开发Wistar白化大鼠股骨截骨模型的协议

摘要

在这里，我们提出了一种医源性骨折Wistar白化大鼠股骨干并跟进愈伤组织发展的协议。这种股骨截骨模型可以帮助研究人员评估骨折愈合的过程，并研究药物如何影响骨折愈合。

摘要

骨折愈合是通过成骨细胞和破骨细胞的协调作用导致骨缺损再生的生理过程。骨合成代谢药物有可能增强骨折的修复，但具有高成本或不良副作用等限制。药物的骨愈合潜力最初可以通过 体外 研究来确定 ，但最终 的概念验证需要体内研究。我们的目标是开发一种股骨截骨啮齿动物模型，该模型可以帮助研究人员了解股骨干骨折后愈伤组织形成的发展，并有助于确定潜在的药物是否具有骨愈合特性。成年雄性Wistar白化大鼠在机构动物伦理委员会批准后使用。对啮齿动物进行麻醉，在无菌条件下，使用开放截骨术在股骨干中部三分之一处产生完全横向骨折。骨折复位并使用髓内K线进行内部固定，并允许进行继发性骨折愈合。术后给予腹膜内镇痛药和抗生素5 d。每周连续 X 线检查评估愈伤组织形成情况。根据放射学预先确定的时间点处死大鼠，放射学和免疫组织化学分析骨折愈伤组织的发展。

引言

骨是一种致密的结缔组织，由成骨细胞、成骨细胞和骨吸收细胞（破骨细胞）组成。骨折愈合是通过成骨细胞和破骨细胞的协调作用导致骨缺损再生的生理过程¹.当发生骨折时，骨折部位的成骨细胞和破骨细胞活动是决定骨愈合的一些重要因素²。当骨折愈合偏离其正常病程时，会导致愈合延迟、畸形愈合或不愈合。当骨折愈合失败 9 个月，最近 3 个月内没有修复进展时，称为骨折不愈合³.大约 10%-15% 的骨折修复延迟，可能进展为不愈合⁴。所有骨折的不愈合率为 5%-10%，并且因受累骨骼和骨折部位而异⁵.

目前治疗骨折不愈合的方案包括手术和/或药物方式。目前，骨折延迟或不愈合可以通过骨移植等手术策略来克服。然而，骨移植有其局限性和并发症，如移植组织的可用性、供体部位疼痛、发病率和感染⁶。药物治疗包括骨合成代谢药物，如骨形态发生蛋白（BMP）和特立帕肽（副激素类似物）。目前使用的骨合成代谢药物有可能增强骨折的修复，但具有诸如高昂的成本或^{不良副作用等}限制7。因此，有确定具有成本效益的非手术骨愈合替代方案的空间。药物的骨愈合潜力最初可以通过 体外 研究来确定 ，但最终 的概念验证需要体内研究。已知可增强骨愈合的药物应在 体外 进行评估，如果发现有希望，可用于 体内 动物模型研究。如果药物在 体内 模型中被证明可以促进骨形成和重塑，则可以进入下一阶段（即临床试验）。

评估动物的骨折愈合是评估在进行人体试验之前引入骨愈合的新型药物的合乎逻辑的一步。对于骨折愈合的 体内 动物模型研究，啮齿动物已成为越来越流行的模型⁸。由于运营成本低，对空间的需求有限，^{骨骼愈合所需的时间}更少，啮齿动物模型引起了越来越多的兴趣9。此外，啮齿动物具有广泛的抗体和基因靶标，可以研究骨愈合和再生的分子机制¹⁰。共识会议全面强调了各种小动物骨骼愈合模型，重点关注影响骨骼愈合的不同参数，并强调了几种小动物骨折模型和植入物¹¹。

基本裂缝模型大致可分为开放模型或封闭模型。闭合性骨折模型在骨骼上使用三点或四点弯曲力，不需要传统的手术方法。它们导致斜骨折或螺旋骨折，类似于人类的长骨折，但骨折位置和尺寸缺乏标准化可能是其中的混杂因素¹²。开放性骨折模型需要手术通路才能进行骨切开术，有助于在骨折部位实现更一致的骨折模式，但与闭合模型相比，与愈合延迟有关¹³。用于研究骨折愈合的骨骼选择主要仍然是胫骨和股骨，因为它们的尺寸和可及性。骨折部位的选择通常是骨干或干骺端。在骨质疏松症受试者研究中研究骨折愈合的情况下，专门选择干骺端区域，因为干骺端受骨质疏松症的影响更大¹⁴.可以使用髓内销和外固定器等几种植入物来稳定骨折^11，15。

