라이브 셀 현미경을 사용하여 확산 중 셀 에지 돌출 역학 측정

요약

이 프로토콜은 확산 세포의 가장자리에서 돌출부의 동적 매개 변수 (돌출부, 수축, 주름)를 측정하는 것을 목표로합니다.

초록

다세포 유기체의 발달과 항상성은 세포 이동의 조정 된 조절에 의존합니다. 세포 이동은 조직의 구성 및 재생에 필수적인 사건이며 배아 발달, 면역 학적 반응 및 상처 치유에 중요합니다. 세포 운동성의 조절 장애는 만성 염증 및 암 전이와 같은 병리학 적 장애에 기여합니다. 세포 이동, 조직 침윤, 축삭 및 수상 돌기 성장은 모두 액틴 중합 매개 세포 가장자리 돌출부로 시작됩니다. 여기에서는 확산 중 세포 가장자리 돌출 역학의 이미징 및 정량 분석을위한 간단하고 효율적이며 시간을 절약하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 돌출부, 수축 및 주름과 같은 세포 가장자리 막 역학의 개별 특징을 측정하고 주요 액틴 조절기의 조작이 다양한 맥락에서 세포 가장자리 돌출부에 어떻게 영향을 미치는지 평가하는 데 사용할 수 있습니다.

서문

세포 이동은 모든 살아있는 유기체의 발달과 기능을 제어하는 중요한 과정입니다. 세포 이동은 배아 발생, 상처 치유 및 면역 반응과 같은 생리적 조건과 암 전이 및 자가면역 질환과 같은 병리학적 조건 모두에서 발생합니다. 서로 다른 철새 사건에 참여하는 세포 유형의 차이에도 불구하고, 모든 세포 운동성 사건은 원생 동물에서 포유류로의 진화에서 보존 된 유사한 분자 메커니즘을 공유하며, 환경을 감지하고, 신호에 반응하고, 반응에서 세포 행동을 조절할 수있는 일반적인 세포 골격 조절 메커니즘을 포함합니다¹.

세포 이동의 초기 단계는 세포의 최첨단에서 매우 역동적인 돌출부를 형성하는 것일 수 있다. 라멜리 포디움 뒤에는 액틴을 미오신 II 매개 수축성에 결합시키고 기본 기질에 대한 접착을 매개하는 라멜라를 찾을 수 있습니다. 라멜리포디아는 성장 인자, 사이토카인 및 세포 부착 수용체와 같은 세포외 자극에 의해 유도되며, 액틴 중합에 의해 구동되며, 이는 원형질막을 앞으로 밀어내는 물리적 힘을 제공한다^2,3. 많은 신호전달 및 구조 단백질이 이에 연루되어 있다; 그 중에는 Arp 2/3 복합체, WASP 패밀리 단백질 및 lamellipodia2,4,5의 Formin 및 Spire 패밀리의 구성원과 같은 액틴 조절 단백질을 활성화하기 위해 다른 신호와 조화롭게 작용하는 Rho GTPases가 있습니다.

액틴 중합 이외에, 미오신 II 활성은 라멜리포디움 및 전방 라멜라에서 수축력을 생성하는데 요구된다. 세포 가장자리 수축으로도 정의되는 이러한 수축은 또한 세포 주변부에서 수지상 액틴의 탈중합으로 인해 발생할 수 있으며 lamellipodial 리딩 에지를 개발하고 돌출부가 세포 외 매트릭스 및 기타 세포의 유연성을 감지하고 이동 방향을 결정할 수있게하는 데 중요합니다^6,7,8 . 기질에 부착 할 수없는 세포 가장자리 돌출부는 말초 막 프릴, 라멜리 포디아 및 라멜라의 복부 표면에 나타나는 시트형 구조를 형성하고 이동 방향에 따라 뒤로 움직입니다. 라멜리포디움이 기판에 부착되지 않으면 그 아래에 후부 라멜리포디움이 형성되어 첫 번째 라멜리포디움을 상부 복부 표면쪽으로 기계적으로 밀어 넣습니다. 이전에 기질과 평행했던 프릴의 액틴 필라멘트는 이제 그것에 수직이되고, 프릴은 이제 전진하는 라멜리 포디움 위에 위치합니다. 뒤로 움직이는 프릴은 시토졸로 다시 떨어지며 라멜리포디얼 액틴^9,10을 재활용하기 위한 세포 메커니즘을 나타낸다.

