生細胞顕微鏡による拡散時の細胞端突出ダイナミクスの測定

要約

このプロトコルは、広がる細胞の端にある突起の動的パラメータ(突起、収縮、フリル)を測定することを目的としています。

要約

多細胞生物の発生と恒常性は、細胞移動の協調的な調節に依存している。細胞遊走は、組織の構築および再生において不可欠な事象であり、胚発生、免疫学的応答、および創傷治癒において重要である。細胞運動性の調節不全は、慢性炎症および癌転移などの病理学的障害に寄与する。細胞遊走、組織浸潤、軸索、および樹状突起伸長はすべて、アクチン重合媒介性細胞縁突起で開始される。ここでは、拡散中の細胞端突起ダイナミクスのイメージングおよび定量分析のための、シンプルで効率的で時間を節約する方法について説明する。この方法は、突起、収縮、フリルなどの細胞端膜ダイナミクスの離散的な特徴を測定し、主要なアクチン調節因子の操作が多様な文脈で細胞縁突起にどのように影響するかを評価するために使用することができる。

概要

細胞移動は、すべての生物の発達と機能を制御する重要なプロセスです。細胞遊走は、胚発生、創傷治癒、免疫応答などの生理学的状態と、癌転移および自己免疫疾患などの病理学的状態の両方で起こる。異なる遊走事象に関与する細胞型の違いにもかかわらず、すべての細胞運動性事象は、原生動物から哺乳動物への進化において保存されてきた類似の分子機構を共有し、環境を感知し、シグナルに応答し、応答における細胞挙動を調節することができる共通の細胞骨格制御機構を含む¹。

細胞遊走の初期段階は、細胞の前縁における非常に動的な突起の形成であり得る。ラメリポジウムの背後には、アクチンをミオシンII媒介性収縮性に結合し、下層の基質への接着を媒介するラメラがある。ラメリポジアは、成長因子、サイトカイン、細胞接着受容体などの細胞外刺激によって誘導され、原形質膜を前方に押し出す物理的な力を提供するアクチン重合によって駆動されます^2,3。多くのシグナル伝達および構造タンパク質がこれに関与している。その中にはRho GTPaseがあり、これは他のシグナルと協調して作用し、Arp 2/3複合体、WASPファミリータンパク質、およびラメリポディア^のホルミンファミリーおよびスパイアファミリーのメンバーなどのアクチン調節タンパク質を活性化する^2,4,5。

アクチン重合に加えて、ミオシンII活性は、ラメリポジウムおよび前層に収縮力を発生させるために必要とされる。細胞縁収縮としても定義されるこれらの収縮は、細胞末梢における樹状アクチンの解重合からも生じ得、層状前縁を発達させ、突起が細胞外マトリックスおよび他の細胞の柔軟性を感知し、遊走の方向を決定することを可能にするために重要である^6,7,8.基材に付着できない細胞縁突起は、末梢膜フリル、層状および層状突起の腹面に現れ、遊走方向に対して後方に移動するシート状構造を形成する。ラメリポジウムが基板に付着しないと、後部ラメリポジウムがその下に形成され、機械的に第1のラメリポジウムを上腹面に向かって押し出す。以前は基質に平行であったフリルのアクチンフィラメントは、現在、基質に対して垂直になり、フリルは前進するラメリポジウムの上に配置されるようになった。後方に移動するフリルは細胞質ゾルに逆戻りし、層状体アクチンをリサイクルするための細胞機構を表しています^9,10。

ここで、細胞縁突起ダイナミクスの測定のためのアッセイについて説明する。突出アッセイは、タイムラプスビデオ顕微鏡を使用して、細胞の拡散期中に単一細胞エッジ突起ダイナミクスを10分間測定します。突起ダイナミクスは、これらの映画からキモグラフを生成することによって解析される。原理的には、キモグラフは、移動粒子の詳細な定量データを時空間プロットで付与し、細胞エッジダイナミクスの定性的理解をもたらす。移動する粒子の強度は、時間対空間プロットのすべての画像スタックに対してプロットされ、X軸とY軸はそれぞれ時間と距離を表します¹¹。ImageJによる手動キモグラフ解析により詳細な定量データを取得し、低信号対雑音比や高特徴密度の場合に動画や画像から情報を取得したり、位相コントラスト光顕微鏡で取得した画像や画質の悪さを解析したりすることができます。

