Протокол разработки модели остеотомии бедренной кости у крыс-альбиносов Wistar

Резюме

Здесь мы представляем протокол для ятрогенного перелома ствола бедренной кости крыс-альбиносов Wistar и наблюдения за развитием мозоли. Эта модель остеотомии бедренной кости может помочь исследователям оценить процесс заживления переломов и изучить, как препарат может повлиять на заживление переломов.

Аннотация

Заживление переломов – это физиологический процесс, приводящий к регенерации костных дефектов скоординированным действием остеобластов и остеокластов. Остеоанаболические препараты могут увеличить восстановление переломов, но имеют ограничения, такие как высокая стоимость или нежелательные побочные эффекты. Потенциал заживления костей препарата может быть первоначально определен исследованиями in vitro , но для окончательного доказательства концепции необходимы исследования in vivo . Наша цель состояла в том, чтобы разработать модель остеотомии бедренной кости грызунов, которая могла бы помочь исследователям понять развитие образования мозоли после перелома ствола бедренной кости и которая могла бы помочь установить, обладает ли потенциальный препарат свойствами заживления костей. Взрослые самцы крыс-альбиносов Wistar были использованы после разрешения Институционального комитета по этике животных. Грызунов обезболивали, а в асептических условиях создавались полные поперечные переломы на средней трети стволов бедренных костей с помощью открытой остеотомии. Переломы были уменьшены и внутренне зафиксированы с помощью интрамедуллярных K-проводов, и было разрешено вторичное заживление переломов. После операции в течение 5 дней давали внутрибрюшинные анальгетики и антибиотики. Последовательные еженедельные рентгеновские снимки оценивали образование мозоли. Крыс приносили в жертву на основе радиологически заранее определенных временных точек, а развитие перелома мозоли анализировали рентгенологически и с помощью иммуногистохимии.

Введение

Кость представляет собой плотную соединительную ткань, состоящую из костеобразующих клеток, остеобластов и костно-резорбирующих клеток, остеокластов. Заживление переломов – это физиологический процесс, приводящий к регенерации костных дефектов скоординированным действием остеобластов и остеокластов¹. Когда есть перелом, остеобластная и остеокластическая активность в месте перелома являются одними из важных факторов, которые определяют заживление кости². Когда заживление перелома отклоняется от своего нормального течения, это приводит к задержке союза, неправильному объединению или непрофсоюзированию. Говорят, что перелом находится в непрофсоюзном состоянии, когда происходит неудача соединения перелома в течение 9 месяцев, без прогрессирования восстановления в течение последних 3 месяцев³. Примерно 10%-15% всех переломов испытывают задержку в восстановлении, которая может прогрессировать до несоединения⁴. Коэффициент несращения для всех переломов составляет 5%-10% и варьируется в зависимости от вовлеченной кости и места перелома⁵.

Нынешняя схема лечения несращения переломов включает хирургические и/или медицинские методы. В настоящее время отсроченные или несращенные переломы могут быть преодолены хирургическими стратегиями, такими как пересадка кости. Тем не менее, костная трансплантация имеет свои ограничения и осложнения, такие как доступность ткани трансплантата, боль в донорском участке, заболеваемость и инфекция⁶. Медицинское лечение включает остеоанаболические препараты, такие как костный морфогенетический белок (BMP) и терипаратид (аналог паратормона). Используемые в настоящее время остеоанаболические агенты обладают потенциалом для увеличения восстановления переломов, но имеют ограничения, такие как непомерные затраты или нежелательные побочные эффекты⁷. Таким образом, существуют возможности для выявления экономически эффективных, нехирургических альтернатив заживлению костей. Потенциал заживления костей препарата может быть первоначально определен исследованиями in vitro , но для окончательного доказательства концепции необходимы исследования in vivo . Препарат, который, как известно, улучшает заживление костей, должен оцениваться in vitro и, если он будет признан многообещающим, может быть использован для исследований in vivo на животных. Если окажется, что препарат способствует формированию и ремоделированию костей в модели in vivo , он может перейти к следующему этапу (т. Е. Клиническим испытаниям).

