Misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione utilizzando la microscopia a cellule vive

Riepilogo

Questo protocollo ha lo scopo di misurare i parametri dinamici (protrusioni, retrazioni, volant) delle sporgenze ai margini delle celle di diffusione.

Abstract

Lo sviluppo e l'omeostasi degli organismi multicellulari si basano sulla regolazione coordinata della migrazione cellulare. La migrazione cellulare è un evento essenziale nella costruzione e nella rigenerazione dei tessuti ed è fondamentale per lo sviluppo embrionale, le risposte immunologiche e la guarigione delle ferite. La disregolazione della motilità cellulare contribuisce a disturbi patologici, come l'infiammazione cronica e le metastasi del cancro. La migrazione cellulare, l'invasione tissutale, l'assone e la crescita del dendrite iniziano tutti con sporgenze del bordo cellulare mediate dalla polimerizzazione dell'actina. Qui, descriviamo un metodo semplice, efficiente e che consente di risparmiare tempo per l'imaging e l'analisi quantitativa delle dinamiche di protrusione del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo misura le caratteristiche discrete della dinamica della membrana del bordo cellulare, come sporgenze, retrazioni e volant, e può essere utilizzato per valutare come le manipolazioni dei regolatori di actina chiave influenzano le sporgenze del bordo cellulare in diversi contesti.

Introduzione

La migrazione cellulare è un processo critico che controlla lo sviluppo e la funzione di tutti gli organismi viventi. La migrazione cellulare avviene sia in condizioni fisiologiche, come l'embriogenesi, la guarigione delle ferite e la risposta immunitaria, sia in condizioni patologiche, come metastasi tumorali e malattie autoimmuni. Nonostante le differenze nei tipi di cellule che prendono parte a diversi eventi migratori, tutti gli eventi di motilità cellulare condividono meccanismi molecolari simili, che sono stati conservati nell'evoluzione dai protozoi ai mammiferi e coinvolgono meccanismi di controllo citoscheletrico comuni in grado di rilevare l'ambiente, rispondere ai segnali e modulare il comportamento cellulare in ^risposta1.

Una fase iniziale della migrazione cellulare può essere la formazione di sporgenze altamente dinamiche sul bordo anteriore della cella. Dietro il lamellipodio si trova la lamella, che accoppia l'actina alla contrattilità mediata dalla miosina II e media l'adesione al substrato sottostante. Le lamellipodia sono indotte da stimoli extracellulari come fattori di crescita, citochine e recettori di adesione cellulare e sono guidate dalla polimerizzazione dell'actina, che fornisce la forza fisica che spinge la membrana plasmatica in ^avanti2,3. Molte proteine di segnalazione e strutturali sono state implicate in questo; tra questi ci sono rho GTPasi, che agiscono in coordinate con altri segnali per attivare proteine che regolano l'actina come il complesso Arp 2/3, le proteine della famiglia WASP e membri delle famiglie Formin e Spire in lamellipodia2,4,5.

Oltre alla polimerizzazione dell'actina, l'attività della miosina II è necessaria per generare forze contrattili al lamellipodio e alla lamella anteriore. Queste contrazioni, definite anche come retrazioni del bordo cellulare, possono anche derivare dalla depolimerizzazione dell'actina dendritica alla periferia cellulare e sono fondamentali per lo sviluppo del bordo d'attacco lamellipodiale e consentire alla protrusione di rilevare la flessibilità della matrice extracellulare e di altre cellule e determinare la direzione della migrazione6,7,8 . Le sporgenze del bordo cellulare che non possono attaccarsi al substrato formeranno volant periferici della membrana, strutture simili a fogli che appaiono sulla superficie ventrale di lamellipodi e lamelle e si muovono all'indietro rispetto alla direzione della migrazione. Poiché il lamellipodio non riesce ad attaccarsi al substrato, un lamellipodio posteriore si forma sotto di esso e spinge meccanicamente il primo lamellipodio verso la superficie ventrale superiore. I filamenti di actina nel volant che erano precedentemente paralleli al substrato ora diventano perpendicolari ad esso, e il volant è ora posizionato sopra il lamellipodio che avanza. Il volant che si muove all'indietro ricade nel citosol e rappresenta un meccanismo cellulare per il riciclo dell'actina lamellipodiale9,10.

