פרוטוקול לפיתוח מודל אוסטאוטומיה של עצם הירך בחולדות ויסטאר אלבינו

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשבר יאטרוגני של פיר עצם הירך של חולדות לבקנים Wistar ומעקב אחר התפתחות היבלת. מודל זה של אוסטאוטומיה של עצם הירך יכול לסייע לחוקרים להעריך את תהליך ריפוי השבר ולחקור כיצד תרופה יכולה להשפיע על ריפוי שברים.

Abstract

ריפוי שברים הוא תהליך פיזיולוגי המביא להתחדשות פגמים בעצמות על ידי פעולה מתואמת של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים. לתרופות אוסטאואנבוליות יש פוטנציאל להגביר את תיקון השברים, אך יש להן אילוצים כמו עלויות גבוהות או תופעות לוואי לא רצויות. פוטנציאל ריפוי העצם של תרופה יכול להיקבע בתחילה על ידי מחקרים במבחנה , אך מחקרי in vivo נדרשים להוכחת ההיתכנות הסופית. מטרתנו הייתה לפתח מודל מכרסם אוסטאוטומיה של עצם הירך שיוכל לסייע לחוקרים להבין את התפתחות היווצרות היבלות בעקבות שבר בפיר עצם הירך, ושיוכל לעזור לקבוע אם לתרופה פוטנציאלית יש תכונות ריפוי עצם. חולדות לבקנים זכרים בוגרים של Wistar שימשו לאחר אישור ועדת האתיקה של בעלי החיים המוסדיים. המכרסמים הורדמו, ובתנאים אספטיים נוצרו שברים רוחביים שלמים בשליש האמצעי של פירי עצם הירך באמצעות אוסטאוטומיה פתוחה. השברים צומצמו וקובעו פנימית באמצעות חוטי K תוך-מדולריים, וריפוי שברים משני הותר להתרחש. לאחר הניתוח, משככי כאבים intraperitoneal ואנטיביוטיקה ניתנו במשך 5 ימים. צילומי רנטגן שבועיים רציפים העריכו היווצרות יבלות. החולדות הוקרבו על סמך נקודות זמן רדיולוגיות שנקבעו מראש, והתפתחות יבלת השבר נותחה באופן רדיולוגי ובאמצעות אימונוהיסטוכימיה.

Introduction

עצם היא רקמת חיבור צפופה המורכבת מתאים יוצרי עצם, אוסטאובלסטים, ותאים סופגי עצמות, האוסטאוקלסטים. ריפוי שברים הוא תהליך פיזיולוגי המביא להתחדשות פגמים בעצמות על ידי פעולה מתואמת של אוסטאובלסטים ואוסטאוקלסטים¹. כאשר יש שבר, פעילות אוסטאובלסטית ואוסטאוקלסטית באתר השבר הם חלק מהגורמים החשובים הקובעים את ריפוי העצם². כאשר ריפוי שברים חורג ממסלולו הרגיל, הוא גורם לעיכוב באיחוד, אי-איחוד או אי-איחוד. שבר אמור להיות ב- nonunion כאשר יש כשל של איחוד של השבר במשך 9 חודשים, ללא התקדמות של תיקון ב 3 החודשים האחרונים³. כ-10%-15% מכלל השברים חווים עיכוב בתיקון שעלול להתקדם^{ל-nonunion 4}. שיעור אי-האיחוד של כל השברים הוא 5%-10% ומשתנה בהתאם לעצם המעורבת ולאתר השבר⁵.

