Medindo a dinâmica de saliência da borda celular durante a disseminação usando microscopia de células vivas

Resumo

Este protocolo visa medir os parâmetros dinâmicos (saliências, retrações, babados) de saliências na borda das células disseminar.

Resumo

O desenvolvimento e a homeostase dos organismos multicelulares dependem da regulação coordenada da migração celular. A migração celular é um evento essencial na construção e regeneração de tecidos, e é fundamental no desenvolvimento embrionário, respostas imunológicas e cicatrização de feridas. A desregulação da motilidade celular contribui para distúrbios patológicos, como inflamação crônica e metástase do câncer. Migração celular, invasão de tecido, axônio e dendrito superam tudo iniciado com saliências mediadas por células mediadas por actina. Aqui, descrevemos um método simples, eficiente e de economia de tempo para a imagem e análise quantitativa da dinâmica de saliência de borda celular durante a disseminação. Este método mede características discretas da dinâmica da membrana de borda celular, como saliências, retrações e babados, e pode ser usado para avaliar como as manipulações de principais reguladores de actina impactam as saliências de borda celular em diversos contextos.

Introdução

A migração celular é um processo crítico que controla o desenvolvimento e a função de todos os organismos vivos. A migração celular ocorre em ambas as condições fisiológicas, como embriogênese, cicatrização de feridas e resposta imune, e em condições patológicas, como metástase do câncer e doença autoimune. Apesar das diferenças nos tipos celulares que participam de diferentes eventos migratórios, todos os eventos de motilidade celular compartilham mecanismos moleculares semelhantes, que foram conservados na evolução do protozoário aos mamíferos, e envolvem mecanismos comuns de controle citoesquelético que podem sentir o ambiente, responder a sinais e modular o comportamento celular em ^resposta1.

Um estágio inicial na migração celular pode ser a formação de saliências altamente dinâmicas na borda principal da célula. Por trás do lamellipodium pode-se encontrar a lamella, que casais atuam na contratelidade mediada por Myosin II e media a adesão ao substrato subjacente. Lamellipodia são induzidas por estímulos extracelulares, como fatores de crescimento, citocinas e receptores de adesão celular e são impulsionadas pela polimerização de actina, que fornece a força física que empurra a membrana plasmática para ^frente2,3. Muitas sinalizações e proteínas estruturais foram implicadas nisso; entre eles estão rho GTPases, que atuam coordenadamente com outros sinais para ativar proteínas reguladoras de actina, como o complexo Arp 2/3, proteínas familiares WASP e membros das famílias Formin e Spire em lamellipodia2,4,5.

Além da polimerização de actina, a atividade de miose II é necessária para a geração de forças contratuais no lamellipodium e na lamella anterior. Essas contrações, também definidas como retrações de borda celular, também podem resultar da despolimerização da actina dendrítica na periferia celular e são fundamentais para o desenvolvimento da borda principal lamellipodial e permitindo que a protrusão sinta a flexibilidade da matriz extracelular e outras células e determine a direção da migração6,7,8 . As saliências de borda celular que não podem ser anexadas ao substrato formarão babados de membrana periférica, estruturas semelhantes a folhas que aparecem na superfície ventral de lamellipodia e lamella e se movem para trás em relação à direção da migração. Como o lamellipodium não se prende ao substrato, um lamellipodium posterior se forma por baixo dele e empurra mecanicamente o primeiro lamellipodium em direção à superfície ventral superior. Os filamentos de actin no babado que antes eram paralelos ao substrato agora se tornam perpendiculares a ele, e o babado está agora posicionado acima do lamellipodium avançando. O babado que se move para trás cai de volta no citosol e representa um mecanismo celular para reciclagem de atolopodial em ^9,10.

Aqui, descrevemos um ensaio para a medição da dinâmica de saliência de borda celular. O ensaio de saliência usa microscopia de vídeo de lapso de tempo para medir a dinâmica de saliência de borda única por 10 minutos durante a fase de disseminação da célula. A dinâmica da saliência é analisada gerando kymogramas a partir desses filmes. Em princípio, um kymograph transmite dados quantitativos detalhados de partículas móveis em uma trama esposteterna para produzir uma compreensão qualitativa da dinâmica das bordas celulares. A intensidade da partícula móvel é traçada para todas as pilhas de imagens em uma trama tempo versus espaço, onde o eixo X e o eixo Y representam tempo e distância, ^{respectivamente11}. Este método usa uma análise manual de kymógrafo com ImageJ para obter dados quantitativos detalhados, permitindo a recuperação de informações de filmes e imagens em caso de baixa relação sinal-ruído e/ou alta densidade de recursos, e a análise de imagens adquiridas em microscopia de luz de contraste de fase ou má qualidade da imagem.

