Canlı Hücre Mikroskobu ile Yayılma Sırasında Hücre-Kenar Çıkıntı Dinamiğinin Ölçülmesi

Özet

Bu protokol, yayılan hücrelerin kenarındaki çıkıntıların dinamik parametrelerini (çıkıntılar, geri çekmeler, fırfırlar) ölçmeyi amaçlamaktadır.

Özet

Çok hücreli organizmaların gelişimi ve homeostazı, hücre göçünün koordineli bir şekilde düzenlenmesine dayanır. Hücre göçü, dokuların yapımında ve yenilenmesinde önemli bir olaydır ve embriyonik gelişimde, immünolojik yanıtlarda ve yara iyileşmesinde kritik öneme sahiptir. Hücre hareketliliğinin düzensizliği, kronik inflamasyon ve kanser metastazı gibi patolojik bozukluklara katkıda bulunur. Hücre göçü, doku invazyonu, akson ve dendrit büyümesi, aktin polimerizasyonu aracılı hücre kenarı çıkıntıları ile başlar. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin görüntülenmesi ve kantitatif analizi için basit, verimli, zaman kazandıran bir yöntem açıklanmaktadır. Bu yöntem, çıkıntılar, geri çekmeler ve fırfırlar gibi hücre kenarı membran dinamiklerinin ayrık özelliklerini ölçer ve anahtar aktin düzenleyicilerinin manipülasyonlarının çeşitli bağlamlarda hücre kenarı çıkıntılarını nasıl etkilediğini değerlendirmek için kullanılabilir.

Giriş

Hücre göçü, tüm canlı organizmaların gelişimini ve işlevini kontrol eden kritik bir süreçtir. Hücre göçü hem embriyogenez, yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkisi gibi fizyolojik durumlarda hem de kanser metastazı ve otoimmün hastalık gibi patolojik durumlarda ortaya çıkar. Farklı göç olaylarında yer alan hücre tiplerindeki farklılıklara rağmen, tüm hücre hareketlilik olayları, protozoalardan memelilere evrimde korunmuş olan benzer moleküler mekanizmaları paylaşır ve çevreyi algılayabilen, sinyallere yanıt verebilen ve yanıt olarak hücre davranışını modüle edebilen ortak hücre iskeleti kontrol mekanizmalarını ^içerir1.

Hücre göçünde ilk aşama, hücrenin ön kenarında oldukça dinamik çıkıntıların oluşumu olabilir. Lamellipodyumun arkasında, aktin'i miyozin II aracılı kontraktiliteye bağlayan ve altta yatan substrata yapışmaya aracılık eden lamel bulunabilir. Lamellipodia, büyüme faktörleri, sitokinler ve hücre adezyon reseptörleri gibi hücre dışı uyaranlar tarafından indüklenir ve plazma zarını ileriye doğru iten fiziksel kuvveti sağlayan aktin polimerizasyonu tarafından tahrik ^edilir2,3. Birçok sinyal ve yapısal protein buna dahil edilmiştir; Bunlar arasında, Arp 2/3 kompleksi, WASP ailesi proteinleri ve lamellipodia2,4,5'teki Formin ve Spire ailelerinin üyeleri gibi aktin düzenleyici proteinleri aktive etmek için diğer sinyallerle koordineli olarak hareket eden Rho GTPazlar bulunmaktadır.

Aktin polimerizasyonuna ek olarak, lamellipodyum ve anterior lamelde kontraktil kuvvetler üretmek için miyozin II aktivitesi gereklidir. Hücre kenarı retraksiyonları olarak da tanımlanan bu kasılmalar, hücre periferinde dendritik aktinin depolimerizasyonundan da kaynaklanabilir ve lamellipodial ön kenarı geliştirmek ve çıkıntının hücre dışı matrisin ve diğer hücrelerin esnekliğini algılamasına ve göç yönünü belirlemesine izin vermek için kritik öneme ^{sahiptir6,7,8} . Substrata yapışamayan hücre kenarı çıkıntıları, periferik membran fırfırları, lamellipodia ve lamelin ventral yüzeyinde görünen tabaka benzeri yapılar oluşturacak ve göç yönüne göre geriye doğru hareket edecektir. Lamellipodyum substrata yapışamadığından, altında bir posterior lamellipodyum oluşur ve ilk lamellipodyumu mekanik olarak üst ventral yüzeye doğru iter. Daha önce substrata paralel olan fırfırdaki aktin filamentleri şimdi ona dik hale gelir ve fırfır şimdi ilerleyen lamellipodyumun üzerine yerleştirilir. Geriye doğru hareket eden fırfır, sitosol içine geri düşer ve lamellipodial aktinin geri dönüşümü için hücresel bir mekanizmayı temsil ^eder9,10.