여기에서, 우리는 세포 가장자리 돌출 역학의 측정을 위한 검정을 기술한다. 돌출 분석은 시간 경과 비디오 현미경을 사용하여 세포의 확산 단계 동안 10 분 동안 단일 세포 가장자리 돌출 역학을 측정합니다. 돌출 역학은 이러한 영화에서 kymographs를 생성하여 분석됩니다. 원칙적으로, 키모그래프는 시공간 플롯에서 움직이는 입자에 대한 상세한 정량적 데이터를 제공하여 세포 가장자리 역학에 대한 질적 이해를 제공합니다. 움직이는 파티클의 강도는 시간 대 공간 플롯의 모든 이미지 스택에 대해 플롯되며, 여기서 X축과 Y축은 각각 시간과 거리를 나타냅니다¹¹. 이 방법은 ImageJ와 함께 수동 키모그래프 분석을 사용하여 상세한 정량적 데이터를 얻고, 낮은 신호 대 잡음비 및/또는 높은 피처 밀도의 경우 영화 및 이미지에서 정보를 검색하고, 위상차 광 현미경 또는 열악한 이미지 품질로 획득한 이미지를 분석할 수 있습니다.

본원에 기재된 세포-가장자리 돌출 역학 분석은 빠르고, 간단하고, 비용 효율적인 방법이다. 이와 같이, 그리고 세포 이동^11,12과 직접적으로 상관관계가 있는 것으로 밝혀졌기 때문에^, 더 많은 자원-요구되는 방법들을 수행하기로 결정하기 전에 세포 운동성에 관여하는 세포골격 역학을 시험하기 위한 예비 방법으로서 사용될 수 있다. 또한, 그것은 또한 세포 골격 단백질의 유전자 조작 (녹아웃, 녹다운 또는 구조 구조)이 간단한 플랫폼을 사용하여 세포 골격 역학에 어떻게 영향을 미치는지에 대한 정량적 측정을 가능하게합니다. 이 분석은 세포 이동의 맥락에서 세포골격 역학을 탐구하기위한 유익한 모델이며 세포 운동성의 기초가되는 메커니즘과 분자의 해명에 사용될 수 있습니다.

프로토콜

이 프로토콜에 설명 된 모든 방법은 Bar-Ilan University의 IACUC (Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았습니다.

참고: 이 절에서 설명하는 절차의 단계별 그래픽 묘사가 그림 1에 나타납니다.

1. 세포 배양

참고: 프로토콜에 사용된 세포는 야생형 C57BL/6 마우스의 E11.5-13.5 배아로부터 생성된 마우스 배아 섬유아세포(MEFs)이다. 일차 MEF는 잭스 실험실 프로토콜¹³에 따라 생성되었다. 다섯 개의 상이한 배아로부터의 세포를 함께 풀링하고, SV40 큰 T 항원을 발현하는 레트로바이러스 벡터로의 감염에 의해 불멸화시키고, 이어서 3주 동안 4 mM 히스티디놀로 선별하였다.

1. 세포를 1 g/L 글루코스, 1% 글루타민, 1% 페니실린-스트렙토마이신 및 10% 소 태아 혈청(FBS)을 함유하는 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)을 함유하는 조직 배양 플레이트에서 37°C에서 5% _CO2 가 있는 가습 배양기에서 배양한다.
2. 세포를 90%-95% 컨플루언시가 될 때까지 배양하고, 2-3일마다 1:5의 비율로 분할한다.

2. 유리바닥 접시 코팅

참고 : 유리 바닥 접시 코팅은 멸균 상태의 조직 배양 후드에서 수행되어야합니다.