本明細書に記載される細胞縁突起ダイナミクスアッセイは、迅速、単純、かつ費用対効果の高い方法である。このように、そして細胞遊走と直接相関することが示されているので¹¹、¹²、より資源の要求の厳しい方法を実行することを決定する前に^、細胞運動性に関与する細胞骨格ダイナミクスを試験するための予備的方法として使用することができる。さらに、細胞骨格タンパク質の遺伝子操作(ノックアウト、ノックダウン、またはレスキューコンストラクト)が細胞骨格ダイナミクスにどのように影響するかを、簡単なプラットフォームを使用して定量的に測定することもできます。このアッセイは、細胞遊走の文脈における細胞骨格ダイナミクスを探索するための有益なモデルであり、細胞運動性の根底にあるメカニズムおよび分子の解明に使用することができる。

プロトコル

このプロトコルに記載されているすべての方法は、バーイラン大学の機関動物ケアおよび使用委員会(IACUC)によって承認されています。

メモ: このセクションで説明する手順を段階的にグラフィカルに図 1 に示します。

1. 細胞培養

注:プロトコルで使用される細胞は、野生型C57BL/6マウスのE11.5-13.5胚から生成されたマウス胚性線維芽細胞(MEF)である。一次MEFは、ジャックス研究所のプロトコル¹³に従って生成されました。5つの異なる胚からの細胞を一緒にプールし、SV40ラージT抗原を発現するレトロウイルスベクターによる感染によって不死化し、続いて4mMヒスチジノールで3週間選択した。

1. 1 g/L グルコース、1% グルタミン、1% ペニシリン-ストレプトマイシン、および 10% ウシ胎児血清 (FBS) を含むダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) を含む組織培養プレート中の培養細胞 ( 材料表を参照) を、37 °C で 5% _CO2 で加湿したインキュベーター内で培養します。
2. 細胞を90%〜95%コンフルエントになるまで培養し、2〜3日ごとに1:5の比率で分割する。

2. ガラス底皿コーティング

注:ガラス底ディッシュコーティングは、滅菌条件下で組織培養フード内で行う必要があります。

1. ガラス底ディッシュ(材料表)の中央に2mLの1N HCl溶液を加え、室温(RT)で20分間インキュベートする。
   メモ:この段階は、後でイメージングを中断する可能性のあるガラスから残留物を除去するためのものです。
2. ガラス底の皿を、それぞれ2mLの1x PBS(材料表)で3回洗う。
3. フィブロネクチン( 材料表を参照)を1x PBSで10μg/mLに希釈する。希釈したフィブロネクチン溶液200μLをディッシュのガラス中心に加える。37°C(組織培養インキュベーター)で1時間インキュベートする。
   注:あるいは、ガラス底ディッシュを平らな表面上で4°Cで一晩インキュベートすることもできます。
4. フィブロネクチンコーティングのインキュベーション時間中に、1x PBS中の1%BSA(材料表)溶液を調製し、0.2μmのフィルターを通して濾過し、予め加温した水浴中で70°Cで30分間インキュベートすることによって変性させた。
5. コーティングされたガラス底の皿を、それぞれ2mLの1x PBSで3回洗浄する。
6. 変性BSA溶液2mLをガラス中心に加え、37°Cで1時間インキュベートする(組織培養インキュベーター)。
   注:あるいは、ガラス底ディッシュを平らな表面上で4°Cで一晩インキュベートすることもできます。
7. ガラス底の皿をそれぞれ2mLの1x PBSで3回洗う。
   注:ガラス底ディッシュとフィブロネクチンのインキュベーションは、表面を適切にコーティングするために37°Cで少なくとも1時間行う必要があります。より短いインキュベーション時間は、適切なコーティングを生じない可能性があり、その結果、細胞表現型はインテグリン活性化に関連しない可能性がある。BSA層は不活性であり、突起ダイナミクスに影響を及ぼさず、インテグリン非依存性細胞接着のための遊離電位部位をブロックすることを意味する。BSAは、細胞エッジダイナミクスに影響を与える可能性のある細胞アポトーシスを誘導するのを防ぐために、コーティング前に変性させる必要があります。

