Wistar 알비노 쥐에서 대퇴골 절골술 모델을 개발하기 위한 프로토콜

요약

여기에서 우리는 Wistar 흰둥이 쥐의 대퇴골 축을 의원 발생 적으로 파괴하고 굳은 살의 발달에 대한 후속 조치를 취하는 프로토콜을 제시합니다. 이 대퇴골 절골술 모델은 연구자들이 골절 치유 과정을 평가하고 약물이 골절 치유에 어떤 영향을 미칠 수 있는지 연구하는 데 도움이 될 수 있습니다.

초록

골절 치유는 조골 세포와 파골 세포의 조정 된 작용에 의해 뼈 결함을 재생시키는 생리적 과정입니다. 골동화 작용 약물은 골절 복구를 강화할 가능성이 있지만 높은 비용이나 바람직하지 않은 부작용과 같은 제약이 있습니다. 약물의 뼈 치유 잠재력은 처음에는 시험관 내 연구에 의해 결정될 수 있지만 최종 개념 증명을 위해서는 생체 내 연구가 필요합니다. 우리의 목표는 연구자들이 대퇴골 축 골절 후 굳은 살 형성의 발달을 이해하는 데 도움이 될 수 있고 잠재적 약물이 뼈 치유 특성을 가지고 있는지 여부를 확인하는 데 도움이 될 수 있는 대퇴골 절골술 설치류 모델을 개발하는 것이었습니다. 성체 수컷 Wistar 흰둥이 쥐는 기관 동물 윤리위원회 승인 후 사용되었습니다. 설치류는 마취되었고, 무균 조건 하에서, 대퇴골 축의 중간 1/3에서 완전한 횡단 골절이 개방 절골술을 사용하여 생성되었다. 골절은 골수 내 K- 와이어를 사용하여 축소되고 내부적으로 고정되었으며 2 차 골절 치유가 이루어 졌다. 수술 후 복강 내 진통제와 항생제를 5 일 동안 투여했습니다. 매주 순차적으로 엑스레이를 통해 굳은살 형성을 평가했습니다. 쥐를 방사선 학적으로 미리 결정된 시점을 기준으로 희생 시켰고, 골절 캘러스의 발달은 면역 조직 화학을 사용하여 방사선 학적으로 분석되었습니다.

서문

뼈는 뼈 형성 세포, 조골 세포 및 뼈 흡수 세포인 파골 세포로 구성된 조밀한 결합 조직입니다. 골절 치유는 조골 세포와 파골 세포의 조정 된 작용에 의해 뼈 결함을 재생시키는 생리적 과정입니다¹. 골절이있을 때, 골절 부위의 조골 세포 및 파골 세포 활성은 뼈 치유를 결정하는 중요한 요소 중 일부입니다². 골절 치유가 정상적인 과정에서 벗어나면 지연된 결합, 부결합 또는 비유합이 발생합니다. 골절은 9개월 동안 골절의 유합이 실패하고 최근 3개월 동안 수리가 진행되지 않은 경우 비유합 상태라고 합니다³. 모든 골절의 약 10%-15%는 비유합으로 진행될 수 있는 수리 지연을 경험^합니다4. 모든 골절에 대한 비유합률은 5%-10%이며 관련된 뼈와 골절 부위⁵에 따라 다릅니다.

골절 비유합 치료를 위한 현재 요법은 수술 및/또는 의료 양식을 포함합니다. 현재 골절의 지연 또는 비결합은 뼈 이식과 같은 수술 전략으로 극복할 수 있습니다. 그러나 뼈 이식에는 이식 조직의 가용성, 기증자 부위 통증, 이환율 및 감염과 같은 한계와 합병증이 있습니다⁶. 의학적 치료는 뼈 형태 형성 단백질(BMP) 및 테리파라타이드(파라트호르몬 유사체)와 같은 골동화 약물로 구성됩니다. 현재 사용되는 골동화 작용제는 골절 복구를 증가시킬 가능성이 있지만 과도한 비용이나 바람직하지^{않은 부작용과} 같은 제약이 있습니다7. 따라서 뼈 치유를 위한 비용 효율적인 비수술적 대안을 식별할 수 있는 여지가 있습니다. 약물의 뼈 치유 잠재력은 처음에는 시험관 내 연구에 의해 결정될 수 있지만 최종 개념 증명을 위해서는 생체 내 연구가 필요합니다. 뼈 치유를 향상시키는 것으로 알려진 약물은 시험관 내에서 평가되어야하며, 유망한 것으로 밝혀지면 생체 내 동물 모델 연구에 사용할 수 있습니다. 약물이 생체 내 모델에서 골 형성 및 리모델링을 촉진하는 것으로 입증되면 다음 단계 (즉, 임상 시험)로 진행할 수 있습니다.