המשטר הנוכחי לטיפול בשברים כולל שיטות כירורגיות ו/או רפואיות. נכון לעכשיו, עיכוב או nonunion של שברים ניתן להתגבר על ידי אסטרטגיות כירורגיות כמו השתלת עצם. עם זאת, להשתלת עצם יש מגבלות וסיבוכים כמו זמינות של רקמת השתל, כאבים באתר התורם, תחלואה וזיהום⁶. הטיפול הרפואי כולל תרופות אוסטאואנאבוליות כמו חלבון מורפוגנטי של העצם (BMP) וטריפראטיד (אנלוגי פאראטמונרלי). לחומרים אוסטאואנבוליים הנמצאים בשימוש כיום יש פוטנציאל להגביר את תיקון השברים אך יש להם אילוצים כמו עלויות מופקעות או תופעות לוואי לא רצויות⁷. לפיכך, יש מקום לזיהוי חלופות חסכוניות ולא כירורגיות לריפוי עצם. פוטנציאל ריפוי העצם של תרופה יכול להיקבע בתחילה על ידי מחקרים במבחנה , אך מחקרי in vivo נדרשים להוכחת ההיתכנות הסופית. תרופה הידועה כמשפרת את ריפוי העצם צריכה לעבור הערכה במבחנה , ואם היא נמצאת מבטיחה, ניתן להשתמש בה למחקרי מודל של חיות in vivo . אם התרופה תוכיח שהיא מקדמת היווצרות עצם ושיפוץ מחדש במודל in vivo , היא תוכל להמשיך לשלב הבא (כלומר, ניסויים קליניים).

הערכת ריפוי שברים בבעלי חיים היא צעד הגיוני קדימה כדי להעריך סוכן חדש שהוכנס לריפוי עצם לפני שהוא עובר ניסויים בבני אדם. עבור מחקרי מודל בעלי חיים in vivo של ריפוי שברים, מכרסמים הפכו למודל⁸ פופולרי יותר ויותר. דגמי המכרסמים עוררו עניין הולך וגובר בשל עלויות התפעול הנמוכות, הצורך המוגבל במקום ופחות זמן הדרוש לריפוי עצם⁹. בנוסף, למכרסמים יש ספקטרום רחב של נוגדנים ומטרות גנטיות, המאפשרים מחקרים על המנגנונים המולקולריים של ריפוי והתחדשות עצם¹⁰. ישיבת קונצנזוס הדגישה באופן מקיף מודלים שונים לריפוי עצמות של בעלי חיים קטנים והתמקדה בפרמטרים השונים המשפיעים על ריפוי העצם, כמו גם בדגש על מספר מודלים של שברים ושתלים של בעלי חיים קטנים¹¹.

ניתן לחלק את מודלי השבר הבסיסיים באופן רחב למודלים פתוחים או סגורים. מודלים של שבר סגור משתמשים בכוח כיפוף של שלוש או ארבע נקודות על העצם ואינם דורשים גישה כירורגית קונבנציונלית. הם מובילים לשברים אלכסוניים או ספירליים, הדומים לשברים ארוכים בעצמות בבני אדם, אך היעדר סטנדרטיזציה של מיקום השבר ומממדיו עשוי לשמש גורם מבלבל בהם¹². מודלים של שבר פתוח דורשים גישה כירורגית לאוסטאוטומיה של העצם, עוזרים להשיג דפוס שבר עקבי יותר באתר השבר, אך קשורים להחלמה מאוחרת בהשוואה למודלים הסגורים¹³. הבחירה בעצם המשמשת לחקר ריפוי שברים נותרה בעיקר השוקה ועצם הירך בשל מידותיהם ונגישותם. הבחירה של אתר השבר היא בדרך כלל diaphysis או metaphysis. האזור המטאפיזיאלי נבחר במיוחד במקרים בהם ריפוי שברים נלמד בנושאים אוסטאופורוטיים, שכן המטאפיזה מושפעת יותר מאוסטאופורוזיס¹⁴. ניתן להשתמש במספר שתלים כמו פינים תוך-מדולריים וקיבועים חיצוניים כדי לייצב את השבר^11,15.

מטרת המחקר הייתה לפתח מודל מכרסמים פשוט וקל למעקב, שיוכל לסייע לחוקרים לא רק להבין את התפתחות היבלת בעקבות שבר בעצם הירך, אלא גם לסייע לקבוע אם לתרופה פוטנציאלית יש תכונות ריפוי עצם על ידי הבנת המנגנון שבאמצעותו היא פועלת.

