Messung der Zellkanten-Überstandsdynamik während des Streuens mittels Lebendzellmikroskopie

Zusammenfassung

Dieses Protokoll zielt darauf ab, die dynamischen Parameter (Vorsprünge, Retraktionen, Rüschen) von Vorsprüngen am Rand von sich ausbreitenden Zellen zu messen.

Zusammenfassung

Die Entwicklung und Homöostase vielzelliger Organismen beruht auf einer koordinierten Regulation der Zellmigration. Die Zellmigration ist ein wesentliches Ereignis beim Aufbau und der Regeneration von Geweben und entscheidend für die Embryonalentwicklung, die immunologischen Reaktionen und die Wundheilung. Eine Dysregulation der Zellmotilität trägt zu pathologischen Störungen wie chronischen Entzündungen und Krebsmetastasen bei. Zellmigration, Gewebeinvasion, Axon- und Dendritenauswuchs beginnen alle mit Aktinpolymerisations-vermittelten Zellrandvorsprüngen. Hier beschreiben wir eine einfache, effiziente und zeitsparende Methode zur bildgebenden und quantitativen Analyse der Zellkantenprotrusionsdynamik während der Ausbreitung. Diese Methode misst diskrete Merkmale der Zellkantenmembrandynamik, wie Vorsprünge, Rückzug und Rüschen, und kann verwendet werden, um zu beurteilen, wie sich Manipulationen von Schlüssel-Aktinregulatoren auf Zellkantenvorsprünge in verschiedenen Kontexten auswirken.

Einleitung

Die Zellmigration ist ein kritischer Prozess, der die Entwicklung und Funktion aller lebenden Organismen steuert. Die Zellmigration tritt sowohl unter physiologischen Bedingungen wie Embryogenese, Wundheilung und Immunantwort als auch unter pathologischen Zuständen wie Krebsmetastasen und Autoimmunerkrankungen auf. Trotz Unterschieden in den Zelltypen, die an verschiedenen Migrationsereignissen beteiligt sind, teilen alle Zellmotilitätsereignisse ähnliche molekulare Mechanismen, die in der Evolution von Protozoen zu Säugetieren konserviert wurden und gemeinsame zytoskelettale Kontrollmechanismen beinhalten, die die Umgebung erfassen, auf Signale reagieren und das Zellverhalten als Reaktion modulieren ^können1.

Ein Anfangsstadium der Zellmigration kann die Bildung hochdynamischer Vorsprünge an der Vorderkante der Zelle sein. Hinter dem Lamellipodium befindet sich die Lamelle, die Aktin an Myosin II-vermittelte Kontraktilität koppelt und die Adhäsion auf das darunter liegende Substrat vermittelt. Lamellipodien werden durch extrazelluläre Reize wie Wachstumsfaktoren, Zytokine und Zelladhäsionsrezeptoren induziert und durch Aktinpolymerisation angetrieben, die die physikalische Kraft liefert, die die Plasmamembran ^{vorantreibt2,3}. Viele Signal- und Strukturproteine sind daran beteiligt; unter ihnen sind Rho-GTPasen, die koordiniert mit anderen Signalen wirken, um aktinregulierende Proteine wie den Arp 2/3-Komplex, Proteine der WASP-Familie und Mitglieder der Formin- und Spire-Familien in Lamellipodia2,4,5 zu aktivieren.

Neben der Aktinpolymerisation ist eine Myosin-II-Aktivität erforderlich, um kontraktile Kräfte am Lamellipodium und an der vorderen Lamelle zu erzeugen. Diese Kontraktionen, auch definiert als Zellrand-Rückzug, können auch aus der Depolymerisation von dendritischem Aktin an der Zellperipherie resultieren und sind entscheidend für die Entwicklung der lamellipodialen Vorderkante und ermöglichen es dem Protrusion, die Flexibilität der extrazellulären Matrix und anderer Zellen zu erkennen und die Richtung der Migration zu ^{bestimmen6,7,8} . Zellrandvorsprünge, die sich nicht an das Substrat anheften können, bilden periphere Membranrüschen, blattartige Strukturen, die auf der ventralen Oberfläche von Lamellipodien und Lamellen erscheinen und sich relativ zur Migrationsrichtung rückwärts bewegen. Da sich das Lamellipodium nicht am Substrat festsetzt, bildet sich darunter ein hinteres Lamellipodium und drückt das erste Lamellipodium mechanisch in Richtung der oberen ventralen Oberfläche. Die Aktinfilamente in der Rüsche, die früher parallel zum Substrat waren, werden jetzt senkrecht zu ihm, und die Rüsche ist jetzt über dem vorrückenden Lamellipodium positioniert. Die Rüsche, die sich rückwärts bewegt, fällt zurück in das Zytosol und stellt einen zellulären Mechanismus zum Recycling von lamellipodialem Aktin ^dar9,10.