동물의 골절 치유를 평가하는 것은 인간 실험을 거치기 전에 뼈 치유를 위해 도입 된 새로운 약제를 평가하기위한 논리적 단계입니다. 골절 치유의 생체내 동물 모델 연구를 위해, 설치류는 점점 더 인기 있는 모델⁸이 되었다. 설치류 모델은 낮은 운영 비용, 제한된 공간 필요성 및 뼈 치유에 필요한 시간 감소로 인해 관심이 증가하고 있습니다⁹. 또한 설치류는 광범위한 항체와 유전자 표적을 가지고있어 뼈 치유 및 재생의 분자 메커니즘에 대한 연구를 가능하게합니다¹⁰. 합의 회의는 다양한 작은 동물 뼈 치유 모델을 종합적으로 강조하고 뼈 치유에 영향을 미치는 다양한 매개 변수에 초점을 맞추고 몇 가지 작은 동물 골절 모델 및 임플란트를 강조했습니다¹¹.

기본 파괴 모델은 크게 개방 또는 폐쇄 모델로 나눌 수 있습니다. 폐쇄 골절 모델은 뼈에 3점 또는 4점 굽힘력을 사용하며 기존의 외과적 접근이 필요하지 않습니다. 그들은 인간의 긴 뼈 골절과 유사한 비스듬한 또는 나선형 골절로 이어지지 만, 골절 위치 및 치수의 표준화 부족은¹²에서 교란 요인으로 작용할 수 있습니다. 개방 골절 모델은 뼈의 절골술을 위한 외과적 접근을 필요로 하고, 골절 부위에서 보다 일관된 골절 패턴을 달성하는 데 도움이 되지만, 폐쇄형 모델(¹³)에 비해 지연된 치유와 관련된다. 골절 치유를 연구하는 데 사용되는 뼈의 선택은 주로 크기와 접근성으로 인해 경골과 대퇴골로 남아 있습니다. 골절 부위의 선택은 일반적으로 골간 또는 골단입니다. 골단 영역은 골다공증 환자에서 골절 치유가 연구되는 경우에 특별히 선택되는데, 이는 골다공증이 골다공증¹⁴의 영향을 더 많이 받기 때문입니다. 골수 내 핀 및 외부 고정 장치와 같은 여러 임플란트를 사용하여 골절^(11,15)을 안정화시킬 수 있습니다.

이 연구의 목적은 연구자들이 대퇴골 골절 후 굳은 살의 발달을 이해하는 데 도움이 될뿐만 아니라 잠재적 인 약물이 작용하는 메커니즘을 이해함으로써 뼈 치유 특성을 가지고 있는지 여부를 결정하는 데 도움이 될 수있는 간단하고 따라하기 쉬운 설치류 모델을 개발하는 것이 었습니다.

프로토콜

동물 실험은 인도 뉴델리에 있는 AIIMS(286/IAEC-1/2021)에 있는 기관 동물 윤리 위원회(IAEC)의 윤리적 승인을 받은 후 수행되었습니다.

1. 수술 전 절차

1. 집 수컷 Wistar 흰둥이 쥐 6-8 주령, 무게는 각각 150-200g 사이이며 중앙 동물 시설 (CAF)에서 별도의 개별 케이지에 있습니다. 이것은 여러 쥐가 새장을 공유 할 때 수술 / 골절 부위 부상을 보장하지 않습니다.
2. 상대 습도가 50 % ± 5 % 인 습도가 조절 된 환경에서 쥐를 23 ° C ± 2 ° C의 온도로 유지하고 12 시간의 어둠 / 빛주기에 노출시키고 음식 (표준 반합성 식단) 에 자유롭게 접근 할 수 있도록하십시오 : 펠렛 다이어트 (건조) 및 물. 표준 반합성 식단의 구성은 다음과 같습니다 : 볶은 벵골 그램 가루 (60 %), 밀가루 (22 %), 카제인 (4 %), 탈지유 (5 %), 정제유 (4 %), 전분과의 소금 혼합물 (4.8 %) 및 전분과 비타민 콜린 혼합물 (0.2 %).
3. 수술 전 최소 48 시간 동안 쥐를 순응시킵니다.
4. 디지털 저울로 각 쥐의 무게를 측정하고 무게를 기록하십시오.
5. 수술 시작 15분 전에 쥐에게 세푸록심(100mg/kg 체중), 트라마돌(25mg/kg 체중) 및 케타민(75mg/kg 체중)과 자일라진(10mg/kg 체중)의 조합의 복강(IP) 주사를 투여합니다. 안구 건조증을 예방하기 위해 양쪽 눈에 안과 연고를 바르십시오.
6. 우측하지에서 옆구리에서 무릎 관절까지 머리카락을 제거하고 제모 크림을 국소 적으로 바르십시오.
   참고: 혈액(0.5mL)은 다양한 매개변수의 기준선 분석을 위해 각 쥐의 꼬리 정맥에서 수집할 수 있습니다. 수술 후 2 주마다 혈액을 다시 채취 할 수 있습니다.