Protocol

ניסויים בבעלי חיים נעשו לאחר קבלת אישור אתי מהוועדה המוסדית לאתיקה בבעלי חיים (IAEC), AIIMS, ניו דלהי, הודו (286/IAEC-1/2021).

1. הליך טרום ניתוחי

1. בית זכר Wistar חולדות לבקנים 6-8 שבועות של גיל, במשקל בין 150-200 גרם כל אחד, במתקן בעלי חיים מרכזי (CAF) בכלובים נפרדים. זה מבטיח שלא תהיה פגיעה באתר הניתוח/שבר כאשר חולדות מרובות חולדות חולקות כלובים.
2. יש לשמור על החולדות בטמפרטורה של 23°C ±-2°C בסביבה מבוקרת לחות עם לחות יחסית של 50% ±-5%, לחשוף אותן למחזור חושך/אור של 12 שעות, ולתת גישה למזון (תזונה חצי סינתטית סטנדרטית): דיאטת גלולות (יבשה) ומים. הרכב הדיאטה הסינתטית למחצה הסטנדרטית הוא כדלקמן: קמח גרם בנגלי קלוי (60%), קמח חיטה (22%), קזאין (4%), אבקת חלב רזה (5%), שמן מזוקק (4%), תערובת מלח עם עמילן (4.8%), ותערובת ויטמין כולין עם עמילן (0.2%).
3. התאקלמו את החולדות לתקופה של לפחות 48 שעות לפני הניתוח.
4. שקלו כל חולדה בסולם שקילה דיגיטלי ושימו לב למשקל.
5. מתן זריקות תוך-צפקיות (IP) של צפורוקסים (100 מ"ג/ק"ג משקל גוף), טרמדול (25 מ"ג/ק"ג משקל גוף) ושילוב של קטמין (75 מ"ג/ק"ג משקל גוף) עם קסילזין (10 מ"ג/ק"ג משקל גוף) לחולדות 15 דקות לפני תחילת ההליך הכירורגי. יש למרוח משחת עיניים על שתי העיניים כדי למנוע יובש בעין.
6. יש להסיר את השיער מהגפה התחתונה הימנית, מאזור האגף ועד למפרק הברך, עם מריחה חיצונית של קרם להסרת שיער.
   הערה: ניתן לאסוף דם (0.5 מ"ל) מווריד הזנב של כל חולדה לצורך ניתוח בסיסי של פרמטרים שונים. ניתן לאסוף דם שוב כל שבועיים לאחר הניתוח.

2. הליך כירורגי ליצירת שבר רוחבי מלא באמצעות אוסטאוטומיה פתוחה

הערה: השתמש בחדר ניתוח ייעודי עם שולחן ניתוחים וטמפרטורת סביבה אופטימלית (26°C) לביצוע ההליך.