Оценка заживления переломов у животных является логическим шагом вперед для оценки нового агента, введенного для заживления костей, прежде чем он пройдет испытания на людях. Для исследований заживления переломов in vivo на животных грызуны становятся все более популярной моделью⁸. Модели грызунов вызвали растущий интерес из-за низких эксплуатационных расходов, ограниченной потребности в пространстве и меньшего времени, необходимого для заживления костей⁹. Кроме того, грызуны обладают широким спектром антител и генных мишеней, что позволяет проводить исследования молекулярных механизмов заживления и регенерации костей¹⁰. Консенсусное совещание всесторонне выделило различные модели заживления костей мелких животных и сосредоточилось на различных параметрах, влияющих на заживление костей, а также на нескольких моделях переломов мелких животных и имплантатах¹¹.

Базовые модели переломов можно в широком смысле разделить на открытые или закрытые модели. Модели закрытых переломов используют трех- или четырехточечную изгибающую силу на кости и не требуют обычного хирургического подхода. Они приводят к косым или спиральным переломам, напоминающим у человека переломы длинных костей, но отсутствие стандартизации расположения и размеров переломов может выступать в качестве сбивающего с толку фактора в них¹². Открытые модели переломов требуют хирургического доступа для остеотомии кости, помогают достичь более последовательной картины перелома в месте перелома, но связаны с задержкой заживления по сравнению с закрытыми моделями¹³. Выбор кости, используемой для изучения заживления переломов, в основном остается большеберцовая и бедренная кости из-за их размеров и доступности. Выбор места перелома обычно является диафизом или метафизом. Метафизарная область специально выбирается в тех случаях, когда заживление переломов изучается у остеопоротических субъектов, так как метафиз больше подвержен влиянию остеопороза¹⁴. Несколько имплантатов, таких как интрамедуллярные штифты и внешние фиксаторы, могут быть использованы для стабилизации перелома^11,15.

Цель этого исследования состояла в том, чтобы разработать простую и легкую в использовании модель грызунов, которая могла бы помочь исследователям не только понять развитие мозоли после перелома бедренной кости, но и помочь определить, обладает ли потенциальный препарат свойствами заживления костей, понимая механизм, с помощью которого он действует.

протокол

Эксперименты на животных были проведены после получения этического одобрения от Институционального комитета по этике животных (IAEC), AIIMS, Нью-Дели, Индия (286/IAEC-1/2021).

1. Предоперационная процедура

1. Домашний самец крыс-альбиносов Wistar в возрасте 6-8 недель, весом от 150 до 200 г каждый, в Центральном животноводческом учреждении (CAF) в отдельных индивидуальных клетках. Это гарантирует отсутствие хирургической травмы / травмы места перелома, когда несколько крыс делят клетки.
2. Держите крыс при температуре 23 ° C ± 2 ° C в среде с контролируемой влажностью с относительной влажностью 50% ± 5%, подвергайте их 12-часовому циклу темноты / света и дайте ad libitum доступ к пище (стандартная полусинтетическая диета): пеллетная диета (сухая) и вода. Состав стандартной полусинтетической диеты следующий: жареная бенгальская граммовая мука (60%), пшеничная мука (22%), казеин (4%), сухое обезжиренное молоко (5%), рафинированное масло (4%), соляная смесь с крахмалом (4,8%), витаминно-холиновая смесь с крахмалом (0,2%).
3. Акклиматизируйте крыс в течение не менее 48 ч до операции.
4. Взвесьте каждую крысу на цифровых весах и запишите вес.
5. Вводят внутрибрюшинные (IP) инъекции цефуроксима (100 мг/кг массы тела), трамадола (25 мг/кг массы тела) и комбинации кетамина (75 мг/кг массы тела) с ксилазином (10 мг/кг массы тела) крысам за 15 мин до начала хирургической процедуры. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить сухость глаз.
6. Удалите волосы с правой нижней конечности, от области бока до коленного сустава, с местным нанесением крема для удаления волос.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Кровь (0,5 мл) может быть собрана из хвостовой вены каждой крысы для базового анализа различных параметров. Кровь можно собирать снова каждые 2 недели после операции.