2. 개방 절골술을 통한 완전 횡단 골절 수술

참고: 수술대를 갖추고 최적의 주변 온도(26°C)가 있는 지정된 수술실을 사용하여 절차를 수행하십시오.

1. 왁스 블록 (알루미늄 트레이 30cm x 30cm x 4cm, 깊이 2.5cm까지 왁스를 담은 4cm)을 수술대에 놓고 멸균 커튼으로 덮으십시오. 왁스 블록은 수술 중 동물의 위치 변화를 방지합니다.
2. 마취의 시작을 확인하십시오 (발가락 핀치의 손실을 확인하여). 마취 된 쥐를 왼쪽 측면 위치의 멸균 드레이프에 놓습니다. 보조자에게 오른쪽하지(무릎과 엉덩이)를 확장하도록 요청하십시오. 대퇴골을지지하기 위해 오른쪽 다리 아래에 멸균 된 하드 지지대 (대리석 블록)를 유지하십시오. 알코올과 베타 딘으로 수술 부위를 청소하십시오.
3. 절개 부위 (오른쪽 허벅지의 측면)에 국소 마취 (1 % 리그 노 카인 0.25mL)를 주사하고 다른 멸균 드레이프에 구멍을 뚫고 수술을 위해 쥐의 오른쪽 다리 만 노출시킵니다.
4. 오른쪽 허벅지 옆쪽에 수직 1cm 피부 절개를 하고 15번 수술용 칼날로 필요에 따라 확장합니다.
5. Metzenbaum 가위를 사용하여 깊은 근막을 분리하여 광대 한 측면 근육을 노출시킵니다. 대퇴골의 축에 도달 할 때까지 동맥 집게를 사용하여 근육 섬유와 일치하도록 광대 한 외측을 나눕니다.
6. 골막 엘리베이터를 사용하여 뼈에 부착 된 근육에서 뼈를 제거하십시오.
7. 혈관 미주신경 반사를 방지하기 위해 골막 안팎에 국소 마취 (1 % 리그 노 카인 0.2mL)를 주사하십시오.
8. 15번 수술용 칼날을 사용하여 대퇴골 축의 중간 1/3에 움푹 들어간 곳을 만들고, 움푹 들어간 곳에 끌을 놓고(끌이 미끄러지지 않도록) 망치로 끌을 가볍게 두드려 축의 중간 1/3에 있는 뼈를 골절(완전 골절)합니다. 멸균 하드 지지대(대리석 블록)를 사용하여 뼈를 지지하는 동안 뼈를 파쇄하여 깨끗한 파손을 보장합니다.
   알림: 멸균 하드 지지대는 일반적으로 아래 근육에 심각한 부상을 입히지 않습니다.
9. 배터리로 작동되는 파워 드릴을 사용하여 멸균 된 K- 와이어 (1.0mm)를 사용하여 내부적으로 골절을 고정하십시오. K- 와이어를 골절 부위를 통해 원위 조각의 수질 운하로 통과시킵니다. 그런 다음 배터리로 작동되는 전동 드릴을 사용하여 대퇴골의 말단부를 통해 K-와이어를 뚫습니다.
   알림: 사용하기 전에 전동 드릴 표면을 알코올로 소독하십시오. K-와이어를 고정한 후 장갑을 교체하십시오.
10. 골절을 줄인 후, K- 와이어를 말단부에서 근위 조각의 운하로 전진시켜 trochanteric 영역에서 구입할 때까지 전진시킵니다. 와이어 커터를 사용하여 피부를 통해 튀어 나온 K- 와이어의 말단 부분을 잘라냅니다.
11. 플라이어를 사용하여 K-와이어 끝을 약 90°로 구부리고 핀 사이트 드레싱을 위해 베타딘에 적신 거즈 붕대를 사용합니다. K- 와이어는 골절을 감소 된 위치로 유지하기위한 골수 내 부목 역할을합니다.
12. 3-0 나일론 봉합사를 사용하여 피부를 닫기 전에 완전한 지혈을 확인하십시오. 멸균 거즈 또는 동맥 집게를 사용하여 출혈 부위에 압력을 가하여 출혈을 멈추십시오.
13. 베타딘으로 상처를 닦고 멸균 거즈와 미세 기공 접착 테이프로 덮으십시오.