1. 2 mL의 1N HCl 용액을 유리 바닥 접시 (재료 표)의 중앙에 첨가하고 실온 (RT)에서 20 분 동안 인큐베이션하십시오.
   참고: 이 단계는 나중에 이미징을 방해할 수 있는 잔여물을 유리에서 제거하기 위한 것입니다.
2. 유리 바닥 접시를 각각 2 mL의 1x PBS (표 자료)로 세 번 세척한다.
3. 피브로넥틴( 표 표 참조)을 1x PBS에서 10 μg/mL로 희석한다. 희석된 피브로넥틴 용액 200 μL를 접시의 유리 중앙에 첨가한다. 37°C(조직 배양 배양기)에서 1시간 동안 배양한다.
   참고: 대안적으로, 유리-바닥 디쉬는 평평한 표면 상에서 4°C에서 밤새 인큐베이션될 수 있다.
4. 피브로넥틴 코팅 인큐베이션 시간 동안, 1x PBS 중의 1% BSA (Table of Materials) 용액을 제조하고, 0.2 μm를 통해 여과하고, 예비가온된 수조에서 30분 동안 70°C에서 인큐베이션함으로써 변성시켰다.
5. 코팅된 유리 바닥 접시를 각각 2 mL의 1x PBS로 세 번 세척한다.
6. 변성된 BSA 용액 2 mL를 유리 중앙에 첨가하고, 37°C(조직 배양 인큐베이터)에서 1시간 동안 인큐베이션한다.
   참고: 대안적으로, 유리-바닥 디쉬는 평평한 표면 상에서 4°C에서 밤새 인큐베이션될 수 있다.
7. 유리 바닥 접시를 각각 2 mL의 1x PBS로 3회 세척한다.
   참고 : 피브로넥틴으로 유리 바닥 접시의 배양은 표면을 적절하게 코팅하기 위해 37 °C에서 적어도 1 시간 동안 수행되어야합니다. 더 짧은 인큐베이션 시간은 적절한 코팅을 생성하지 않을 수 있고, 그 결과, 세포 표현형은 인테그린 활성화와 관련되지 않을 수 있다. BSA 층은 불활성이며 돌출 역학에 영향을 미치지 않으며 인테그린 비의존성 세포 부착을 위한 자유 전위 부위를 차단하기 위한 것이다. BSA는 세포 에지 역학에 영향을 줄 수 있는 세포 아폽토시스를 유도하지 못하도록 코팅 전에 변성되어야 합니다.

3. 영상화를 위한 세포의 제조

1. 실험 16 내지 열여덟 시간 전에, 세포를 플레이트화하여 다음 날에 70%-80% 합류에 도달한다. MEFs의 경우, 실험을 수행하기 하루 전에 직경 10 cm 조직 배양 플레이트 당 0.7 x ¹⁰⁶ 세포를 플레이트에 플레이트한다.
   참고 : 성공적인 돌출 실험을 위해서는 세포가 대수 성장 단계에서 사용되는 것이 중요합니다. 이를 달성하기 위해 세포는 실험 당일 70 % -80 % 합류에 도달해야합니다. 세포의 밀도가 높을수록 실험 동안 더 긴 확산 시간 및/또는 부착 장애를 초래할 것이다.
2. 실험 당일에, 직경 10 cm 조직 배양 플레이트 당 트립신 용액 2 mL (Table of Materials)를 첨가하고, 세포가 분리될 때까지 조직 배양 배양기에서 2-3분 동안 인큐베이션한다. 트립신을 5 mL의 완전한 배지를 첨가하여 비활성화하십시오.
3. 상기와 같이 코팅된 유리 바닥 접시 상에서 완전한 배지 2 mL의 혈구측정기 및 플레이트 20,000 세포를 사용하여 세포를 계수한다(섹션 2).
   참고: 도금을 위한 세포의 수는 세포의 크기 및 유형에 달려 있습니다. 더 크거나 더 많은 확산 세포의 경우, 이미징을 위한 충분한 세포를 갖도록 10,000개의 세포만 플레이트화하십시오. 세포 대 세포 접촉이 세포 내재적 확산 거동을 변화시킬 수 있기 때문에 만지지 않는 단일 세포를 선택하는 것이 중요합니다.
4. 조직 배양 인큐베이터에서 플레이팅된 세포와 함께 유리 바닥 접시를 15분 동안 인큐베이션한다.
   참고 :이 단계에서 세포는 피브로넥틴 기질에 부착되어 그 위로 퍼집니다. 세포 확산 동안 돌출부를 측정 할 때, 세포는 도금 후 및 이미징 전에 15 분 동안 확산되도록 허용해야합니다. 이미징은 도금 후 15 분에서 ~ 1 시간 사이의 시간 창 내에서 수행 할 수 있으며 어떤 경우에도 세포가 이동하기 전에 수행 할 수 있습니다.

4. 현미경 설정 및 이미징

참고: 다양한 라이브 셀 현미경 시스템을 사용할 수 있습니다. 여기에 사용 된 시스템은 CO2 및 가열 장치가 장착 된 라이카 AF6000 반전 현미경이며 ORCA-Flash 4.0 _V2 디지털 CMOS 카메라에 부착되어 있습니다.