Burada, hücre kenarı çıkıntı dinamiklerinin ölçümü için bir tahlil açıklıyoruz. Çıkıntı testi, hücrenin yayılma aşamasında 10 dakika boyunca tek hücre kenarı çıkıntı dinamiklerini ölçmek için hızlandırılmış video mikroskopisi kullanır. Çıkıntı dinamikleri, bu filmlerden kimografiler üretilerek analiz edilir. Prensip olarak, bir kimograf, hücre kenarı dinamiklerinin nitel bir anlayışını sağlamak için uzaysal zamansal bir grafikte hareketli parçacıkların ayrıntılı nicel verilerini verir. Hareketli parçacığın yoğunluğu, X ekseni ve Y ekseninin sırasıyla zaman ve mesafeyi temsil ettiği bir zamana karşı uzay grafiğindeki tüm görüntü yığınları için ^çizilir11. Bu yöntem, ayrıntılı nicel veriler elde etmek için ImageJ ile manuel bir kimograf analizi kullanır, düşük sinyal-gürültü oranı ve / veya yüksek özellik yoğunluğu durumunda filmlerden ve görüntülerden bilgi alınmasını ve faz kontrastlı ışık mikroskobu veya düşük görüntü kalitesinde elde edilen görüntülerin analizini sağlar.

Burada açıklanan hücre kenarı çıkıntı dinamiği testi hızlı, basit ve uygun maliyetli bir yöntemdir. Bu nedenle ve hücre göçü ile doğrudan ilişkili olduğu ^{gösterildiğinden11,12,} daha fazla kaynak gerektiren yöntemler gerçekleştirmeye karar vermeden önce hücre hareketliliğinde yer alan sitoiskelet dinamiklerini test etmek için bir ön yöntem olarak kullanılabilir. Ayrıca, sitoiskelet proteinlerinin genetik manipülasyonlarının (nakavt, nakavt veya kurtarma yapıları) basit bir platform kullanarak sitoiskelet dinamiklerini nasıl etkilediğinin nicel ölçümünü de sağlar. Tahlil, hücre göçü bağlamında sitoiskelet dinamiklerini araştırmak için öğretici bir modeldir ve hücre hareketliliğinin altında yatan mekanizmaların ve moleküllerin aydınlatılması için kullanılabilir.

Protokol

Bu protokolde açıklanan tüm yöntemler, Bar-Ilan Üniversitesi kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Bu bölümde açıklanan yordamın adım adım grafiksel gösterimi Şekil 1'de görülmektedir.

1. Hücre kültürü

NOT: Protokolde kullanılan hücreler, vahşi tip C57BL / 6 farelerin E11.5-13.5 embriyolarından üretilen fare embriyonik fibroblastlarıdır (MEF'ler). Birincil MEF'ler Jacks laboratuvar protokolüne göre ^{oluşturulmuştur13}. Beş farklı embriyodan elde edilen hücreler bir araya getirildi ve SV40 büyük T antijenini eksprese eden retroviral bir vektör ile enfeksiyon ile ölümsüzleştirildi ve ardından 3 hafta boyunca 4 mM Histidinol ile seçildi.

1. 1 g / L glikoz,% 1 glutamin,% 1 penisilin-streptomisin ve% 10 fetal sığır serumu (FBS) içeren Dulbecco'nun Modifiye Kartal Ortamını (DMEM) içeren doku kültürü plakalarındaki kültür hücreleri (bakınız Malzeme Tablosu), 37 ° C'de% 5 _CO2 ile nemlendirilmiş bir inkübatörde.
2. Hücreleri% 90-95 akıcılığa kadar kültürleyin ve her 2-3 günde bir 1: 5 oranında bölün.

2. Cam tabanlı çanak kaplama

NOT: Cam tabanlı çanak kaplama, doku kültürü davlumbazında steril koşullarda yapılmalıdır.