O ensaio de saliência de borda celular descrito aqui é um método rápido, simples e econômico. Como tal, e porque tem sido mostrado correlacionar diretamente com a migração ^celular11,12, pode ser usado como um método preliminar para testar dinâmicas citoesqueletal envolvidas na motilidade celular antes de decidir realizar métodos mais exigentes de recursos. Além disso, também permite a medição quantitativa de como as manipulações genéticas (knockout, knockdown ou construtos de resgate) de proteínas citoesqueletal impactam a dinâmica citoesqueletal usando uma plataforma simples. O ensaio é um modelo instrutivo para explorar a dinâmica citoesquelético no contexto da migração celular e poderia ser usado para elucidação dos mecanismos e moléculas subjacentes à motilidade celular.

Protocolo

Todos os métodos descritos neste protocolo foram aprovados pelo Comitê institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade bar-ilan.

NOTA: Uma representação gráfica passo a passo do procedimento descrito nesta seção aparece na Figura 1.

1. Cultura celular

NOTA: As células utilizadas no protocolo são fibroblastos embrionários de camundongos (MEFs) que foram gerados a partir de embriões E11.5-13.5 de camundongos tipo selvagem C57BL/6. Os MEFs primários foram gerados de acordo com o protocolo do laboratório ^Jacks13. Células de cinco embriões diferentes foram agrupadas e imortalizadas por infecção com um vetor retroviral expressando antígeno T grande SV40 seguido de seleção com Histidinol de 4 mM por 3 semanas.

1. Células de cultura em placas de cultura tecidual contendo o Meio Águia Modificada (DMEM) de Dulbecco contendo 1 g/L de glicose, 1% glutamina, 1% penicilina-estreptomicina e 10% de soro bovino fetal (FBS) (ver Tabela de Materiais), em uma incubadora umidificada com 5% de _CO2 a 37 °C.
2. Cultume as células até 90%-95% de confluência e divida a uma proporção de 1:5 a cada 2-3 dias.

2. Revestimento de prato de fundo de vidro

NOTA: O revestimento do prato de fundo de vidro deve ser realizado na capa da cultura tecidual em condições estéreis.

1. Adicione 2 mL de solução de 1N HCl no centro de um prato de fundo de vidro (Tabela de Materiais) e incubar por 20 min a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: Este estágio destina-se a remover resíduos do vidro que podem interromper a imagem mais tarde.
2. Lave o prato de fundo de vidro três vezes com 2 mL de 1x PBS (Tabela de Materiais) cada.
3. Fibronectina diluída (ver Tabela de Materiais) a 10 μg/mL em 1x PBS. Adicione 200 μL da solução de fibronectina diluída ao centro de vidro do prato. Incubar a 37 °C (incubadora de cultura tecidual) por 1h.
   NOTA: Alternativamente, o prato de fundo de vidro pode ser incubado durante a noite a 4 °C em uma superfície plana.
4. Durante o tempo de incubação do revestimento da fibronectina, prepare 1% de solução BSA (Tabela de Materiais) em 1x PBS, filtre até 0,2 μm e desnaturar incubando a 70 °C por 30 min em um banho de água pré-aquecido.
5. Lave o prato revestido de fundo de vidro três vezes com 2 mL de 1x PBS cada.
6. Adicione 2 mL de solução BSA desnaturada ao centro de vidro e incubar por 1h a 37 °C (incubadora de cultura tecidual).
   NOTA: Alternativamente, o prato de fundo de vidro pode ser incubado durante a noite a 4 °C em uma superfície plana.
7. Lave o prato de fundo de vidro 3 vezes com 2 mL de 1x PBS cada.
   NOTA: A incubação de pratos de fundo de vidro com fibronectina deve ser realizada por pelo menos 1h a 37 °C para revestir a superfície corretamente. O menor tempo de incubação pode não produzir revestimento adequado e, como resultado, o fenótipo celular pode não estar relacionado à ativação do integrino. A camada BSA é inerte e não afetará a dinâmica de saliência e destina-se a bloquear locais potenciais livres para adesão celular independente da integrin. O BSA deve ser desnaturado antes do revestimento para evitar que induza a apoptose celular, que pode influenciar a dinâmica da borda celular.