2. Хирургическая процедура создания полного поперечного перелома путем открытой остеотомии

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте специально отведенное операционное с операционным столом и оптимальной температурой окружающей среды (26 °C) для выполнения процедуры.

1. Поместите восковой блок (алюминиевый лоток 30 см х 30 см х 4 см, содержащий воск на глубину до 2,5 см) на операционный стол и накройте его стерильными шторами. Восковой блок предотвращает любое изменение положения животного во время операции.
2. Подтвердите начало анестезии (проверив потерю защемления пальцев ног). Поместите анестезированную крысу на стерильную драпировку в левом боковом положении. Попросите помощника держать правую нижнюю конечность (колено и бедро) в разгибании. Держите стерильную жесткую опору (мраморный блок) под правой ногой, чтобы поддерживать бедренную кость. Очистите место операции спиртом и бетадином.
3. Вводят местную анестезию (0,25 мл 1% лигнокаина) в место разреза (боковой аспект правого бедра), вырезают отверстие в другой стерильной драпировке и подвергают через нее только правую ногу крысы для операции.
4. Сделайте вертикальный разрез кожи 1 см на боковой стороне правого бедра и вытяните его по мере необходимости хирургическим лезвием No 15.
5. Обнажите мышцу vastus lateralis, отделив глубокую фасцию с помощью ножниц Метценбаума. Расщепление vastus lateralis в соответствии с мышечными волокнами с помощью щипцов артерий до тех пор, пока не будет достигнут стержень бедренной кости.
6. Освободите кость от прикрепленных к ней мышц с помощью периостального лифта.
7. Вводят местную анестезию (0,2 мл 1% лигнокаина) в надкостницу и вокруг нее для предотвращения вазовагального рефлекса.
8. Создайте углубление в средней трети стержня бедренной кости с помощью хирургического лезвия No 15 и переломите кость в средней трети вала (полный перелом), поместив зубило на сделанный углубление (чтобы зубило не соскользнуло) и аккуратно постукивая молотком по зубилу. Используйте стерильную жесткую опору (мраморный блок) для поддержки кости при ее разрыве, чтобы обеспечить чистый разрыв.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Стерильная жесткая опора обычно не вызывает значительной травмы мышц под ней.
9. Внутренне зафиксируйте перелом с помощью стерильной K-проволоки (1,0 мм), проводимой с помощью силовой дрели с батарейным питанием. Пропустите К-проволоку в медуллярный канал дистального фрагмента через место перелома. Затем просверлите K-провод через дистальный конец бедренной кости с помощью силовой дрели с батарейным питанием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Продезинфицируйте поверхность силовой дрели спиртом перед использованием. Смените перчатки после фиксации K-wire.
10. После уменьшения перелома продвигают К-проволоку от дистального конца в канал проксимального фрагмента до тех пор, пока она не приобретется в трохантерической области. Отрежьте дистальную часть К-проволоки, выступающую через кожу, с помощью проволочного резака.
11. Согните кончик K-проволоки примерно до 90° с помощью плоскогубцев и используйте марлевую повязку, пропитанную бетадином, для повязки на месте штифта. К-проволока действует как интрамедуллярная шина для удержания перелома в уменьшенном положении.
12. Обеспечьте полный гемостаз перед закрытием кожи с помощью нейлонового шва 3-0. Надавите на область кровотечения, используя стерильную марлю или щипцы артерий, чтобы остановить любое кровотечение.
13. Очистите рану бетадином, и накройте ее стерильной марлей и микропористой скотчем.

3. Послеоперационный уход

1. Верните крыс в клетки, допустите нормальную амбулацию и продолжайте давать стандартную полусинтетическую диету до тех пор, пока не принесут их в жертву, а также антибиотики (инъекция цефуроксима 100 мг/кг) и анальгетики (инъекция трамадола 25 мг/кг/сут в двух разделенных дозах) внутрибрюшинно в течение 5 дней после процедуры.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крыс можно разделить на лечебные и контрольные группы для тестирования конкретного препарата. Если препарат водорастворим, его можно вводить перорально через гиваж. Вес отдельных животных может быть отмечен для расчета дозы препарата, который будет использоваться. Критерии включения и исключения могут соблюдаться для обеспечения однородности групп животных.
2. Размещайте животных в отдельных клетках в условиях, аналогичных предоперационному периоду. Осматривайте место операции каждый день, чтобы найти любые признаки послеоперационной боли, раневой инфекции, скольжения швов или любого вздутия живота или дискомфорта.
3. Оцените заживление костей с помощью рентгеновского снимка места перелома один раз в неделю.

