °C (חממה תרבית רקמות).
   הערה: לחלופין, ניתן לדגור את המנה עם תחתית הזכוכית במהלך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על משטח שטוח.
7. לשטוף את צלחת הזכוכית התחתונה 3 פעמים עם 2 מ"ל של 1x PBS כל אחד.
   הערה: דגירה של מנות תחתית זכוכית עם פיברונקטין צריך להתבצע לפחות 1 שעות ב 37 °C (37 °F) כדי לצפות את פני השטח כראוי. זמן דגירה קצר יותר לא יכול לייצר ציפוי מתאים, וכתוצאה מכך, פנוטיפ התא לא יכול להיות קשור להפעלה integrin. שכבת ה-BSA אינה פעילה ולא תשפיע על דינמיקת הבליטה ונועדה לחסום אתרים פוטנציאליים חופשיים להידבקות תאים בלתי תלויה אינטגרין. ה- BSA חייב להיות denatured לפני הציפוי כדי למנוע ממנו גרימת אפופטוזיס התא, אשר יכול להשפיע על דינמיקה של קצה התא.

3. הכנת תאים להדמיה

1. 16 עד 18 שעות לפני הניסוי, צלחת התאים כדי להגיע 70%-80% מפגש ביום שלמחרת. עבור MEFs, צלחת 0.7 x ¹⁰⁶ תאים לכל צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ יום לפני ביצוע הניסוי.
   הערה: לניסוי בליטה מוצלח, חשוב שהתאים ישמשו במהלך שלב הגדילה הלוגריתמי שלהם. כדי להשיג זאת, תאים צריכים להגיע 70%-80% מפגש ביום הניסוי. צפיפות גבוהה יותר של תאים תגרום לזמן התפשטות ארוך יותר ו/או מכשול בהחזקה במהלך הניסוי.
2. ביום הניסוי, מוסיפים 2 מ"ל של תמיסת טריפסין (טבלת חומרים) לכל צלחת תרבית רקמות בקוטר 10 ס"מ ודוללים במשך 2-3 דקות בחממה של תרבית רקמות עד שהתאים מתנתקים. להשבית טריפסין על ידי הוספת 5 מ"ל של המדיום המלא.
3. לספור את התאים באמצעות hemocytometer צלחת 20,000 תאים ב 2 מ"ל של המדיום השלם על צלחת זכוכית התחתונה מצופה כנ"ל (סעיף 2).
   הערה: מספר התאים לציפוי תלוי בגודל ובסוג התאים. עבור תאים גדולים יותר או יותר, צלחת רק 10,000 תאים יש מספיק תאים להדמיה. חשוב לבחור תאים בודדים שאינם נוגעים כמגע בין תא לתא יכולים לשנות התנהגויות של הפצת תאים-מהותיים.
4. דגירה את הכלים התחתונים זכוכית עם תאים מצופים בחממה תרבית הרקמות במשך 15 דקות.
   הערה: במהלך שלב זה, תאים דבקים במצע הפיברונקטין ומתפשטים עליו. בעת מדידת בליטות במהלך התפשטות התא, יש לאפשר לתאים להתפשט במשך 15 דקות לאחר הציפוי ולפני ההדמיה. הדמיה יכולה להתבצע בתוך חלון זמן בין 15 דקות ל ~ 1 שעה לאחר ציפוי, ובכל מקרה, לפני התאים מתחילים לנדוד.

4. הגדרת מיקרוסקופ והדמיה

הערה: מערכות מיקרוסקופיות שונות של תאים חיים זמינות. המערכת המשמשת כאן היא מיקרוסקופ הפוך Leica AF6000 המצויד _{בפחמן דו} חמצני ויחידות חימום ומחובר למצלמת CMOS דיגיטלית ORCA-Flash 4.0 V2.