1. 이미징 전에 적어도 1 시간 전에 가열 장치를 켜고 37 °C로 설정하십시오.
2. 이미징 최소 10분 전에 CO2 장치를 켜고 5% _CO2로 설정합니다.
3. 현미경, 카메라 및 컴퓨터를 켭니다.
4. 현미경 수집 소프트웨어를 엽니다( 자료 표 참조). 캡처한 이미지를 저장할 폴더를 선택하고 파일 이름을 입력합니다. 모든 동영상을 새 파일로 저장합니다.
5. 40x 드라이 렌즈, 위상 대비에 배율을 설정합니다. 시간 간격을 5초로 설정하고 총 동영상 지속 시간은 10분입니다.
6. 도금된 세포를 15분 동안 배양한 후, 부착된 세포가 있는 유리 바닥 접시를 어댑터에 넣고 고정시킨다. 접시가있는 어댑터를 현미경 단계의 슬롯에 삽입하십시오.
7. 접시 덮개를 벗고 대신 _CO2 뚜껑을 놓습니다. CO2 밸브_를 엽니다.
   참고: _CO2 커버를 유리 바닥 접시 위에 놓기 전에 깨끗한지 확인하십시오. 더러운 커버는 영화의 품질을 떨어 뜨립니다. 보풀이 없는 물티슈로 _CO2 뚜껑의 아래쪽을 70% 에탄올로 닦아 먼지와 먼지를 제거합니다. 보풀이 없는 마른 물티슈로 두 번 닦으십시오.
8. 세포를보고 이미징에 적합한 세포를 찾으십시오. 셀에 초점이 맞춰져 있는지 확인하고 동영상 가져오기를 시작합니다.

5. 이미지 분석

참고: 이미지 분석은 다음과 같이 ImageJ(재료 테이블)를 사용하여 수행됩니다.

1. ImageJ에서 획득한 동영상을 엽니다.
2. 주 도구 모음에서 직선 도구를 사용하여 그림 2A와 같이 라멜라와 셀 가장자리를 포함한 돌출부에 수직인 20개의 임의 단위로 구성된 여덟 줄을 45°마다 방사형 배열로 만듭니다.
3. 기본 도구 모음에서 이미지 > 스택 > 다시 슬라이스로 이동합니다. 이것은 세포막 내의 단일 점의 이동을 설명하는 키모그래프 사진을 산출할 것이다(도 2B). 이 작업은 여덟 줄 중 모든 줄에 대해 별도로 수행해야합니다.
4. 각각의 키모그래프 이미지로부터 격자선으로 표시된 셀 내의 여덟 영역 각각에서 돌출부, 수축 및 프릴의 수를 추출하고 수동으로 카운트한다. 이 숫자는 10분 당 돌출부, 수축 및 주름의 빈도를 나타냅니다(그림 2C, D).
   참고 : Ruffles는 위상차 현미경에서의 어두운 모양과 세포 가장자리에서 시작하여 획득 한 영화에서 관찰 할 수있는 세포 몸체의 경계에서 끝나는 구심 운동에 따라 다른 구조와 구별 될 수 있습니다. 참고로, 돌출부, 후퇴 및 프릴 주파수를 정량화 할 때 영화는 정량화를위한 컨트롤로, 특히 프릴을 정의하기위한 컨트롤로 관찰되어야합니다.
5. 돌출부 지속성, 거리 및 속도를 kymography 분석을 통해 결정합니다. 생성된 각 키모그래프에 대해 X축은 거리를 나타내고 Y축은 시간을 나타냅니다.
6. 돌출 거리를 측정하려면 5.6.1-5.6.2단계를 따르십시오.
   1. 돌출부의 기저부에서 돌출부의 가장 높은 피크까지 수직 선을 그립니다. ImageJ에서 M을 눌러 선의 길이를 픽셀 단위로 측정합니다.
   2. 길이를 픽셀에서 μm로 변환하려면 픽셀 대 μm 비율이 알려져 있는지 확인하십시오.
      참고: μm 대 픽셀 비율은 CCD 카메라의 픽셀의 물리적 길이/총 배율입니다. 픽셀 크기는 각 카메라 유형의 특징입니다. 예를 들어,이 연구에 사용 된 카메라의 경우 픽셀 크기는 6.5 μm x 6.5 μm이고 물리적 길이는 6.5 μm이며 우리가 사용한 배율은 40x입니다. 따라서 카메라의 μm 대 픽셀 비율은 0.1625 μm / 픽셀입니다. 분석에서 30픽셀 길이의 선에 대해 돌출 거리는 30픽셀 x 0.1625μm/pixel = 4.875μm가 됩니다(그림 3).
7. 돌출 시간(지속성, 돌출부가 후퇴하기 전에 돌출된 시간을 보내는 시간)을 측정하려면 5.7.1-5.7.2단계를 따르십시오.
   1. 돌출부의 시작 부분(왼쪽에서 오른쪽)부터 가장 높은 피크의 영역까지 수평선을 그립니다. ImageJ에서 M 을 눌러 선의 길이를 픽셀 단위로 측정합니다.
   2. 길이를 픽셀에서 분으로 변환하려면 픽셀을 최소 비율로 계산합니다. 이 값은 이미지 사이의 간격에 따라 다릅니다.
      참고: 이 예에서 이미지 사이의 간격은 5초, 최소/픽셀 비율은 0.0833, 수평선 길이는 8픽셀입니다. 따라서 돌출 시간은 8픽셀 x 0.0833분/픽셀 = 0.6664분입니다.
8. 돌기의 피크가 오른쪽의 베이스에 있는 곳에서 돌출부의 기저부에서 수평으로 그려진 선에 대한 돌출 시간과 유사하게 후퇴 시간을 측정하고 계산한다( 그림 3의 선 X2).
9. 돌출 거리를 돌출 시간으로 나누어 돌출 속도를 계산합니다. 돌출 거리를 후퇴 시간으로 나누어 후퇴 속도를 계산합니다. 이 예에서 돌출 속도는 4.875μm/0.6664min = 7.315μm/min.로 계산되며, 시간을 나타내는 선의 길이가 동일하기 때문에 후퇴 속도는 동일합니다.
   참고: 상이한 세포 유형, 즉 야생형을 발현하는 세포와 동일한 단백질의 돌연변이 구조를 비교할 때, 블라인드 분석을 수행하는 것이 필수적이므로 편향이 도입되지 않습니다.