3. Preparação de células para imagem

1. Dezesseis a dezoito horas antes do experimento, as células atingem 70%-80% de confluência no dia seguinte. Para MEFs, placa 0,7 x ¹⁰⁶ células por placa de cultura tecidual de 10 cm de diâmetro um dia antes de realizar o experimento.
   NOTA: Para um experimento de saliência bem-sucedido, é importante que as células sejam usadas durante sua fase de crescimento logarítmico. Para isso, as células devem atingir 70%-80% de confluência no dia do experimento. Uma maior densidade de células resultará em um tempo de propagação mais longo e/ou impedimento no apego durante o experimento.
2. No dia do experimento, adicione 2 mL de solução de trippsina (Tabela de Materiais) por placa de cultura tecidual de 10 cm de diâmetro e incubar por 2-3 min em uma incubadora de cultura tecidual até que as células se desprendem. Inativar trippsina adicionando 5 mL do meio completo.
3. Conte as células usando um hemótmetro e uma placa de 20.000 células em 2 mL do meio completo em um prato de fundo de vidro revestido como acima (seção 2).
   NOTA: O número de células para chapeamento depende do tamanho e tipo de células. Para células maiores ou mais espalhadas, a placa de apenas 10.000 células tem células suficientes para a imagem. É importante escolher células únicas que não tocam como contato célula-celular pode alterar comportamentos de disseminação celular-intrínseco.
4. Incubar os pratos de fundo de vidro com células banhadas na incubadora de cultura tecidual por 15 minutos.
   NOTA: Durante esta fase, as células aderem ao substrato de fibronectina e se espalham sobre ele. Ao medir saliências durante a disseminação celular, as células devem ser permitidas a se espalhar por 15 minutos após o revestimento e antes da imagem. A imagem pode ser realizada dentro de uma janela de tempo entre 15 min e ~1 h após o revestimento, e em qualquer caso, antes que as células comecem a migrar.

4. Configuração e imagem do microscópio

NOTA: Vários sistemas de microscopia de células vivas estão disponíveis. O sistema utilizado aqui é um microscópio invertido Leica AF6000 equipado com _CO2 e unidades de aquecimento e está conectado a uma câmera CMOS digital ORCA-Flash 4.0 V2.

1. Ligue a unidade de aquecimento pelo menos 1h antes da imagem e coloque-a a 37 °C.
2. Ligue a unidade de _CO2 pelo menos 10 minutos antes da imagem e coloque-a em 5% de _CO2.
3. Ligue o microscópio, a câmera e o computador.
4. Abra o software de aquisição de microscópio (ver Tabela de Materiais). Escolha a pasta para salvar imagens capturadas e digite um nome de arquivo. Salve cada filme como um novo arquivo.
5. Coloque a ampliação em uma lente seca de 40x, contraste de fase. Defina o intervalo de tempo em 5 s, duração total do filme 10 min.
6. Após a incubação de 15 minutos das células banhadas, coloque o prato de fundo de vidro com células aderidas no adaptador e fixe-o. Insira o adaptador com o prato em seu slot no estágio do microscópio.
7. Tire a tampa do prato e coloque a tampa de _CO2 em vez disso. Abra a válvula de _CO2 .
   NOTA: Certifique-se de que a tampa de _CO2 está limpa antes de colocá-la em cima do prato de fundo de vidro. Uma capa suja reduzirá a qualidade dos filmes. Limpe a parte inferior da tampa de _CO2 com um lenço sem fiapos encharcado com 70% de etanol para remover poeira e sujeira. Limpe uma segunda vez com um lenço seco sem fiapos.
8. Veja as células e encontre uma célula apropriada para imagens. Certifique-se de que a célula está em foco e comece a aquisição de filmes.