1. מניחים את גוש השעווה (מגש אלומיניום 30 ס"מ על 30 ס"מ על 4 ס"מ המכיל שעווה עד עומק של 2.5 ס"מ) על שולחן הניתוחים ומכסים אותו בווילונות סטריליים. בלוק השעווה מונע כל שינוי בתנוחת החיה במהלך הניתוח.
2. אשר את תחילת ההרדמה (על ידי בדיקת אובדן צביטה בבוהן). מניחים את החולדה המורדמת על וילון סטרילי במצב צדדי שמאלי. בקשו מעוזר להחזיק את הגפה התחתונה הימנית (ברך וירך) בהארכה. שמור על תמיכה קשה סטרילית (גוש שיש) מתחת לרגל ימין כדי לתמוך בעצם הירך. נקה את האתר הכירורגי עם אלכוהול ובטאדין.
3. להזריק הרדמה מקומית (0.25 מ"ל של 1% ליגנוקאין) באתר החתך (היבט צדדי של ירך ימין), לחתוך חור בווילון סטרילי אחר, ולחשוף רק את רגל ימין של החולדה דרכו לניתוח.
4. יש לתת חתך עור אנכי של 1 ס"מ בצד הצדדי של ירך ימין, ולהאריך אותו לפי הצורך עם להב כירורגי מס' 15.
5. חשוף את שריר הווסטוס לטרליס על ידי הפרדת החיתולית העמוקה באמצעות מספריים של מצנבאום. פיצול vastus lateralis בקנה אחד עם סיבי השריר באמצעות מלקחיים עורקים עד פיר של עצם הירך הוא הגיע.
6. שחררו את העצם מהשרירים המחוברים אליה באמצעות המעלית הפריוסטאלית.
7. להזריק הרדמה מקומית (0.2 מ"ל של 1% ליגנוקאין) בתוך ומסביב לפריוסטאום כדי למנוע רפלקס vasovagal.
8. צור כניסה בשליש האמצעי של פיר עצם הירך באמצעות להב כירורגי מספר 15, ושבר את העצם בשליש האמצעי של הפיר (שבר שלם) על ידי הנחת אזמל על הכניסה שנעשתה (כך שהאזמל לא יחליק) והקשה עדינה על האזמל עם פטיש. השתמש בתמיכה הקשה הסטרילית (גוש שיש) כדי לתמוך בעצם תוך כדי שבירתה כדי להבטיח שבר נקי.
   הערה: התמיכה הקשה הסטרילית בדרך כלל אינה גורמת לפגיעה משמעותית בשרירים שמתחת.
9. לתקן את השבר באופן פנימי באמצעות חוט K סטרילי (1.0 מ"מ) המוחזק בעזרת מקדחה כוח המופעלת על ידי סוללה. מעבירים את חוט ה- K לתעלה המדולרית של השבר הדיסטלי דרך אתר השבר. לאחר מכן, קדחו את חוט ה-K דרך הקצה הדיסטלי של עצם הירך באמצעות מקדח הכוח המופעל באמצעות הסוללה.
   הערה: יש לחטא את פני השטח של מקדחת החשמל באלכוהול לפני השימוש. החלף כפפות לאחר תיקון חוט K.
10. לאחר הפחתת השבר, לקדם את חוט K מן הקצה הדיסטלי לתוך התעלה של שבר פרוקסימלי עד שהוא מקבל רכישה באזור trochanteric. חותכים את החלק הדיסטלי של חוט K הבולט דרך העור באמצעות חותך חוטים.
11. כופפו את קצה חוט ה-K לכ-90° באמצעות צבתות והשתמשו בתחבושת גזה ספוגה בבטאדין לחבישת סיכות. חוט K פועל כמו סד intramedullary לשמירה על השבר במצב מופחת.
12. הקפידו על המוסטזיס מלא לפני סגירת העור באמצעות תפר ניילון 3-0. הפעל לחץ על אזור הדימום באמצעות גזה סטרילית או מלקחיים עורקים כדי לעצור כל דימום.
13. נקה את הפצע עם betadine, ולכסות אותו עם גזה סטרילית סרט דבק micropore.

3. טיפול לאחר הניתוח

1. להחזיר את החולדות לכלובים שלהן, לאפשר אמביציה רגילה, ולהמשיך לתת דיאטה חצי סינתטית סטנדרטית עד להקריב אותם, כמו גם אנטיביוטיקה (הזרקת cefuroxime 100 מ"ג / ק"ג) ומשככי כאבים (הזרקת טרמדול 25 מ"ג / ק"ג / יום בשתי מנות מחולקות) intraperitoneally במשך 5 ימים לאחר ההליך.
   הערה: ניתן לחלק את החולדות לקבוצות טיפול וביקורת כדי לבדוק תרופה מסוימת. אם התרופה מסיסה במים, ניתן לתת אותה דרך הפה באמצעות gavage. ניתן לציין את משקלם של בעלי החיים הבודדים כדי לחשב את מינון התרופה לשימוש. ניתן לעקוב אחר קריטריוני הכללה והדרה כדי להבטיח הומוגניות של קבוצות בעלי החיים.
2. לשכן את בעלי החיים בכלובים בודדים בתנאים דומים לתקופה שלפני הניתוח. בדוק את האתר כירורגי כל יום כדי לחפש סימנים של כאב לאחר הניתוח, זיהום פצע, החלקה של תפרים, או כל נפיחות בבטן או אי נוחות.
3. להעריך את ריפוי העצם על ידי צילום רנטגן של האתר השבור פעם בשבוע.