Qui, descriviamo un test per la misurazione della dinamica di protrusione del bordo cellulare. Il test di protrusione utilizza la microscopia video time-lapse per misurare la dinamica di protrusione del bordo della singola cellula per 10 minuti durante la fase di diffusione della cellula. Le dinamiche di protrusione vengono analizzate generando cimografi da questi filmati. In linea di principio, un chimografo impartisce dati quantitativi dettagliati di particelle in movimento in un grafico spaziotemporale per ottenere una comprensione qualitativa della dinamica dei bordi cellulari. L'intensità della particella in movimento viene tracciata per tutte le pile di immagini in un grafico tempo rispetto allo spazio, dove l'asse X e l'asse Y rappresentano rispettivamente il tempo e la ^distanza11. Questo metodo utilizza un'analisi manuale del kymograph con ImageJ per ottenere dati quantitativi dettagliati, consentendo il recupero di informazioni da filmati e immagini in caso di basso rapporto segnale-rumore e / o alta densità di funzionalità, e l'analisi di immagini acquisite in microscopia a luce a contrasto di fase o scarsa qualità dell'immagine.

Il test della dinamica di protrusione del bordo cellulare descritto qui è un metodo veloce, semplice ed economico. Come tale, e poiché è stato dimostrato che è direttamente correlato con la migrazione ^{cellulare11,12}, può essere utilizzato come metodo preliminare per testare le dinamiche citoscheletriche coinvolte nella motilità cellulare prima di decidere di eseguire metodi più esigenti in termini di risorse. Inoltre, consente anche la misurazione quantitativa di come le manipolazioni genetiche (knockout, knockdown o costrutti di salvataggio) delle proteine citoscheletriche influiscono sulla dinamica citoscheletrica utilizzando una piattaforma semplice. Il test è un modello istruttivo per esplorare la dinamica citoscheletrica nel contesto della migrazione cellulare e potrebbe essere utilizzato per chiarire i meccanismi e le molecole alla base della motilità cellulare.

Protocollo

Tutti i metodi descritti in questo protocollo sono stati approvati dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali (IACUC) dell'Università Bar-Ilan.

Nota : nella Figura 1 viene visualizzata una rappresentazione grafica dettagliata della procedura descritta in questa sezione.

1. Coltura cellulare

NOTA: Le cellule utilizzate nel protocollo sono fibroblasti embrionali di topo (MEF) che sono stati generati da embrioni E11.5-13.5 di topi C57BL/6 wild-type. I MEF primari sono stati generati secondo il protocollo di laboratorio ^Jacks13. Le cellule di cinque diversi embrioni sono state raggruppate insieme e immortalate dall'infezione con un vettore retrovirale che esprime l'antigene T grande SV40 seguito dalla selezione con 4 mM di istidinolo per 3 settimane.

1. Cellule di coltura in piastre di coltura tissutale contenenti Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) contenenti 1 g/L di glucosio, 1% di glutammina, 1% di penicillina-streptomicina e 10% di siero bovino fetale (FBS) (vedi Tabella dei materiali), in un incubatore umidificato con il 5% di _CO2 a 37 °C.
2. Coltivare le cellule fino al 90% -95% di confluenza e dividersi in un rapporto di 1:5 ogni 2-3 giorni.

2. Rivestimento del piatto con fondo di vetro

NOTA: il rivestimento del piatto con fondo di vetro deve essere eseguito nella cappa di coltura del tessuto in condizioni sterili.