Hier beschreiben wir einen Assay zur Messung der Zellkanten-Protrusionsdynamik. Der Protrusionsassay verwendet Zeitraffer-Videomikroskopie, um die Protrusionsdynamik einzelner Zellkanten für 10 Minuten während der Spreizphase der Zelle zu messen. Die Protrusionsdynamik wird analysiert, indem Kymographen aus diesen Filmen generiert werden. Im Prinzip liefert ein Kymograph detaillierte quantitative Daten von sich bewegenden Partikeln in einem raumzeitlichen Diagramm, um ein qualitatives Verständnis der Zellranddynamik zu erhalten. Die Intensität des sich bewegenden Teilchens wird für alle Bildstapel in einem Zeit-Raum-Diagramm dargestellt, wobei die X-Achse und die Y-Achse Zeit bzw. Entfernung ^darstellen11. Diese Methode verwendet eine manuelle Kymographenanalyse mit ImageJ, um detaillierte quantitative Daten zu erhalten, die das Abrufen von Informationen aus Filmen und Bildern bei niedrigem Signal-Rausch-Verhältnis und / oder hoher Merkmalsdichte sowie die Analyse von Bildern ermöglichen, die in Phasenkontrast-Lichtmikroskopie oder schlechter Bildqualität aufgenommen wurden.

Der hierin beschriebene Zellkanten-Protrusionsdynamik-Assay ist eine schnelle, einfache und kostengünstige Methode. Als solches und weil es nachweislich direkt mit der Zellmigration korreliert11,12, kann es als vorläufige Methode zum Testen der Zytoskelettdynamik verwendet werden, die an der Zellmotilität beteiligt ist, bevor entschieden wird^, ressourcenintensivere Methoden durchzuführen. Darüber hinaus ermöglicht es auch die quantitative Messung, wie genetische Manipulationen (Knockout-, Knockdown- oder Rettungskonstrukte) von Zytoskelettproteinen die Zytoskelettdynamik mit einer einfachen Plattform beeinflussen. Der Assay ist ein lehrreiches Modell zur Erforschung der Zytoskelettdynamik im Kontext der Zellmigration und könnte zur Aufklärung der Mechanismen und Moleküle verwendet werden, die der Zellmotilität zugrunde liegen.

Protokoll

Alle in diesem Protokoll beschriebenen Methoden wurden vom institutionellen Animal Care and Use Committee (IACUC) der Bar-Ilan-Universität genehmigt.

HINWEIS: Eine grafische Schritt-für-Schritt-Darstellung des in diesem Abschnitt beschriebenen Verfahrens ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Zellkultur

HINWEIS: Die im Protokoll verwendeten Zellen sind embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus, die aus E11,5-13,5-Embryonen von Wildtyp-C57BL/6-Mäusen erzeugt wurden. Primäre MEFs wurden gemäß dem ^{Jacks-Laborprotokoll13 erzeugt.} Zellen aus fünf verschiedenen Embryonen wurden zusammen gepoolt und durch Infektion mit einem retroviralen Vektor, der SV40 Large T-Antigen exprimierte, verewigt, gefolgt von einer Selektion mit 4 mM Histidinol für 3 Wochen.

1. Kulturzellen in Gewebekulturplatten, die Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) enthalten, das 1 g/L Glukose, 1% Glutamin, 1% Penicillin-Streptomycin und 10% fetales Rinderserum (FBS) enthält (siehe Materialtabelle), in einem befeuchteten Inkubator mit 5_{% CO2} bei 37 °C.
2. Kultivieren Sie die Zellen bis zu 90% -95% Konfluenz und teilen Sie sie sich alle 2-3 Tage im Verhältnis 1: 5 auf.

2. Glasboden-Schalenbeschichtung

HINWEIS: Die Beschichtung der Glasbodenschale sollte unter sterilen Bedingungen in der Gewebekulturhaube durchgeführt werden.