4. הליך רדיולוגי

1. לפני צילום הרנטגן, מרדימים את החולדות בזריקה תוך-צפקית של קטמין (50 מ"ג/ק"ג משקל גוף) וקסילזין (5 מ"ג/ק"ג משקל גוף).
2. שמור על מפרק הירך של החולדה במצב מכופף וחטוף בעוד מפרק הברך נשמר חצי מכופף כדי לקחת את צילום הרנטגן של האיבר השבור עם הגדרות החשיפה הבאות: Ref. kVp ≈ 62; Ref. mAS = 6.4; והגדרות חשיפה אוטומטיות (Ref. mA=160).
   הערה: צילומי רנטגן נלקחו בנקודת ההתחלה (יום אחד לאחר הניתוח) ולאחר מכן פעם בשבוע עד להקרבה או 5 שבועות.

5. המתת חסד של בעלי חיים ושליפת יבלות

1. הקריבו את החולדות על ידי מנת יתר של פחמן דו חמצני (מתן 100% CO₂ בקצב זרימה של 7-8 ליטר לדקה למשך דקה אחת, ולאחר מכן תקופת המתנה של 4-5 דקות), בשתי נקודות זמן שנקבעו קודם לכן, בהתבסס על המראה הרדיולוגי של יבלות גישור רכות וקשות, בהתאמה.
2. חותכים את העור במקביל לעצם הירך ומפרידים בזהירות את השרירים העליונים כדי למנוע נזק לרקמת היבלת.
3. שבר את העצם בין מפרק הירך לרקמת היבלת באמצעות פטיש ואזמל. באופן דומה, שברו את העצם בין היבלת למפרק הברך. הסר את חוט K ונקה את חתיכת העצם במלח כדי להסיר קרישי דם ורקמות רכות.
4. מעבירים את היבלת מיד למיכל עם 10% פורמלין נאגר ניטרלי (20 מ"ל לדגימה) ושומרים אותו למשך 3 ימים בטמפרטורת החדר (RT).

6. Decalcification של רקמת העצם והיבלות

1. קח את רקמת היבלת מפורמלין ושמור אותה ב- RT בתמיסת ETDA של 20%, pH 7, לצורך פירוק רקמת העצם.
2. החלף תמיסת EDTA טרייה כל יומיים במשך כ -3 שבועות, ובדוק את פירוק העצם על ידי ניקוב העצם עם מחט מבלי להפריע לרקמת היקולוס. decalcification אופטימלי מסומן על ידי אובדן של תחושה מחוספסת נורמלית של רקמת העצם.
3. לאחר decalcification מלא, לחתוך את החלק sagittal של היבלת ולהכין בלוקים פרפין של רקמת יבלת. חותכים קטעים בעובי 4 מיקרומטר של רקמת היבלת להיסטופתולוגיה¹⁶ וכל ניתוח השוואתי אחר¹⁷.

תוצאות

מחקר זה נערך כדי לפתח מודל של אוסטאוטומיה של עצם הירך בחולדות לבקנים של Wistar. מודל זה יכול לשמש להערכת ריפוי עצם, כמו גם את ההשפעה האוסטאוגנית של תרופה אוסטאואנאבולית מבטיחה בריפוי עצם. אמצעי זהירות ופרוטוקולים כירורגיים סטנדרטיים ננקטו. חלוקים סטריליים, וילונות וציוד כירורגי שימשו להליך (...

Discussion

שיטה זו מתארת בבהירות את הפרטים הדרושים לפיתוח מודל אוסטאוטומיה של שבר בחולדות לבקנים של Wistar. מודל זה יכול לשמש כדי להעריך את ההשפעה האוסטאוגנית של תרופה אוסטאואנבולית מבטיחה בריפוי שברים, כמו גם להבין את המורכבות של ריפוי עצם. התכונה הבולטת של שיטה זו היא שהיא פשוטה ואינה זקוקה ליותר מדי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2