3. 수술 후 관리

1. 쥐를 새장으로 돌려 보내고, 정상적인 보행을 허용하고, 항생제 (주사 세푸 록심 100 mg / kg) 및 진통제 (주사 트라마돌 25 mg / kg / 일)를 희생 할 때까지 표준 반합성 식단을 계속 제공하십시오 시술 후 5 일 동안 복강 내.
   참고: 쥐는 특정 약물을 테스트하기 위해 치료 그룹과 대조군으로 나눌 수 있습니다. 약물이 수용성인 경우 위관영양을 통해 경구 투여할 수 있습니다. 개별 동물의 무게는 사용되는 약물의 투여량을 계산하기 위해 기록될 수 있다. 동물 그룹의 동질성을 보장하기 위해 포함 및 제외 기준을 따를 수 있습니다.
2. 수술 전 기간과 비슷한 조건에서 개별 케이지에 동물을 수용하십시오. 수술 후 통증, 상처 감염, 봉합사 미끄러짐, 복부 부종이나 불편함의 징후를 찾기 위해 매일 수술 부위를 검사하십시오.
3. 일주일에 한 번 골절 부위의 X- 레이로 뼈 치유를 평가하십시오.

4. 방사선 절차

1. X- 레이 전에 케타민 (50mg / kg 체중)과 자일 라진 (5mg / kg 체중)을 복강 주사하여 쥐를 마취시킵니다.
2. 쥐의 고관절을 구부리고 외전 된 자세로 유지하면서 무릎 관절은 다음과 같은 노출 설정으로 골절 된 사지의 X- 레이를 촬영하기 위해 반 구부러진 상태로 유지합니다 : 참조 kVp ≈ 62; 참조 mAS = 6.4; 및 자동 노출 설정(참조 mA=160).
   참고: X-레이는 기준선(수술 후 1일)에 촬영한 다음 희생될 때까지 또는 5주까지 매주 한 번 촬영했습니다.

5. 동물 안락사 및 굳은 살 회수

1. 부드럽고 단단한 브리징 굳은 살의 방사선 학적 외관에 따라 이전에 결정된 두 시점에서 이산화탄소 과다 복용 (1 분 동안 7-8 L / min의 유속으로 100 % CO₂ 투여, 4-5 분의 대기 기간)으로 쥐를 희생하십시오.
2. 대퇴골과 평행하게 피부를 절개하고 굳은 살이 살의 손상을 피하기 위해 위에 놓인 근육을 조심스럽게 분리하십시오.
3. 망치와 끌을 사용하여 고관절과 굳은 살 조직 사이의 뼈를 골절시킵니다. 마찬가지로 굳은 살과 무릎 관절 사이의 뼈를 골절시킵니다. K-와이어를 제거하고 뼈 조각을 식염수로 청소하여 혈전과 연조직을 제거합니다.
4. 캘러스를 즉시 10% 중성 완충 포르말린(샘플당 20mL)이 포함된 라벨이 부착된 용기에 옮기고 실온(RT)에서 3일 동안 보관합니다.

6. 뼈와 굳은 살 조직의 석회질 제거

1. 포르말린에서 캘러스 조직을 채취하여 뼈 조직의 석회질 제거를 위해 20 % ETDA 용액 (pH 7)에서 RT로 유지하십시오.
2. 약 3주 동안 2일마다 신선한 EDTA 용액을 교체하고 캘러스 조직을 방해하지 않고 바늘로 뼈를 찔러 뼈 석회질 제거를 확인합니다. 최적의 석회 제거는 뼈 조직의 정상적인 거친 감각의 상실로 표시됩니다.
3. 석회 제거가 완료되면 캘러스의 시상 부분을 자르고 캘러스 조직의 파라핀 블록을 준비하십시오. 조직 병리학^{적 16} 및 다른 비교 분석¹⁷을 위해 캘러스 조직의 4 μm 두께 섹션을 절단합니다.

결과

이 연구는 Wistar 알비노 쥐에서 대퇴골 절골술 모델을 개발하기 위해 수행되었습니다. 이 모델은 뼈 치유뿐만 아니라 뼈 치유에서 유망한 골동화 작용의 골 형성 효과를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 표준 수술 예방 조치와 프로토콜을 따랐습니다. 멸균 가운, 커튼 및 수술 장비가 절차에 사용되었습니다(그림 1). 장비(표 1)는 수술 48시간 전에 멸균하였다. 마?...

토론

이 방법은 Wistar 알비노 쥐에서 골절 절골술 모델을 개발하는 데 필요한 세부 사항을 명쾌하게 설명합니다. 이 모델은 골절 치유에서 유망한 골동화 작용 약물의 골 형성 효과를 평가하고 뼈 치유의 복잡성을 이해하는 데 사용할 수 있습니다. 이 방법의 두드러진 특징은 간단하고 너무 많은 시간이나 정교한 장비가 필요하지 않다는 것입니다. 이 방법에서는 성체 수컷 Wistar 알비노 랫트를 실험을 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2