1. Cam tabanlı bir kabın ortasına 2 mL 1N HCl çözeltisi ekleyin (Malzeme Tablosu) ve oda sıcaklığında (RT) 20 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Bu aşama, daha sonra görüntülemeyi kesintiye uğratabilecek kalıntıları camdan uzaklaştırmak içindir.
2. Cam tabanlı kabı her biri 2 mL 1x PBS (Malzeme Tablosu) ile üç kez yıkayın.
3. Fibronektini (bakınız Malzeme Tablosu) 1x PBS'de 10 μg / mL'ye seyreltin. Seyreltilmiş fibronektin çözeltisinin 200 μL'sini kabın cam merkezine ekleyin. 1 saat boyunca 37 °C'de (doku kültürü inkübatörü) inkübe edin.
   NOT: Alternatif olarak, cam tabanlı çanak düz bir yüzeyde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilebilir.
4. Fibronektin kaplama inkübasyon süresi boyunca, 1x PBS'de% 1 BSA (Malzeme Tablosu) çözeltisi hazırlayın, 0,2 μm'den süzün ve önceden ısıtılmış bir su banyosunda 30 dakika boyunca 70 ° C'de inkübe ederek denatüre edin.
5. Kaplamalı cam tabanlı kabı her biri 2 mL 1x PBS ile üç kez yıkayın.
6. Cam merkeze 2 mL denatüre BSA çözeltisi ekleyin ve 37 ° C'de 1 saat inkübe edin (doku kültürü inkübatörü).
   NOT: Alternatif olarak, cam tabanlı çanak düz bir yüzeyde 4 ° C'de gece boyunca inkübe edilebilir.
7. Cam tabanlı kabı her biri 2 mL 1x PBS ile 3 kez yıkayın.
   NOT: Cam tabanlı tabakların fibronektin ile inkübasyonu, yüzeyi düzgün bir şekilde kaplamak için 37 ° C'de en az 1 saat boyunca yapılmalıdır. Daha kısa inkübasyon süresi uygun kaplama üretmeyebilir ve sonuç olarak, hücre fenotipi integrin aktivasyonu ile ilişkili olmayabilir. BSA tabakası inerttir ve çıkıntı dinamiklerini etkilemez ve integrinden bağımsız hücre yapışması için serbest potansiyel bölgeleri bloke etmek içindir. BSA, hücre kenarı dinamiklerini etkileyebilecek hücre apoptozunu indüklemesini önlemek için kaplamadan önce denatüre edilmelidir.

3. Görüntüleme için hücrelerin hazırlanması

1. Deneyden on altı ila on sekiz saat önce, ertesi gün% 70 -% 80 birleşime ulaşmak için hücreleri plakalayın. MEF'ler için, deneyi gerçekleştirmeden bir gün önce 10 cm çapında doku kültürü plakası başına 0.7 x ¹⁰⁶ hücre plakası.
   NOT: Başarılı bir çıkıntı deneyi için, hücrelerin logaritmik büyüme fazları sırasında kullanılması önemlidir. Bunu başarmak için, hücreler deney gününde% 70 -% 80 birleşme noktasına ulaşmalıdır. Daha yüksek bir hücre yoğunluğu, deney sırasında daha uzun bir yayılma süresine ve / veya bağlanmada engele neden olacaktır.
2. Deney gününde, 10 cm çapında doku kültürü plakası başına 2 mL tripsin çözeltisi (Malzeme Tablosu) ekleyin ve hücreler ayrılana kadar bir doku kültürü inkübatöründe 2-3 dakika inkübe edin. Tam ortamın 5 mL'sini ekleyerek tripsini devre dışı bırakın.
3. Bir hemositometre kullanarak hücreleri sayın ve yukarıdaki gibi kaplanmış cam tabanlı bir tabakta tam ortamın 2 mL'sinde 20.000 hücre tabak yapın (bölüm 2).
   NOT: Kaplama için hücre sayısı, hücrelerin boyutuna ve türüne bağlıdır. Daha büyük veya daha fazla yayılmış hücre için, görüntüleme için yeterli hücreye sahip olmak için sadece 10.000 hücreyi plakalayın. Hücreden hücreye temas, hücreye özgü yayılma davranışlarını değiştirebileceğinden, dokunmayan tek hücreleri seçmek önemlidir.
4. Cam tabanlı tabakları doku kültürü inkübatöründe kaplanmış hücrelerle 15 dakika boyunca inkübe edin.
   NOT: Bu aşamada, hücreler fibronektin substratına yapışır ve üzerine yayılır. Hücre yayılımı sırasında çıkıntıları ölçerken, hücrelerin kaplamadan sonra ve görüntülemeden önce 15 dakika boyunca yayılmasına izin verilmelidir. Görüntüleme, kaplamadan sonra 15 dakika ila ~ 1 saat arasında bir zaman aralığında ve her durumda, hücreler göç etmeye başlamadan önce gerçekleştirilebilir.