1. Fügen Sie 2 ml 1N HCl-Lösung in der Mitte einer Glasbodenschale hinzu (Table of Materials) und inkubieren Sie für 20 min bei Raumtemperatur (RT).
   HINWEIS: Diese Phase dient dazu, Rückstände aus dem Glas zu entfernen, die die Bildgebung später unterbrechen können.
2. Waschen Sie die Glasbodenschale dreimal mit jeweils 2 ml 1x PBS (Table of Materials).
3. Verdünnen Sie Fibronektin (siehe Materialtabelle) auf 10 μg/ml in 1x PBS. Geben Sie 200 μL der verdünnten Fibronektinlösung in die Glasmitte der Schale. Bei 37 °C (Gewebekultur-Inkubator) für 1 h inkubieren.
   HINWEIS: Alternativ kann die Glasbodenschale über Nacht bei 4 °C auf einer ebenen Fläche inkubiert werden.
4. Während der Inkubationszeit der Fibronektinbeschichtung bereiten Sie 1% BSA-Lösung (Table of Materials) in 1x PBS vor, filtern Sie durch 0,2 μm und denaturieren Sie sie durch Inkubation bei 70 ° C für 30 Minuten in einem vorgewärmten Wasserbad.
5. Waschen Sie die beschichtete Glasbodenschale dreimal mit je 2 ml 1x PBS.
6. 2 ml denaturierte BSA-Lösung in die Glasmitte geben und 1 h bei 37 °C inkubieren (Gewebekultur-Inkubator).
   HINWEIS: Alternativ kann die Glasbodenschale über Nacht bei 4 °C auf einer ebenen Fläche inkubiert werden.
7. Waschen Sie die Glasbodenschale 3 Mal mit je 2 ml 1x PBS.
   HINWEIS: Die Inkubation von Glasbodenschalen mit Fibronektin sollte mindestens 1 h bei 37 °C durchgeführt werden, um die Oberfläche richtig zu beschichten. Eine kürzere Inkubationszeit führt möglicherweise nicht zu einer ordnungsgemäßen Beschichtung, und infolgedessen ist der Zellphänotyp möglicherweise nicht mit der Integrinaktivierung verbunden. Die BSA-Schicht ist inert und beeinflusst die Protrusionsdynamik nicht und soll freie potenzielle Stellen für eine integrinunabhängige Zelladhäsion blockieren. Die BSA muss vor der Beschichtung denaturiert werden, um zu verhindern, dass sie Zellapoptose induziert, die die Zellkantendynamik beeinflussen kann.

3. Vorbereitung der Zellen für die Bildgebung

1. Sechzehn bis achtzehn Stunden vor dem Experiment die Zellen plattieren, um am nächsten Tag einen Zusammenfluss von 70% -80% zu erreichen. Für MEFs, Platte 0,7 x ¹⁰⁶ Zellen pro 10 cm Durchmesser Gewebekulturplatte einen Tag vor der Durchführung des Experiments.
   HINWEIS: Für ein erfolgreiches Protrusionsexperiment ist es wichtig, dass die Zellen während ihrer logarithmischen Wachstumsphase verwendet werden. Um dies zu erreichen, sollten die Zellen am Tag des Experiments einen Zusammenfluss von 70% -80% erreichen. Eine höhere Zelldichte führt zu einer längeren Ausbreitungszeit und/oder einer Behinderung der Anheftung während des Experiments.
2. Am Experimenttag 2 ml Trypsinlösung (Materialtabelle) pro Gewebekulturplatte mit einem Durchmesser von 10 cm hinzufügen und 2-3 Minuten in einem Gewebekulturinkubator inkubieren, bis sich die Zellen ablösen. Inaktivieren Sie Trypsin, indem Sie 5 ml des vollständigen Mediums hinzufügen.
3. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und beschichten Sie 20.000 Zellen in 2 ml des gesamten Mediums auf einer Glasbodenschale, die wie oben beschichtet ist (Abschnitt 2).
   HINWEIS: Die Anzahl der zu plattierenden Zellen hängt von der Größe und dem Typ der Zellen ab. Für größere oder mehr verteilte Zellen sollten Sie nur 10.000 Zellen platten, um genügend Zellen für die Bildgebung zu haben. Es ist wichtig, einzelne Zellen auszuwählen, die sich nicht berühren, da der Kontakt von Zelle zu Zelle das zellintrinsische Ausbreitungsverhalten verändern kann.
4. Inkubieren Sie die Glasbodenschalen mit plattierten Zellen im Gewebekultur-Inkubator für 15 min.
   HINWEIS: Während dieses Stadiums haften die Zellen am Fibronektinsubstrat und breiten sich darüber aus. Bei der Messung von Vorsprüngen während der Zellausbreitung sollten sich die Zellen nach der Beschichtung und vor der Bildgebung 15 Minuten lang ausbreiten können. Die Bildgebung kann innerhalb eines Zeitfensters zwischen 15 Minuten und ~ 1 h nach der Beschichtung und in jedem Fall vor Beginn der Migration der Zellen durchgeführt werden.