4. Рентгенологическая процедура

1. Перед рентгеном обезболивают крыс внутрибрюшинной инъекцией кетамина (50 мг/кг массы тела) и ксилазина (5 мг/кг массы тела).
2. Держите тазобедренный сустав крысы в согнутом и похищенном положении, в то время как коленный сустав держится полусогнутым, чтобы сделать рентгеновский снимок сломанной конечности со следующими настройками воздействия: Ref. kVp ≈ 62; Ссылка mAS = 6,4; и автоматические настройки экспозиции (Ref. mA=160).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рентгеновские снимки были сделаны на исходном уровне (через 1 день после операции), а затем один раз в неделю до жертвоприношения или 5 недель.

5. Эвтаназия животных и извлечение мозоли

1. Жертвуют крыс передозировкой углекислого газа (вводят 100%_СО2 со скоростью потока 7-8 л/мин в течение 1 мин с последующим периодом ожидания 4-5 мин), в двух заранее определенных временных точках, исходя из рентгенологического вида мягких и жестких мостовых мозолей соответственно.
2. Разрезайте кожу параллельно бедренной кости и тщательно отделите вышележащие мышцы, чтобы избежать повреждения ткани мозоли.
3. Перелом кости между тазобедренным суставом и мозолью с помощью молотка и зубила. Аналогично перелом кости между мозолью и коленным суставом. Удалите K-проволоку и очистите кусок кости в физиологическом растворе, чтобы удалить сгустки крови и мягкие ткани.
4. Немедленно переложите мозоль в маркированный контейнер с 10% нейтральным буферизованным формалином (20 мл на образец) и храните его в течение 3 дней при комнатной температуре (RT).

6. Декальцинация костной и мозолистой ткани

1. Возьмите мозолистую ткань из формалина и держите ее на RT в 20% растворе ETDA, рН 7, для декальцинации костной ткани.
2. Меняйте свежий раствор ЭДТА каждые 2 дня в течение примерно 3 недель и проверяйте декальцификацию кости, тыкая кость иглой, не нарушая ткань мозоли. Оптимальное декальцинирование обозначается потерей нормального зернистого ощущения костной ткани.
3. После полной декальцификации отрежьте сагиттальный участок мозоли и подготовьте парафиновые блоки ткани мозоли. Отрезают участки мозолистой ткани толщиной 4 мкм для гистопатологического¹⁶ и любого другого сравнительного анализа¹⁷.

Результаты

Это исследование было предпринято для разработки модели остеотомии бедренной кости у крыс-альбиносов Wistar. Эта модель может быть использована для оценки заживления костей, а также остеогенного эффекта перспективного остеоанаболического препарата в заживлении костей. Соблюдались ста?...