3. イメージング用細胞の作製

1. 実験の16〜18時間前に、翌日に70%〜80%コンフルエントに達するように細胞をプレート化する。MEFsについては、実験を行う前日に直径10cmの組織培養プレートあたり0.7 x ¹⁰⁶ 個のプレートを作製した。
   注:突起実験を成功させるためには、細胞が対数増殖期に使用されることが重要です。これを達成するために、細胞は実験の日に70%〜80%の合流点に達するべきである。細胞の密度が高いほど、実験中の拡散時間が長くなり、および/または付着の障害が生じる。
2. 実験当日、組織培養プレートに直径10cmあたり2mLのトリプシン溶液(材料表)を加え、細胞が剥離するまで組織培養インキュベーター内で2~3分間インキュベートした。5mLの完全培地を加えることによってトリプシンを不活性化する。
3. 血球計数器を用いて細胞を計数し、上記のようにコーティングしたガラス底ディッシュ上に2mLの完全培地中の20,000個の細胞をプレートする(セクション2)。
   注: プレーティング用のセル数は、セルのサイズとタイプによって異なります。より大きく、またはより広がった細胞の場合、イメージングに十分な細胞を持つように10,000個の細胞のみをプレートします。細胞同士の接触は細胞固有の拡散挙動を変える可能性があるため、接触しない単一の細胞を選ぶことが重要です。
4. 播種した細胞を含むガラス底ディッシュを組織培養インキュベーター内で15分間インキュベートする。
   注:この段階では、細胞はフィブロネクチン基質に接着し、その上に広がる。細胞拡散中の突起を測定する場合、細胞はプレーティング後およびイメージング前に15分間拡散させるべきである。イメージングは、めっき後15分~1時間の間の時間枠内、およびいずれの場合も、細胞が遊走を開始する前に行うことができる。

4. 顕微鏡のセットアップとイメージング

メモ: さまざまな生細胞顕微鏡システムが利用可能です。ここで使用されるシステムは、_CO2 と加熱ユニットを備えたLeica AF6000倒立顕微鏡で、ORCA-Flash 4.0 V2デジタルCMOSカメラに取り付けられています。

1. 撮影の1時間前までに加熱ユニットの電源を入れ、37°Cに設定してください。
2. イメージングの 10 分前までに CO2 ユニットの電源を入れ、_CO2 を 5% に設定し_{てください}。
3. 顕微鏡、カメラ、およびコンピュータの電源を入れます。
4. 顕微鏡取得ソフトウェアを開きます( 材料表を参照)。キャプチャした画像を保存するフォルダを選択し、ファイル名を入力します。すべてのムービーを新しいファイルとして保存します。
5. 40倍のドライレンズ、位相コントラストで倍率を設定します。時間間隔を5秒に設定し、合計ムービー時間10分に設定します。
6. 播種した細胞を15分間インキュベートした後、細胞が接着したガラス底ディッシュをアダプターに入れて固定する。皿の入ったアダプターを顕微鏡ステージのスロットに挿入します。
7. 食器カバーを外し、代わりに_CO2蓋を置きます。CO2バルブを開きます。
   メモ:CO2カバーをガラス底の皿の上に置く前に、_CO2カバーが清潔であることを確認してください。カバーが汚れていると、映画の品質が低下します。CO2蓋の下側を70%エタノールで浸した糸くずの出ない拭き取りで拭き取り、ほこりや汚れを取り除きます。糸くずの出ない乾いたワイプで2回目に拭きます。
8. 細胞を表示し、イメージングに適した細胞を見つけます。セルにピントが合っていることを確認し、ムービーの取得を開始します。