1. Aggiungere 2 ml di soluzione 1N HCl al centro di un piatto con fondo di vetro (Table of Materials) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (RT).
   NOTA: questa fase ha lo scopo di rimuovere i residui dal vetro che potrebbero interrompere l'imaging in un secondo momento.
2. Lavare il piatto con fondo di vetro tre volte con 2 ml di 1x PBS (Table of Materials) ciascuno.
3. Diluire la fibronectina (vedere Tabella dei materiali) a 10 μg/mL in 1x PBS. Aggiungere 200 μL della soluzione di fibronectina diluita al centro di vetro del piatto. Incubare a 37 °C (incubatore di colture tissutali) per 1 ora.
   NOTA: In alternativa, il piatto con fondo di vetro può essere incubato durante la notte a 4 °C su una superficie piana.
4. Durante il tempo di incubazione del rivestimento in fibronectina, preparare la soluzione di BSA (Table of Materials) all'1% in 1x PBS, filtrare attraverso 0,2 μm e denaturare incubando a 70 °C per 30 minuti in un bagno d'acqua preriscaldato.
5. Lavare il piatto rivestito con fondo di vetro tre volte con 2 ml di 1x PBS ciascuno.
6. Aggiungere 2 mL di soluzione BSA denaturata al centro del vetro e incubare per 1 ora a 37 °C (incubatore di colture tissutali).
   NOTA: In alternativa, il piatto con fondo di vetro può essere incubato durante la notte a 4 °C su una superficie piana.
7. Lavare il piatto con fondo di vetro 3 volte con 2 ml di 1x PBS ciascuno.
   NOTA: L'incubazione di piatti con fondo di vetro con fibronectina deve essere eseguita per almeno 1 ora a 37 °C per rivestire correttamente la superficie. Un tempo di incubazione più breve potrebbe non produrre un rivestimento adeguato e, di conseguenza, il fenotipo cellulare potrebbe non essere correlato all'attivazione dell'integrina. Lo strato BSA è inerte e non influenzerà la dinamica della protrusione e ha lo scopo di bloccare i siti potenziali liberi per l'adesione cellulare indipendente dall'integrina. La BSA deve essere denaturata prima del rivestimento per evitare che induca l'apoptosi cellulare, che può influenzare la dinamica del bordo cellulare.

3. Preparazione delle cellule per l'imaging

1. Da sedici a diciotto ore prima dell'esperimento, piazzare le cellule per raggiungere il 70% -80% di confluenza il giorno seguente. Per i MEF, piastra 0,7 x ¹⁰⁶ cellule per piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro un giorno prima di eseguire l'esperimento.
   NOTA: Per un esperimento di protrusione di successo, è importante che le cellule vengano utilizzate durante la loro fase di crescita logaritmica. Per raggiungere questo obiettivo, le cellule dovrebbero raggiungere il 70% -80% di confluenza il giorno dell'esperimento. Una maggiore densità di cellule si tradurrà in un tempo di diffusione più lungo e / o impedimento nell'attaccamento durante l'esperimento.
2. Il giorno dell'esperimento, aggiungere 2 ml di soluzione di tripsina (Tabella dei materiali) per piastra di coltura tissutale di 10 cm di diametro e incubare per 2-3 minuti in un incubatore di colture tissutali fino a quando le cellule non si staccano. Inattivare la tripsina aggiungendo 5 ml del mezzo completo.
3. Contare le cellule usando un emocitometro e lastra 20.000 cellule in 2 ml del mezzo completo su un piatto con fondo di vetro rivestito come sopra (sezione 2).
   NOTA: il numero di celle per la placcatura dipende dalle dimensioni e dal tipo di celle. Per le cellule più grandi o più diffuse, placcare solo 10.000 cellule per avere abbastanza cellule per l'imaging. È importante scegliere singole cellule che non si toccano poiché il contatto cellula-cellula può alterare i comportamenti di diffusione intrinseci delle cellule.
4. Incubare i piatti con fondo di vetro con cellule placcate nell'incubatore di colture tissutali per 15 minuti.
   NOTA: Durante questa fase, le cellule aderiscono al substrato della fibronectina e si diffondono su di esso. Quando si misurano le sporgenze durante la diffusione cellulare, le cellule devono essere lasciate diffondersi per 15 minuti dopo la placcatura e prima dell'imaging. L'imaging può essere eseguito entro una finestra temporale compresa tra 15 minuti e ~ 1 ora dopo la placcatura e, in ogni caso, prima che le cellule inizino a migrare.