Обсуждение

Этот метод ясно описывает детали, необходимые для разработки модели остеотомии переломов у крыс-альбиносов Wistar. Эта модель может быть использована для оценки остеогенного эффекта перспективного остеоанаболического препарата в заживлении переломов, а также для понимания тонкостей за...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alcohol	Raman & Weil Pvt. Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	MFG/MD/2019/000189	Sterillium hand disinfectant
Artery forceps	Nebula surgical, Gujarat, India	G.105.05S	5", straight
Bard-Parker handle	Nebula surgical, Gujarat, India	G.103.03	Size number 3
Betadine solution	Win-medicare New Delhi, India	UP14250000001	10% w/v Povidone iodine solution
Cat's-paw skin retractor	Nebula surgical, Gujarat, India	908.S	Small
EDTA	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	43272	Disodium salt
Eosin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	115935	For preparing the staining solution
Forceps (plain)	Nebula surgical, Gujarat, India	115.06	6", plain
Forceps (toothed)	Nebula surgical, Gujarat, India	117.06	6", toothed
Formaldehyde	Sisco research laboratories Pvt. Ltd, Maharashtra, India	84439	For preparing the neutral buffered formalin
Haematoxylin	Sigma Aldrich, Merck Life Sciences Pvt Ltd, Mumbai, Maharashtra, India	104302	For preparing the staining solution
Hammer	Nebula surgical, Gujarat, India	401.M
Injection Cefuroxime	Akumentis Healthcare Ltd, Thane, Maharashtra, India	48/UA/SC/P-2013	Cefuroxime sodium IP, 1.5 g/vial
Injection Ketamine	Baxter Pharmaceuticals India Private Limited, Gujarat, India	G/28-B/6	Ketamine hydrochloride IP, 50 mg/mL
Injection Xylazine	Indian Immunologicals Limited, Hyderabad, Telangana, India	28/RR/AP/2009/F/G	Xylazine hydrochloride USP, 20 mg/mL
Injection Lignocaine	Jackson laboratories Pvt Limited, Punjab, India	1308-B	2% Lignocaine Hydrochloride IP, 21.3 mg/mL
Injection Tramadol	Intas Pharmaceuticals Limited, Ahmedabad, Gujarat, India	MB/07/500	Tramadol hydrochloride IP, 50 mg/mL
K-wire	Nebula surgical, Gujarat, India	166 (1mm)	12", double ended
Mechanical drill for inserting K-wire	‎Bosch, Germany	06019F70K4	GSR 120-LI Professional
Metzenbaum cutting scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.121.06S	6", straight
Needle holder	Nebula surgical, Gujarat, India	G.108.06	6", straight
Ophthalmic ointment	GlaxoSmithKline Pharmaceutical Limited, Bengaluru, Karnataka, India	KTK/28a/467/2001	Neomycin, Polymixin B sulfate and Bacitracin zinc ophthalmic ointment USP
Osteotome (chisel)	Nebula surgical, Gujarat, India	1001.S.10	10 mm, straight
Periosteal elevator	Nebula surgical, Gujarat, India	918.10.S	10 mm, straight
Pliers cum wire cutter	Nebula surgical, Gujarat, India	604.65
Reynold’s scissors	Nebula surgical, Gujarat, India	G.110.06S	6", straight
Standard semi-synthetic diet	Ashirvad Industries, Chandigarh, India	No catalog number available	Detailed composition provided in materials used
Steel cup for keeping betadine for application	Local purchase	No catalog number available
Steel tray with lid for autoclaving instruments	Local purchase	No catalog number available
Sterile gauze	Ideal Healthcare Industries, Delhi, India	E(0047)/14/MNB/7951	Sterile, 5cmx5cm, 12 ply
Sterile marble block for support	Local purchase	No catalog number available	Locally fabricated; autoclavable
Syringe and needle (1 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 303060	1 mL sterile Syringe with 26 G x 1/2 (0.45 mm x 13 mm) needle
Syringe and needle (2 mL)	Becton Dickinson India Pvt. Ltd., Haryana, India	REF 307749	2 mL sterile syringe with 24 G x 1'' (0.55 mm x 25 mm) needle
Syringe and needle (10 mL)	Hindustan Syringes & Medical Devices Ltd. Faridabad, India	334-B(H)	10 mL sterile syringe with 21 G x1.5" (0.80 mm x 38 mm) needle
Surgical blades (size no.15)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15115E	Sterile, Single use
Surgical blades (size no.24)	Paramount Surgimed Ltd, New Delhi, India for Medline Industries Inc, IL, USA	REF MDS15124E	Sterile, Single use
Sutures	Healthium Medtech Pvt Ltd, Bangalore, Karnataka, India	SN 3318	4-0, 16 mm, 3/8 circle cutting needle, monofilament polyamide suture
Wax block in aluminium tray	Locally fabricated	No catalog number available	30 cm x 30 cm x 4 cm aluminium tray containing wax (to prevent animal from slipping)
X-ray machine	Philips India Ltd, Gurugram, Haryana	SN19861013	Model: Philips Digital Diagnost R 4.2