5. 画像解析

メモ: 画像解析は、次のように ImageJ (材料表) を使用して実行されます。

1. 取得したムービーを ImageJ で開きます。
2. メインツールバーの 直線 ツールを使用して、 図 2A に示すように、ラメラとセルのエッジを含む突起に対して垂直な 20 個の任意の単位の 8 本の線を 45 度ごとに放射状の配置で作成します。
3. メインツールバーで、[ 画像>スタック] > [再スライス] に移動します。これにより、細胞膜内の単一点の動きを記述するカイモグラフ画像が得られます(図2B)。このアクションは、8 行のうちすべての行に対して個別に実行する必要があります。
4. それぞれのキモグラフ画像から、グリッド線でマークされたセル内の8つの領域のそれぞれにおける突起、後退、およびフリルの数を抽出し、手動でカウントする。これらの数値は、10分あたりの突起、収縮、およびフリルの頻度を表す(図2C、D)。
   注:フリルは、位相差顕微鏡における暗い外観と、細胞の端から始まり、細胞体の境界で終わる求心運動に基づいて他の構造と区別することができ、これは取得したフィルムで観察することができる。注目すべきは、突起、後退、およびフリルの頻度を定量化する場合、定量化のためのコントロールとして、特にフリルを定義するための制御としてムービーを観察する必要があることです。
5. 突起の持続性、距離、速度をキモグラフィ解析によって決定します。生成された各キモグラフについて、X 軸は距離を表し、Y 軸は時間を表します。
6. 突起距離を測定するには、手順 5.6.1 ~ 5.6.2 に従います。
   1. 突起の基部から突起の最高峰まで垂線を引きます。ImageJ で M キーを押すと、線の長さがピクセル単位で測定されます。
   2. 長さをピクセルから μm に変換するには、ピクセルと μm の比率がわかっていることを確認します。
      注:μm対ピクセル比は、CCDカメラ上のピクセルの物理的な長さ/全倍率です。ピクセルサイズは、カメラの種類ごとに特徴的です。たとえば、この研究で使用したカメラの場合、ピクセルサイズは6.5μm x 6.5μm、物理的な長さは6.5μm、使用した倍率は40xです。したがって、当社のカメラのμm対ピクセル比は0.1625μm/ピクセルです。解析では、長さが30ピクセルの線の場合、突起距離は30ピクセル x 0.1625 μm/ピクセル = 4.875 μmになります(図3)。
7. 突起時間(持続性、突起が引っ込むまでに充てられる時間)を測定するには、手順5.7.1~5.7.2に従います。
   1. 突起の始点(左から右)から最高峰の領域までの水平線を描きます。ImageJ で M キーを押すと、線の長さがピクセル単位で測定されます。
   2. 長さをピクセルから分に変換するには、ピクセル対最小の比率を計算します。この値は、イメージ間の間隔によって異なります。
      メモ: この例では、画像間の間隔は 5 秒、分/ピクセル比は 0.0833、水平線の長さは 8 ピクセルです。したがって、突起時間は 8 ピクセル x 0.0833 分/ピクセル = 0.6664 分になります。
8. 突起のピークが右側の基部にあるところから突起の基部まで水平に引かれた線( 図3の線X2)の突起時間と同様に、引き込み時間を測定して計算します。
9. 突出距離を突起時間で割って突出速度を算出する。突起距離を後退時間で割って後退速度を計算します。この例では、突起速度は 4.875 μm/0.6664 分 = 7.315 μm/minと計算され、時間を表す線が同じ長さであるため、後退速度は同じです。
   注:異なる細胞型、すなわち、同じタンパク質の野生型および変異構築物を発現する細胞を比較する場合、盲検分析を行うことが不可欠であり、したがってバイアスが導入されない。

結果

図2に記載の実験では、不死化MEFをフィブロネクチンでプレコートしたガラス底皿にメッキしてインテグリン媒介シグナル伝達を活性化し、変性BSAによってブロックし、インテグリン活性化に依存しない細胞接着の遊離電位部位を遮断した。実験当日に細胞の70%〜80%コンフルエントで対数増殖期に達するために、0.7 x 106 MEFsを実験の¹⁶時間前に直径10 cmの組織培養?...

ディスカッション

突起、収縮、およびフリルからなる細胞端突起ダイナミクスは、細胞運動性の前提条件であり、潜在的な律速事象でもある。ここでは、拡散中の細胞エッジ突起のダイナミクスを測定するための迅速かつ簡単な方法について説明します。この方法は、短時間のイメージングを可能にし、大量のデータを生成し、細胞の蛍光標識や高価な蛍光顕微鏡装置を必要とせず、よりリソースのかかる方?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A