결과

도 2에 기술된 실험에서, 불멸화된 MEFs를 피브로넥틴으로 사전 코팅된 유리 바닥 접시에 플레이팅하여 인테그린 매개 신호전달을 활성화시키고, 변성된 BSA에 의해 차단하여, 인테그린 활성화에 의존하지 않는 세포 부착을 위한 자유 전위 부위를 차단하였다. 실험 당일에 세포의 70%-80% 합류에서 대수 성장 단계에 도달하기 위해, 0.7 x 106 MEFs를 실험 ¹⁶ h 전에 10 cm 직경?...

토론

돌출부, 수축 및 주름으로 구성된 세포 가장자리 돌출 역학은 세포 운동성에서 전제 조건이자 잠재적 인 속도 제한 사건입니다. 여기에서는 확산 중 세포 가장자리 돌기의 역학을 측정하기위한 빠르고 간단한 방법을 설명합니다. 이 방법은 단시간 이미징을 가능하게 하고, 상당한 양의 데이터를 생성하며, 세포의 형광 표지 또는 고가의 형광 현미경 검사 장비를 필요로 하지 않으며, 더 많은 자원?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm cell culture plates	Greiner	P7612-360EA
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A7906
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Biological Industries, Israel	01-055-1A	Medium contains high glucose (4.5 g/L D-glucose)
Dulbecco’s phosphate buffered saline (1xDPBS)	Biological Industries, Israel	02-023-1A
Fetal bovine serum (FBS)	Biological Industries, Israel	04-001-1A
Fibronectin from human plasma, liquid, 0.1%, suitable for cell culture	Sigma-Aldrich	F0895
Glass bottom dishes	Cellvis	D35-20-1.5-N	35mm glass bottom dish, dish size 35 mm, well size 20mm, #1.5 cover glass (0.16-0.19 mm).
ImageJ software	NIH		Feely available at: https://imagej.nih.gov/ij/download.html
LAS-AF Leica Application Suite 3.2			Microscope acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS
Leica AF6000	Leica		Inverted bright field microscope (40x, NA 1.3 ) equipped with phase-contrast optics, an incubator, and CO2 unit with LAS AF acquisition software equipped with an ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera .
L-glutamine solution	Biological Industries, Israel	03-020-1B
ORCA-Flash 4.0 V2 digital CMOS camera	Hamamatsu Photonics
Penicillin-streptomycin solution	Biological Industries, Israel	03-031-1B
Trypsin-EDTA solution B (0.25%), EDTA (0.05%)	Biological Industries, Israel	03-052-1A