这项研究的目的是开发一种简单易懂的啮齿动物模型，该模型不仅可以帮助研究人员了解股骨骨折后愈伤组织的发展，还可以通过了解其作用机制来帮助确定潜在药物是否具有骨愈合特性。

研究方案

动物实验是在获得印度新德里AIIMS机构动物伦理委员会（IAEC）的伦理批准后进行的（286/IAEC-1/2021）。

1.术前程序

1. 家养雄性Wistar白化大鼠6-8周龄，每只体重在150-200克之间，在中央动物设施（CAF）的单独笼子里。这确保了当多只大鼠共用笼子时不会造成手术/骨折部位损伤。
2. 将大鼠保持在相对湿度为50%±5%的湿度控制环境中的温度为23°C±2°C，将它们暴露于12小时的暗/光循环中， 并随意获得 食物（标准半合成饮食）:颗粒饮食（干）和水。标准半合成饮食的组成如下:烤孟加拉克面粉（60%），小麦粉（22%），酪蛋白（4%），脱脂奶粉（5%），精炼油（4%），淀粉盐混合物（4.8%）和维生素胆碱与淀粉混合物（0.2%）。
3. 在手术前使大鼠适应至少48小时。
4. 在数字秤上称量每只大鼠并记下重量。
5. 在开始外科手术前15分钟向大鼠腹膜内（IP）注射头孢呋辛（100mg / kg体重），曲马多（25mg / kg体重）和氯胺酮（75mg / kg体重）与甲苯噻嗪（10mg / kg体重）的组合。在双眼上涂抹眼药膏以防止干眼症。
6. 从右下肢，从侧腹区域到膝关节去除毛发，局部应用脱毛膏。
   注意:可以从每只大鼠的尾静脉收集血液（0.5mL），用于不同参数的基线分析。手术后每2周可以再次采集血液。

2. 通过开放截骨术造成完全横断的外科手术

注意:使用带有手术台和最佳环境温度（26°C）的指定手术室来执行该程序。

1. 将蜡块（铝托盘30厘米x 30厘米x 4厘米，含蜡，深度可达2.5厘米）放在手术台上，并用无菌窗帘覆盖。蜡块可防止动物在手术过程中位置的任何变化。
2. 确认麻醉的开始（通过检查脚趾捏的损失）。将麻醉的大鼠放在左侧位置的无菌窗帘上。请助手伸展右下肢（膝盖和臀部）。在右腿下方保留无菌硬支撑物（大理石块）以支撑股骨。用酒精和甜菜碱清洁手术部位。
3. 在切口部位（右大腿外侧）注射局部麻醉（0.25mL 1%利多卡因），在另一个无菌窗帘上切一个洞，并通过它仅暴露大鼠的右腿进行手术。
4. 在右大腿外侧开一个 1 cm 的垂直皮肤切口，并根据需要用 15 号手术刀片将其延伸。
5. 通过使用梅岑鲍姆剪刀分离深筋膜来暴露股外侧肌。使用动脉钳将股外侧肌与肌纤维对齐，直到到达股骨干。
6. 使用骨膜升降机将骨骼从附着在其上的肌肉中解放出来。
7. 在骨膜内和周围注射局部麻醉（0.2 mL 1% 利多卡因），以防止血管迷走神经反射。
8. 使用15号手术刀片在股骨干的中间三分之一处创建一个凹痕，并通过在压痕上放置凿子（使凿子不会滑动）并用锤子轻轻敲击凿子来骨折（完全骨折）。使用无菌硬支撑（大理石块）支撑骨头，同时将其压裂以确保干净断裂。
   注意:无菌硬支撑通常不会对下面的肌肉造成重大伤害。
9. 在电池供电的电钻的帮助下，使用无菌 K 线 （1.0 mm） 在内部固定骨折。将 K 线通过骨折部位进入远端碎片的髓管。然后，使用电池供电的电钻将 K 线钻出股骨远端。
   注意:使用前用酒精对电钻表面进行消毒。固定K线后更换手套。
10. 复位骨折后，将 K 线从远端推进到近端碎片的管中，直到在转子区域获得购买。使用线切割器切断穿过皮肤的 K 线的远端部分。
11. 使用钳子将K线的尖端弯曲约90°，并使用浸有甜菜碱的纱布绷带进行针位敷料。K线充当髓内夹板，使骨折保持在缩小的位置。
12. 在使用3-0尼龙缝合线闭合皮肤之前确保完全止血。使用无菌纱布或动脉钳对出血区域施加压力以止血。
13. 用甜菜碱清洁伤口，并用无菌纱布和微孔胶带覆盖。