5. Análise de imagem

NOTA: A análise da imagem é realizada utilizando-se ImageJ (Tabela de Materiais) como seguinte:

1. Abra o filme adquirido em ImageJ.
2. Utilizando a ferramenta Reta na barra de ferramentas principal, faça oito linhas de 20 unidades arbitrárias cada perpendicular às saliências, incluindo a lamella e a borda da célula, em um arranjo radial a cada 45°, como mostrado na Figura 2A.
3. Na barra de ferramentas principal, vá para Image > Stacks > Reslice. Isso produzirá uma imagem de kymógrafo, que descreve o movimento de pontos únicos dentro da membrana celular (Figura 2B). Esta ação deve ser realizada para cada linha fora das oito linhas separadamente.
4. Extrair e contar manualmente a partir das respectivas imagens de kymógrafo o número de saliências, retrações e babados em cada uma das oito regiões da célula, marcadas pelas linhas de grade. Esses números representam a frequência de saliências, retrações e babados por 10 minutos (Figura 2C, D).
   NOTA: Os babados podem ser distinguidos de outras estruturas baseadas em sua aparência escura na microscopia de contraste de fase e seu movimento centrípeto, que começa na borda celular e termina na borda do corpo celular, o que pode ser observado nos filmes adquiridos. Note-se que, ao quantificar a saliência, a retração e a frequência do babado, os filmes devem ser observados como um controle para quantificação e especialmente para a definição de babados.
5. Determine a persistência de saliência, distância e velocidade por meio da análise da kymografia. Para cada um dos kymógrafos gerados, o eixo X representa a distância, e o eixo Y representa o tempo.
6. Para medir a distância de saliência, siga os passos 5.6.1-5.6.2.
   1. Desenhe uma linha perpendicular da base da saliência até o pico mais alto da saliência. Pressione M em ImageJ para medir o comprimento da linha em pixels.
   2. Para converter o comprimento dos pixels em μm, certifique-se de que a relação pixel para μm seja conhecida.
      NOTA: A relação μm/pixel é o comprimento físico de um pixel na câmera CCD / ampliação total. O tamanho do pixel é característico de cada tipo de câmera. Por exemplo, para a câmera usada neste estudo, o tamanho do pixel é de 6,5 μm x 6,5 μm, o comprimento físico é de 6,5 μm e a ampliação que usamos é de 40x. Portanto, a proporção μm para pixel da nossa câmera é de 0,1625 μm/pixel. Na análise, para uma linha no comprimento de 30 pixels, a distância de saliência seria de 30 pixels x 0,1625 μm/pixel = 4.875 μm (Figura 3).
7. Para medir o tempo de saliência (persistência; a quantidade de tempo que uma saliência passa se projetando antes de se retrair), siga os passos 5.7.1-5.7.2.
   1. Desenhe uma linha horizontal desde o início da saliência (da esquerda para a direita) até a região do pico mais alto. Pressione M em ImageJ para medir o comprimento da linha em pixels.
   2. Para converter o comprimento de pixels em minutos, calcule a relação pixel a min. Esse valor depende do intervalo entre as imagens.
      NOTA: Neste exemplo, o intervalo entre as imagens é de 5 s, a relação min/pixel é de 0,0833, e o comprimento da linha horizontal é de 8 pixels. Portanto, o tempo de saliência é de 8 pixels x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.
8. Meça e calcule o tempo de retração de forma semelhante ao tempo de saliência para uma linha desenhada horizontalmente na base da saliência de onde o pico da saliência é a sua base à direita (linha X2 na Figura 3).
9. Calcule a velocidade de saliência dividindo a distância de saliência por tempo de saliência. Calcule a velocidade de retração dividindo a distância de saliência por tempo de retração. Neste exemplo, a velocidade de saliência é calculada como 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min., e a velocidade de retração é idêntica porque a linha que representa o tempo é do mesmo comprimento.
   NOTA: Ao comparar diferentes tipos celulares, ou seja, células expressas tipo selvagem e construções mutantes da mesma proteína, é imperativo realizar uma análise cega, de modo que nenhum viés é introduzido.

Resultados

No experimento descrito na Figura 2, MEFs imortalizados foram banhados em pratos de fundo de vidro pré-revestidos com fibronectina para ativar sinalização mediada por integrin, bloqueada pela BSA desnaturada, para bloquear locais potenciais livres para adesão celular que não depende da ativação do integrin. Para chegar à fase de crescimento logarítmico a 70%-80% de confluência de células no dia do experimento, 0,7 x ¹⁰⁶ MEFs foram emplacados em uma placa de cultura teci...

Discussão

A dinâmica de saliência de borda celular, composta por saliências, retrações e babados, é um pré-requisito e um evento potencial limitante de taxas na motilidade celular. Aqui descrevemos um método rápido e simples para medir a dinâmica das saliências de borda celular durante a disseminação. Este método permite imagens de curto prazo, gera uma quantidade significativa de dados, não requer rotulagem fluorescente de células ou equipamentos de microscopia fluorescente caros, e poderia ser usado como um méto...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A