1. הפעל את יחידת החימום לפחות 1 שעות לפני הדמיה והגדר אותו ב 37 °C (50 °F).
2. הפעילו את יחידת הפחמן _{הדו-חמצני} לפחות 10 דקות לפני ההדמיה והגדירו אותה ב-5% _CO2.
3. הפעל את המיקרוסקופ, המצלמה והמחשב.
4. פתח את תוכנת רכישת המיקרוסקופ (ראה טבלת חומרים). בחר את התיקיה לשמירת תמונות שנלכדו והקלד שם קובץ. שמור כל סרט כקובץ חדש.
5. הגדר את ההגדלה בעדשה יבשה פי 40, ניגודיות פאזה. הגדר את מרווח הזמן על 5 שניות, משך הסרט הכולל 10 דקות.
6. לאחר 15 דקות דגירה של התאים מצופים, מניחים את צלחת הזכוכית התחתונה עם תאים דבוקים לתוך המתאם ולתקן אותו. הכנס את המתאם עם המנה לחריץ שלו בשלב המיקרוסקופ.
7. מורידים את כיסוי המנה ומניחים במקום זאת את מכסה הפחמן _{הדו-חמצני} . פתח את שסתום הפחמן הדו _חמצני .
   הערה: ודאו שכיסוי הפחמן _{הדו-חמצני} נקי לפני שאתם מניחים אותו על גבי המנה התחתונה מזכוכית. כיסוי מלוכלך יפחית את איכות הסרטים. נגב את החלק התחתון של מכסה _CO2 עם מגבון ללא מוך ספוג ב-70% אתנול להסרת אבק ולכלוך. יש לנגב בפעם השנייה עם מגבון יבש ללא מוך.
8. הצג את התאים ומצא תא מתאים להדמיה. ודא שהתא נמצא בפוקוס והתחל ברכישת סרטים.

5. ניתוח תמונה

הערה: ניתוח תמונה מתבצע באמצעות ImageJ (טבלת חומרים) כדלקמן:

1. פתח את הסרט שנרכש ב- ImageJ.
2. בעזרת הכלי ישר בסרגל הכלים הראשי, צור שמונה שורות של 20 יחידות שרירותיות כל אחת בניצב לבליטות, כולל ה-lamella וקצה התא, בסידור רדיאלי כל 45°, כפי שמוצג באיור 2A.
3. בסרגל הכלים הראשי, עבור אל תמונה > ערימות >. זה יניב תמונת קימוגרפיה, המתארת את התנועה של נקודות בודדות בתוך קרום התא (איור 2B). יש לבצע פעולה זו עבור כל שורה מתוך שמונה השורות בנפרד.
4. חלץ וספור ידנית מתמונות הקימוגרף המתאימות את מספר הבלטות, הנסיגה והקפלים בכל אחד משמונת האזורים בתא, המסומנים על-ידי קווי הרשת. מספרים אלה מייצגים את תדירות הבלטות, הנסיגה והקפלים לכל 10 דקות (איור 2C, D).
   הערה: ניתן להבחין בין קפלים למבנים אחרים בהתבסס על המראה הכהה שלהם במיקרוסקופיה ניגודית פאזה ותנועתם הצנטריפטלית, שמתחילה בקצה התא ומסתיימת בגבול גוף התא, אשר ניתן לראות בסרטים שנרכשו. שים לב, כאשר מכמתים בליטה, נסיגה ותדירות וולאנים, יש לראות בסרטים בקרה לכימות ובמיוחד להגדרת קפלים.
5. קבע את התמדה הבליטה, המרחק והמהירות על-ידי ניתוח קימוגרפיה. עבור כל אחת מהקימוגרפיות שנוצרו, ציר ה- X מייצג מרחק וציר ה- Y מייצג זמן.
6. כדי למדוד מרחק בליטה, בצע את השלבים 5.6.1-5.6.2.
   1. צייר קו מאונך מבסיס הבליטה לפסגה הגבוהה ביותר של הבליטה. הקש M ב- ImageJ כדי למדוד את אורך הקו בפיקסלים.
   2. להמרת האורך מפיקסלים למיקרומטר, ודאו שיחס הפיקסל למיקרומטר ידוע.
      הערה: יחס המיקרומטר לפיקסל הוא האורך הפיזי של פיקסל במצלמת CCD / הגדלה כוללת. גודל הפיקסלים אופייני לכל סוג של מצלמה. לדוגמה, עבור המצלמה המשמשת במחקר זה, גודל הפיקסלים הוא 6.5 מיקרומטר x 6.5 מיקרומטר, האורך הפיזי הוא 6.5 מיקרומטר וההגדלה בה השתמשנו היא 40x. לכן, יחס המיקרומטר לפיקסל של המצלמה שלנו הוא 0.1625 מיקרומטר /פיקסל. בניתוח, עבור קו באורך של 30 פיקסלים, מרחק הבליטה יהיה 30 פיקסלים x 0.1625 מיקרומטר / פיקסל = 4.875 מיקרומטר (איור 3).
7. כדי למדוד את זמן הבליטה (התמדה; משך הזמן שהבלטה מבלה בבליטה לפני החזרה), בצע את השלבים 5.7.1-5.7.2.
   1. צייר קו אופקי מתחילת הבליטה (משמאל לימין) לאזור הפסגה הגבוהה ביותר. הקש M ב- ImageJ כדי למדוד את אורך הקו בפיקסלים.
   2. להמרת האורך מפיקסלים לדקות, חשבו את יחס הפיקסל לדקה. ערך זה תלוי במרווח הזמן בין התמונות.
      הערה: בדוגמה זו, המרווח בין התמונות הוא 5 s, יחס המינימום/פיקסל הוא 0.0833 ואורך הקו האופקי הוא 8 פיקסלים. לכן, זמן הבליטה הוא 8 פיקסלים x 0.0833 דקה /פיקסל = 0.6664 דקה.
8. מדוד וחשב את זמן הנסיגה בדומה לזמן הבליטה עבור קו שצויר אופקית בבסיס הבליטה שממנו שיא הבליטה הוא לבסיסו מימין (קו X2 באיור 3).
9. חשב את מהירות הבליטה על-ידי חלוקת מרחק הבליטה לפי זמן בליטה. חשב את מהירות הנסיגה על-ידי חלוקת מרחק הבליטה על-ידי זמן נסיגה. בדוגמה זו, מהירות הבליטה מחושבת כ- 4.875 מיקרומטר / 0.6664 דקות = 7.315 מיקרומטר / דקה, ומהירות הנסיגה זהה מכיוון שהקו המייצג את הזמן הוא באותו אורך.
   הערה: בהשוואת סוגי תאים שונים, כלומר, תאים המבטאים סוג בר ומבנים מוטנטיים של אותו חלבון, חובה לבצע ניתוח עיוור, כך שלא תוכנס הטיה.

תוצאות

בניסוי המתואר באיור 2, MEFs מונצחים היו מצופים על כלים עם תחתית זכוכית מצופים מראש בפיברונקטין כדי להפעיל איתותים בתיווך אינטגרין, שנחסמו על ידי BSA מפוטר, כדי לחסום אתרים פוטנציאליים חופשיים להידבקות בתאים שאינם תלויים בהפעלה אינטגרית. כדי להגיע לשלב הצמיחה הלוגריתמי במפגש ?...

Discussion

דינמיקת בליטה בקצה התא, המורכבת מהבלטות, נסיגה וקפלים, היא גם תנאי מוקדם וגם אירוע פוטנציאלי להגבלת קצב בתנועתיות התאים. כאן אנו מתארים שיטה מהירה ופשוטה למדידת הדינמיקה של בליטות בקצה התא במהלך ההתפשטות. שיטה זו מאפשרת הדמיה לזמן קצר, מייצרת כמות משמעותית של נתונים, אינה דורשת תיוג פלואור...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A