3. 术后护理

1. 将大鼠放回笼子，允许正常行走，并继续给予标准的半合成饮食，直到牺牲它们，以及抗生素（注射头孢呋辛100mg / kg）和镇痛药（注射曲马多25mg / kg /天，分两次剂量）腹膜内手术后5天。
   注意:大鼠可以分为治疗组和对照组以测试特定药物。如果药物是水溶性的，可以通过管饲法口服。可以注意到个体动物的重量以计算要使用的药物的剂量。可以遵循纳入和排除标准，以确保动物群体的同质性。
2. 将动物饲养在与术前相似的条件下的单独笼子中。每天检查手术部位，寻找术后疼痛、伤口感染、缝合线滑移或任何腹部肿胀或不适的任何迹象。
3. 每周一次通过骨折部位的 X 线检查评估骨愈合情况。

4. 放射程序

1. 在X射线之前，用腹膜内注射氯胺酮（50mg / kg体重）和甲苯噻嗪（5mg / kg体重）麻醉大鼠。
2. 将大鼠的髋关节保持在弯曲和外展的位置，同时保持膝关节半弯曲，以使用以下暴露设置拍摄骨折肢体的 X 射线:参考 kVp ≈ 62;参考 mAS = 6.4;和自动曝光设置（参考 mA=160）。
   注意:X射线在基线（手术后1天）拍摄，然后每周一次，直到处死或5周。

5. 动物安乐死和愈伤组织回收

1. 通过过量的二氧化碳（以7-8L / min的流速施用100%CO₂₁ 分钟，然后等待4-5分钟）在两个先前确定的时间点处死大鼠，分别基于软桥和硬桥老茧的放射学外观。
2. 切开平行于股骨的皮肤，并小心地分离上覆的肌肉，以避免损伤愈伤组织。
3. 用锤子和凿子骨折髋关节和愈伤组织之间的骨头。同样，使骨痂和膝关节之间的骨骨折。取下K线并用盐水清洁骨片以去除血凝块和软组织。
4. 立即将愈伤组织转移到带有 10% 中性缓冲福尔马林（每个样品 20 mL）的标记容器中，并在室温 （RT） 下保存 3 天。

6.骨和愈伤组织脱钙化

1. 从福尔马林中取出愈伤组织，并将其保持在室温下，置于20%ETDA溶液（pH 7）中，用于骨组织脱钙。
2. 每 2 天更换一次新鲜的 EDTA 溶液，持续约 3 周，并在不干扰愈伤组织的情况下用针戳骨检查骨脱钙。最佳脱钙表示为骨组织的正常砂砾感的丧失。
3. 完全脱钙后，切开愈伤组织的矢状面部分并准备愈伤组织的石蜡块。切割4μm厚的愈伤组织切片，用于组织病理学¹⁶ 和任何其他比较分析¹⁷。

结果

本研究旨在开发Wistar白化大鼠的股骨截骨模型。该模型可用于评估骨愈合，以及有前途的骨合成代谢药物在骨愈合中的成骨作用。遵循标准的手术预防措施和方案。手术使用了无菌长袍，窗帘和手术设备（图1）。设备（表1）在手术前48小时灭菌。按照协议使用麻醉剂，镇痛剂和抗生素，以确保动物始终保持无疼痛和感染。可以从每只大鼠的尾静脉收集血液（0.5m...

讨论

该方法清晰地描述了在Wistar白化大鼠中开发骨折截骨模型所需的细节。该模型可用于评估有前途的骨合成代谢药物在骨折愈合中的成骨作用，以及了解骨愈合的复杂性。这种方法的显着特点是简单，不需要太多时间或复杂的设备。该方法选取成年雄性白化大鼠作为实验的啮齿动物模型。选择统一的性别以消除与性激素相关的骨骼愈合的任何混杂因素。

这项研究遵循开放截骨?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2