4. Mikroskopaufbau und Bildgebung

HINWEIS: Es stehen verschiedene Lebendzellmikroskopiesysteme zur Verfügung. Das hier verwendete System ist ein inverses Mikroskop Leica AF6000, das mit CO2- und Heizgeräten ausgestattet ist und an eine digitale CMOS-Kamera ORCA-Flash 4.0 _V2 angeschlossen ist.

1. Schalten Sie das Heizgerät vor der Bildgebung mindestens 1 h ein und stellen Sie es auf 37 °C ein.
2. Schalten Sie die CO2-Einheit mindestens 10 Minuten vor der Bildgebung ein und stellen Sie sie auf 5% _CO2 ein.
3. Schalten Sie das Mikroskop, die Kamera und den Computer ein.
4. Öffnen Sie die Mikroskoperfassungssoftware (siehe Tabelle der Materialien). Wählen Sie den Ordner aus, in dem die aufgenommenen Bilder gespeichert werden sollen, und geben Sie einen Dateinamen ein. Speichern Sie jeden Film als neue Datei.
5. Stellen Sie die Vergrößerung auf ein 40-fach trockenes Objektiv, Phasenkontrast. Stellen Sie das Zeitintervall auf 5 s ein, die Gesamtdauer des Films auf 10 min.
6. Nach 15 Minuten Inkubation der plattierten Zellen legen Sie die Glasbodenschale mit den verklebten Zellen in den Adapter und fixieren sie. Stecken Sie den Adapter mit der Schale in den Schlitz im Mikroskoptisch.
7. Nehmen Sie den Geschirrdeckel ab und setzen Sie stattdessen den _CO2-Deckel auf. Öffnen Sie das _CO2-Ventil.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die _{CO2-Abdeckung} sauber ist, bevor Sie sie auf die Glasbodenschale legen. Ein schmutziges Cover verringert die Qualität von Filmen. Wischen Sie die Unterseite des _CO2-Deckels mit einem fusselfreien Tuch ab, das mit 70% Ethanol getränkt ist, um Staub und Schmutz zu entfernen. Ein zweites Mal mit einem trockenen, fusselfreien Tuch abwischen.
8. Sehen Sie sich die Zellen an und finden Sie eine geeignete Zelle für die Bildgebung. Stellen Sie sicher, dass die Zelle im Fokus ist, und starten Sie die Filmakquisition.

5. Bildanalyse

HINWEIS: Die Bildanalyse wird mit ImageJ (Table of Materials) wie folgt durchgeführt:

1. Öffnen Sie den aufgenommenen Film in ImageJ.
2. Mit dem Geraden-Werkzeug in der Hauptsymbolleiste können Sie acht Linien mit jeweils 20 beliebigen Einheiten senkrecht zu den Vorsprüngen, einschließlich der Lamellen- und Zellkante, in einer radialen Anordnung alle 45° erstellen, wie in Abbildung 2A dargestellt.
3. Wechseln Sie in der Hauptsymbolleiste zu Image > Stacks > Reslice. Dies ergibt ein Kymographenbild, das die Bewegung einzelner Punkte innerhalb der Zellmembran beschreibt (Abbildung 2B). Diese Aktion sollte für jede Zeile aus den acht Zeilen separat ausgeführt werden.
4. Extrahieren und zählen Sie manuell aus den jeweiligen Kymographbildern die Anzahl der Vorsprünge, Rückzugen und Rüschen in jedem der acht Bereiche der Zelle, die durch die Gitterlinien markiert sind. Diese Zahlen stellen die Häufigkeit von Vorsprüngen, Rückzugen und Rüschen pro 10 min dar (Abbildung 2C, D).
   HINWEIS: Rüschen können von anderen Strukturen anhand ihrer dunklen Erscheinung in der Phasenkontrastmikroskopie und ihrer zentripetalen Bewegung unterschieden werden, die am Zellrand beginnt und an der Grenze des Zellkörpers endet, was in den erworbenen Filmen beobachtet werden kann. Bei der Quantifizierung von Protrusion, Retraktion und Rüschenfrequenz sollten Filme als Kontrolle für die Quantifizierung und insbesondere für die Definition von Rüschen beobachtet werden.
5. Bestimmen Sie die Protrusionspersistenz, den Abstand und die Geschwindigkeit durch Kymographieanalyse. Für jeden der erzeugten Kymographen stellt die X-Achse den Abstand und die Y-Achse die Zeit dar.
6. Führen Sie die Schritte 5.6.1-5.6.2 aus, um den Vorsprung zu messen.
   1. Zeichnen Sie eine senkrechte Linie von der Basis des Vorsprungs bis zur höchsten Spitze des Vorsprungs. Drücken Sie M in ImageJ, um die Länge der Linie in Pixeln zu messen.
   2. Um die Länge von Pixel in μm umzurechnen, stellen Sie sicher, dass das Verhältnis von Pixel zu μm bekannt ist.
      HINWEIS: Das μm-zu-Pixel-Verhältnis ist die physikalische Länge eines Pixels auf der CCD-Kamera / Gesamtvergrößerung. Die Pixelgröße ist charakteristisch für jeden Kameratyp. Für die in dieser Studie verwendete Kamera beträgt beispielsweise die Pixelgröße 6,5 μm x 6,5 μm, die physikalische Länge 6,5 μm und die von uns verwendete Vergrößerung das 40-fache. Daher beträgt das μm-Pixel-Verhältnis unserer Kamera 0,1625 μm/Pixel. In der Analyse würde für eine Linie mit einer Länge von 30 Pixeln der Überstandungsabstand 30 Pixel x 0,1625 μm/Pixel = 4,875 μm betragen (Abbildung 3).
7. Führen Sie die Schritte 5.7.1 bis 5.7.2 aus, um die Protrusionszeit (Persistenz; die Zeit, die ein Vorsprung vor dem Zurückziehen verbringt) zu messen.
   1. Zeichne eine horizontale Linie vom Anfang des Vorsprungs (von links nach rechts) bis zum Bereich des höchsten Gipfels. Drücken Sie M in ImageJ, um die Länge der Linie in Pixeln zu messen.
   2. Um die Länge von Pixeln in Minuten umzurechnen, berechnen Sie das Verhältnis von Pixel zu Min. Dieser Wert hängt vom Intervall zwischen den Bildern ab.
      HINWEIS: In diesem Beispiel beträgt das Intervall zwischen den Bildern 5 s, das Min/Pixel-Verhältnis 0,0833 und die horizontale Zeilenlänge 8 Pixel. Daher beträgt die Überstandungszeit 8 Pixel x 0,0833 min/Pixel = 0,6664 min.
8. Messen und berechnen Sie die Rückzugszeit ähnlich wie die Hervorstosszeit für eine Linie, die horizontal an der Basis des Vorsprungs gezeichnet wird, von wo aus sich die Spitze des Vorsprungs zu seiner Basis rechts befindet (Linie X2 in Abbildung 3).
9. Berechnen Sie die Protrusionsgeschwindigkeit, indem Sie den Protrusionsabstand durch die Protrusionszeit dividieren. Berechnen Sie die Rückzugsgeschwindigkeit, indem Sie den Vortriebsabstand durch die Rückzugszeit dividieren. In diesem Beispiel wird die Protrusionsgeschwindigkeit als 4,875 μm/0,6664 min = 7,315 μm/min berechnet, und die Rückzugsgeschwindigkeit ist identisch, da die Linie, die die Zeit darstellt, gleich lang ist.
   HINWEIS: Beim Vergleich verschiedener Zelltypen, d.h. Zellen, die Wildtyp- und Mutantenkonstrukte desselben Proteins exprimieren, ist es unerlässlich, eine verblindete Analyse durchzuführen, damit keine Verzerrung eingeführt wird.

Ergebnisse

In dem in Abbildung 2 beschriebenen Experiment wurden immortalisierte MEFs auf Glasbodenschalen plattiert, die mit Fibronektin vorbeschichtet waren, um die durch denaturierte BSA blockierte integrinvermittelte Signalübertragung zu aktivieren, um freie potenzielle Stellen für die Zelladhäsion zu blockieren, die nicht von der Integrinaktivierung abhängig ist. Um die logarithmische Wachstumsphase bei 70%-80% Zusammenfluss von Zellen am Tag des Experiments zu erreichen, wurden 16 h vor dem E...

Diskussion

Die Zellkanten-Protrusionsdynamik, bestehend aus Vorsprüngen, Rückzug und Rüschen, ist sowohl eine Voraussetzung als auch ein potenzielles geschwindigkeitsbegrenzendes Ereignis in der Zellmotilität. Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode zur Messung der Dynamik von Zellrandvorsprüngen während der Ausbreitung. Diese Methode ermöglicht eine kurzzeitige Bildgebung, generiert eine erhebliche Datenmenge, erfordert keine fluoreszierende Markierung von Zellen oder teure Fluoreszenzmikroskopiegeräte und ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A