4. Mikroskop kurulumu ve görüntüleme

NOT: Çeşitli canlı hücre mikroskopi sistemleri mevcuttur. Burada kullanılan sistem, CO2 ve ısıtma üniteleri ile donatılmış bir Leica AF6000 ters mikroskoptur ve bir ORCA-Flash 4.0 _V2 dijital CMOS kameraya takılıdır.

1. Isıtma ünitesini görüntülemeden en az 1 saat önce açın ve 37 °C'ye ayarlayın.
2. CO2 ünitesini görüntülemeden en az 10 dakika önce açın ve %5 _CO2'ye ayarlayın.
3. Mikroskop, kamera ve bilgisayarı açın.
4. Mikroskop edinme yazılımını açın (bkz. Yakalanan görüntülerin kaydedileceği klasörü seçin ve bir dosya adı yazın. Her filmi yeni bir dosya olarak kaydedin.
5. Büyütmeyi 40x kuru lens, faz kontrastlı olarak ayarlayın. Zaman aralığını 5 sn, toplam film süresi 10 dakika olarak ayarlayın.
6. Kaplanmış hücrelerin 15 dakikalık inkübasyonundan sonra, yapıştırılmış hücrelere sahip cam tabanlı kabı adaptöre yerleştirin ve sabitleyin. Adaptörü çanak ile mikroskop aşamasındaki yuvasına yerleştirin.
7. Çanak kapağını çıkarın ve yerine _CO2 kapağını yerleştirin. _CO2 vanasını açın.
   NOT: _CO2 kapağını cam tabanlı kabın üstüne yerleştirmeden önce temiz olduğundan emin olun. Kirli bir kapak filmlerin kalitesini düşürecektir. CO2 kapağının alt tarafını, toz ve kiri temizlemek için %70 etanol ile ıslatılmış tüy bırakmayan bir mendille silin. Tüy bırakmayan kuru bir mendille ikinci kez silin.
8. Hücreleri görüntüleyin ve görüntüleme için uygun bir hücre bulun. Hücrenin odakta olduğundan emin olun ve film alımını başlatın.

5. Görüntü analizi

NOT: Görüntü analizi, aşağıdaki gibi ImageJ (Malzeme Tablosu) kullanılarak gerçekleştirilir:

1. Alınan filmi ImageJ'de açın.
2. Ana araç çubuğundaki Düz aracı kullanarak, Şekil 2A'da gösterildiği gibi, her 45°'de bir radyal düzenlemede, lamel ve hücre kenarı da dahil olmak üzere çıkıntılara dik 20 rasgele birimden oluşan sekiz satır oluşturun.
3. Ana araç çubuğunda, Görüntü > Yığınları > Reslice'a gidin. Bu, hücre zarı içindeki tek noktaların hareketini tanımlayan bir kimograf resmi verecektir (Şekil 2B). Bu eylem, sekiz satırdan her satır için ayrı ayrı gerçekleştirilmelidir.
4. İlgili kimograf görüntülerinden ızgara çizgileriyle işaretlenmiş hücredeki sekiz bölgenin her birindeki çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sayısını ayıklayın ve manuel olarak sayın. Bu sayılar 10 dakikada çıkıntılar, geri çekilmeler ve fırfırlar sıklığını temsil eder (Şekil 2C, D).
   NOT: Fırfırlar, faz kontrastlı mikroskopideki karanlık görünümlerine ve hücre kenarında başlayıp hücre gövdesinin sınırında sona eren ve elde edilen filmlerde gözlemlenebilen merkezcil hareketlerine dayanarak diğer yapılardan ayırt edilebilir. Dikkat edilmesi gereken, çıkıntı, geri çekilme ve karıştırma sıklığını ölçerken, filmler nicelleştirme ve özellikle fırfırları tanımlamak için bir kontrol olarak gözlemlenmelidir.
5. Kimografi analizi ile çıkıntı kalıcılığını, mesafesini ve hızını belirleyin. Oluşturulan kimografların her biri için, X ekseni mesafeyi ve Y ekseni zamanı temsil eder.
6. Çıkıntı mesafesini ölçmek için 5.6.1-5.6.2 adımlarını izleyin.
   1. Çıkıntının tabanından çıkıntının en yüksek zirvesine dik bir çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek için ImageJ'de M düğmesine basın.
   2. Uzunluğu piksellerden μm'ye dönüştürmek için piksel-μm oranının bilindiğinden emin olun.
      NOT: μm-piksel oranı, CCD kameradaki bir pikselin fiziksel uzunluğu / toplam büyütmedir. Piksel boyutu her kamera türünün karakteristiğidir. Örneğin, bu çalışmada kullanılan kamera için piksel boyutu 6,5 μm x 6,5 μm, fiziksel uzunluk 6,5 μm ve kullandığımız büyütme 40x'tir. Bu nedenle, kameramızın μm / piksel oranı 0.1625 μm / pikseldir. Analizde, 30 piksel uzunluğundaki bir çizgi için çıkıntı mesafesi 30 piksel x 0.1625 μm / piksel = 4.875 μm olacaktır (Şekil 3).
7. Çıkıntı süresini ölçmek için (kalıcılık; bir çıkıntının geri çekilmeden önce çıkıntı yapmak için harcadığı süre), 5.7.1-5.7.2 adımlarını izleyin.
   1. Çıkıntının başlangıcından (soldan sağa) en yüksek tepe bölgesine yatay bir çizgi çizin. Çizginin uzunluğunu piksel cinsinden ölçmek için ImageJ'de M düğmesine basın.
   2. Uzunluğu piksellerden dakikalara dönüştürmek için piksel-minimum oranını hesaplayın. Bu değer, görüntüler arasındaki aralığa bağlıdır.
      NOT: Bu örnekte, görüntüler arasındaki aralık 5 sn, min/piksel oranı 0,0833 ve yatay çizgi uzunluğu 8 pikseldir. Bu nedenle, çıkıntı süresi 8 piksel x 0.0833 dakika / piksel = 0.6664 dakikadır.
8. Geri çekilme süresini, çıkıntının tepesinin sağdaki tabanına olduğu yerden çıkıntının tabanına yatay olarak çizilen bir çizgi için çıkıntı süresine benzer şekilde ölçün ve hesaplayın ( Şekil 3'teki X2 çizgisi).
9. Çıkıntı mesafesini çıkıntı süresine bölerek çıkıntı hızını hesaplayın. Çıkıntı mesafesini geri çekme süresine bölerek geri çekme hızını hesaplayın. Bu örnekte, çıkıntı hızı 4.875 μm / 0.6664 dakika = 7.315 μm / dak. olarak hesaplanır ve zamanı temsil eden çizgi aynı uzunlukta olduğu için geri çekme hızı aynıdır.
   NOT: Farklı hücre tiplerini, yani aynı proteinin vahşi tipini ve mutant yapılarını ifade eden hücreleri karşılaştırırken, kör bir analiz yapmak zorunludur, bu nedenle önyargı ortaya çıkmaz.

Sonuçlar

Şekil 2'de açıklanan deneyde, ölümsüzleştirilmiş MEF'ler, integrin aktivasyonuna bağlı olmayan hücre yapışması için serbest potansiyel bölgeleri bloke etmek için denatüre BSA tarafından bloke edilen integrin aracılı sinyallemeyi aktive etmek için fibronektin ile önceden kaplanmış cam tabanlı tabaklar üzerine kaplanmıştır. Deney günü hücrelerin %70-%80 birleşmesinde logaritmik büyüme evresine ulaşmak için, deneyden 16 saat önce 10 cm çapında bir doku k...

Tartışmalar

Çıkıntılar, retraksiyonlar ve fırfırlardan oluşan hücre kenarı çıkıntı dinamikleri, hücre hareketliliğinde hem bir ön koşul hem de potansiyel bir hız sınırlayıcı olaydır. Burada, yayılma sırasında hücre kenarı çıkıntılarının dinamiklerini ölçmek için hızlı ve basit bir yöntem açıklıyoruz. Bu yöntem kısa süreli görüntülemeyi mümkün kılar, önemli miktarda veri üretir, hücrelerin floresan etiketlemesini veya pahalı floresan mikroskopi ekipmanı gerektirmez ve daha fazl...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A