4. Configurazione e imaging del microscopio

NOTA: Sono disponibili vari sistemi di microscopia a cellule vive. Il sistema utilizzato qui è un microscopio invertito Leica AF6000 dotato di _CO2 e unità di riscaldamento ed è collegato a una fotocamera CMOS digitale ORCA-Flash 4.0 V2.

1. Accendere l'unità di riscaldamento almeno 1 ora prima dell'imaging e impostarla a 37 °C.
2. Accendere l'unità _CO2 almeno 10 minuti prima dell'imaging e impostarla al 5% di _CO2.
3. Accendere il microscopio, la fotocamera e il computer.
4. Aprire il software di acquisizione del microscopio (vedere Tabella dei materiali). Scegliere la cartella in cui salvare le immagini acquisite e digitare un nome di file. Salva ogni filmato come nuovo file.
5. Imposta l'ingrandimento su una lente asciutta 40x, contrasto di fase. Imposta l'intervallo di tempo su 5 s, durata totale del film 10 min.
6. Dopo 15 minuti di incubazione delle celle placcate, posizionare il piatto con fondo di vetro con celle aderenti nell'adattatore e fissarlo. Inserire l'adattatore con la parabola nella sua fessura nella fase del microscopio.
7. Togliere il coperchio del piatto e posizionare invece il coperchio di _CO2 . Aprire la valvola _CO2 .
   NOTA: Assicurarsi che il coperchio in _CO2 sia pulito prima di posizionarlo sopra il piatto con fondo di vetro. Una copertina sporca ridurrà la qualità dei film. Pulire la parte inferiore del coperchio a _CO2 con una salvietta priva di lanugine imbevuta di etanolo al 70% per rimuovere polvere e sporco. Pulire una seconda volta con una salvietta asciutta senza lanugine.
8. Visualizzare le celle e trovare una cella appropriata per l'imaging. Assicurati che la cella sia a fuoco e avvia l'acquisizione del filmato.

5. Analisi delle immagini

NOTA: l'analisi delle immagini viene eseguita utilizzando ImageJ (Table of Materials) come segue:

1. Apri il filmato acquisito in ImageJ.
2. Utilizzando lo strumento Diritto (Straight ) nella barra degli strumenti principale, create otto linee di 20 unità arbitrarie ciascuna perpendicolari alle sporgenze, comprese la lamella e il bordo della cella, in una disposizione radiale ogni 45°, come mostrato nella Figura 2A.
3. Nella barra degli strumenti principale, vai a Image > Stacks > Reslice. Ciò produrrà un'immagine del kymografo, che descrive il movimento di singoli punti all'interno della membrana cellulare (Figura 2B). Questa azione deve essere eseguita separatamente per ogni riga delle otto righe.
4. Estrarre e contare manualmente dalle rispettive immagini del kymograph il numero di sporgenze, retrazioni e volant in ciascuna delle otto regioni della cella, contrassegnate dalle linee della griglia. Questi numeri rappresentano la frequenza di sporgenze, retrazioni e volant per 10 minuti (Figura 2C, D).
   NOTA: I volant possono essere distinti da altre strutture in base al loro aspetto scuro nella microscopia a contrasto di fase e al loro movimento centripeto, che inizia dal bordo della cellula e termina al bordo del corpo cellulare, che può essere osservato nei filmati acquisiti. Da notare, quando si quantifica la protrusione, la retrazione e la frequenza dell'arruffamento, i filmati dovrebbero essere osservati come controllo per la quantificazione e soprattutto per la definizione dei volant.
5. Determinare la persistenza, la distanza e la velocità della protrusione mediante l'analisi della chimografia. Per ciascuno dei kymografi generati, l'asse X rappresenta la distanza e l'asse Y rappresenta il tempo.
6. Per misurare la distanza di protrusione, seguite i passaggi 5.6.1-5.6.2.
   1. Disegnate una linea perpendicolare dalla base della protrusione al picco più alto della protrusione. Premere M in ImageJ per misurare la lunghezza della linea in pixel.
   2. Per convertire la lunghezza da pixel a μm, assicurarsi che il rapporto pixel/μm sia noto.
      NOTA: il rapporto μm/pixel è la lunghezza fisica di un pixel sulla fotocamera CCD / ingrandimento totale. La dimensione dei pixel è caratteristica di ogni tipo di fotocamera. Ad esempio, per la fotocamera utilizzata in questo studio, la dimensione dei pixel è 6,5 μm x 6,5 μm, la lunghezza fisica è 6,5 μm e l'ingrandimento che abbiamo usato è 40x. Pertanto, il rapporto μm/pixel della nostra fotocamera è di 0,1625 μm/pixel. Nell'analisi, per una linea della lunghezza di 30 pixel, la distanza di protrusione sarebbe di 30 pixel x 0,1625 μm/pixel = 4,875 μm (Figura 3).
7. Per misurare il tempo di protrusione (persistenza; la quantità di tempo che una protrusione trascorre sporgendo prima di ritrarsi), seguite i passaggi 5.7.1-5.7.2.
   1. Disegnate una linea orizzontale dall'inizio della protrusione (da sinistra a destra) alla regione della vetta più alta. Premere M in ImageJ per misurare la lunghezza della linea in pixel.
   2. Per convertire la lunghezza da pixel a minuti, calcolate il rapporto pixel/min. Questo valore dipende dall'intervallo tra le immagini.
      NOTA: in questo esempio, l'intervallo tra le immagini è 5 s, il rapporto min/pixel è 0,0833 e la lunghezza della linea orizzontale è di 8 pixel. Pertanto, il tempo di protrusione è 8 pixel x 0,0833 min/pixel = 0,6664 min.
8. Misurate e calcolate il tempo di retrazione in modo simile al tempo di protrusione per una linea disegnata orizzontalmente alla base della protrusione da dove si trova il picco della protrusione alla sua base a destra (linea X2 nella Figura 3).
9. Calcolate la velocità di protrusione dividendo la distanza di protrusione per il tempo di protrusione. Calcolate la velocità di retrazione dividendo la distanza di protrusione per il tempo di retrazione. In questo esempio, la velocità di protrusione viene calcolata come 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min. e la velocità di retrazione è identica perché la linea che rappresenta il tempo è alla stessa lunghezza.
   NOTA: Nel confrontare diversi tipi di cellule, cioè cellule che esprimono costrutti wild type e mutanti della stessa proteina, è imperativo eseguire un'analisi in cieco, quindi non viene introdotto alcun pregiudizio.

Risultati

Nell'esperimento descritto nella Figura 2, i MEF immortalizzati sono stati placcati su piatti con fondo di vetro pre-rivestiti con fibronectina per attivare la segnalazione mediata dall'integrina, bloccata dalla BSA denaturata, per bloccare i siti potenziali liberi per l'adesione cellulare che non dipende dall'attivazione dell'integrina. Per raggiungere la fase di crescita logaritmica al 70%-80% di confluenza delle cellule il giorno dell'esperimento, 0,7 x ¹⁰⁶ MEF sono stati placc...

Discussione

La dinamica di protrusione del bordo cellulare, composta da protrusioni, retrazioni e volant, è sia un prerequisito che un potenziale evento limitante la velocità nella motilità cellulare. Qui descriviamo un metodo rapido e semplice per misurare la dinamica delle sporgenze del bordo cellulare durante la diffusione. Questo metodo consente l'imaging a breve termine, genera una quantità significativa di dati, non richiede l'etichettatura fluorescente delle cellule o costose apparecchiature di microscopia fluorescente e ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A